专利名称：用作佐剂的集合素的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含集合素(collectin)和免疫原性决定簇的疫苗组合物。进一步地，本发明涉及用所述组合物免疫个体的方法，还涉及集合素在制备疫苗组合物中的用途。
背景技术：
动物为抗御感染产生了不同的，复杂的应对策略。免疫应答可主要分为获得性免疫应答(adaptive immune response)和固有免疫应答(innate immuneresponse)。获得性免疫应答是其中发生了适应且细胞起主要作用的免疫应答；固有免疫应答是即时便可获得的免疫应答，且主要是基于体液中存在的分子。固有免疫系统在出生时即可起作用，而获得性免疫应答到幼年时期才能获得其保护机体的完整能力(Janeway等，1999)。
细菌在粘膜表面或通过破损的皮肤进入机体后，迅速被集合素识别，所述集合素是一个可溶性蛋白家族，识别微生物表面存在而在多细胞生物的细胞上不存在的特征性糖构型。因此，集合素属于固有免疫系统中庞大多样的模式识别受体群。在人类，三种集合素是已知的，但还存在其它的母牛例如还有更多。集合素靶向它们将与之结合的颗粒以使吞噬细胞摄取该颗粒或使补体级联反应活化，从而，通过这些途径介导所述颗粒的破坏。
所有集合素都存在如下结构N末端半胱氨酸丰富区，该区易于形成链内二硫键，该区之后是胶原蛋白样区，α螺旋形卷曲螺旋区(α-helicalcoiled-coil region)，最后是C型凝集素结构域，该结构域是模式识别区，被称为糖识别结构域(CRD)。集合素的名称源自其既存在胶原蛋白结构域又存在凝集素结构域。α螺旋的卷曲螺旋区引发单个多肽的三聚化，形成胶原蛋白三倍体螺旋(coil)，从而产生集合素亚单位，每个亚单位由3条多个肽组成；N末端区介导亚单位寡聚物的形成。不同的集合素呈现彼此不同的高级结构，通常可以是亚单位的四聚体或亚单位的六聚体。虽然单个CRD与糖的固有亲和力相对低，但大量结合结构域的聚集可使得集合素与微生物细胞壁以高亲合力结合。
C型CRD无论从系统发生角度还是从功能角度而言都广泛存在于蛋白中。不同集合素的不同CRD能使集合素识别暴露于不同微生物上的多种不同微生物表面成分。末端CDR的分布方式使得所有三个呈现出结合位点的结构域靶表面有大约53的间距(Sheriff等，1994；Weis和Drickamer，1994)。“模式识别”的这种特性还可导致对微生物表面的选择性结合。集合素的胶原蛋白区或可能是集合素的N末端尾，可以由吞噬细胞上的特定受体识别，并且还是相关蛋白酶的结合位点，所述蛋白酶通过CDR结构域与靶的结合而活化，从而引发补体的级联反应。
甘露聚糖结合凝集素(MBL)(又称甘露糖结合凝聚素或甘露糖结合蛋白)是一种集合素，其作为固有免疫系统的一个重要部分已引起人们的极大兴趣。MBL与发现于多种微生物(包括细菌，酵母，寄生的原生动物和病毒)表面的特定糖结构结合，且已发现这些MBL可呈现抗菌活性，其机制包括，通过活化终末裂解性补体成分而介导杀伤作用，或促进吞噬作用。MBL缺陷与儿童，可能还有成年人，对由多种微生物引起的频繁感染的易感性有关。
MBL的CRD优先识别具有中部的3-和4-OH基团的己糖，如甘露糖，葡萄糖，N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰葡萄糖胺，而不能满足该空间要求的一些糖，如半乳糖和D-岩藻糖则不能结合(Weis等，1992)。糖选择性很明显是MBL识别自身/非自身的一个重要方面，且可能是由微生物表面的甘露糖和N乙酰葡萄糖胺残基的分布(prevalence)差异介导的，一个实例是在酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)的细胞壁上存在高含量的甘露糖。哺乳动物蛋白糖基化中的糖结构通常是唾液酸，这可以防止MBL同这些寡聚糖的结合，从而防止MBL识别“自身”表面。另外，每个MBL亚单位的三聚体结构可能对靶识别很重要。
补体是存在于血浆和组织液中的一组蛋白，其在感染后可帮助机体防御。补体系统通过至少三个不同的途径活化，它们是经典途径，旁路途径和MBL凝集素途径(Janeway et al，1999)。经典途径在补体因子1(C1)识别表面结合型免疫球蛋白时引发。C1复合物由两种蛋白裂解酶C1r和C1s和一种非酶部分C1q组成，所述C1q包含免疫球蛋白识别结构域。C1q和MBL有共同的结构特征，用电子显微镜观察发现这两种分子都有花束样的外形。另外，象C1q一样，也发现MBL与两个蛋白裂解酶，即甘露聚糖结合凝集素相关蛋白酶(MASP)形成复合物。上述三种途径都产生补体因子3(C3)转化酶，该酶保证C3b与活化表面，即所靶向的微生物病原体的表面结合。C3向表面结合的C3b的转变在通过吞噬作用或裂解作用清除微生物病原体的过程中是非常关键的(Janeway等，1999)。
沙门氏菌(Salmonella)的某些O抗原特异性寡糖已报道在C4缺陷的豚鼠血清中可活化补体，之后还发现沙门氏菌血清型C可与MBL反应，从而通过MBL凝集素途径活化补体，所述MBL凝集素途径也称为补体活化的MBL途径或凝集素途径。
人们很久以来推测，固有免疫系统在特异性免疫应答(如以感染或接种之后的抗体应答为例)的产生过程中可与获得性免疫系统协作。
Fearon研究小组已报道补体因子C3的C3d片段，通过基因技术的融合作用与蛋白抗原偶联后，可增加抗原的免疫原性1000倍或更多。人们正期待着该项技术或任何变更的技术的实际应用。
补体系统在正常免疫应答中的重要性是首先由Pepys提出的，他发现在小鼠中用眼镜蛇毒因子(cobra venom factor)耗竭C3可消弱对绵羊红细胞这种胸腺依赖型抗原的抗体应答。固有免疫和获得性免疫之间的相互联系的观点也得到如下报道的支持C4，C2和C3缺陷的患者和试验动物呈现针对胸腺依赖型抗原的初次抗体应答下降和IgM向IgG的转换受损。其机制可能涉及C3来源的配体的产生，这种配体使抗原或包含抗原的复合物与B淋巴细胞或抗原呈递细胞上的补体受体结合。因此，在小鼠体内，用特异性抗CR1和抗CR2抗体或可溶性受体蛋白阻断CR1(CD35)和CR2(CD21)，降低了免疫后的抗体应答，这一事实以及用CR1和CR2-缺陷的敲除(knock-out)小鼠进行的试验都表明，这些受体是胸腺依赖型抗原应答所必需的。除此之外，有白细胞粘附缺陷的患者，其缺陷CD11/CD18粘附分子CR3即表现出抗体应答功能受损，IgM不能向IgG转换。C3来源的片段C3d，是特异性的CR2配体，如上所述，可显示很强的剂量依赖性的佐剂效应。
经典补体途径(C1，C2，C4和C3)的缺陷与有荚膜的细菌的感染有关。其主要原因可能是补体功能紊乱后所造成的调理和杀菌防卫机制的效率下降。但这也可能与对多糖抗原的免疫应答减弱有关。补体对胸腺非依赖型抗原的应答的影响还没有深入研究，并且已有的资料也都是相互矛盾的。在C3耗竭小鼠和C3缺陷狗体内对胸腺非依赖型抗原的低抗体应答已得到清楚证明。而一些报道却发现C3缺陷患者用多糖疫苗免疫后应答看起来是正常的。
Slander等在1999年发现来自C2缺陷的患者的血清中针对沙门氏菌血清型C的寡聚糖的IgG抗体的水平明显下降。同样，针对沙门氏菌血清型C抗原的IgG抗体在来自MBL浓度极低的个体的血清中也下降。但抗CO抗原的IgM水平在两组中都正常。对这些发现的可能的解释是，凝集素途径与完整的C4，C2和C3的功能相结合，通过有效产生C3d包被抗原，促进了体内针对MBL结合型糖结构的IgG应答。Fearon和Locksley已提出了有关这种初次免疫应答的一系列事件发生的可能性。人们也可以推测，MBL-糖这种复合物通过与MBL受体的相互作用，可对免疫活性细胞产生更直接的影响。MBL缺陷是与感染的易感性有关的免疫缺陷中一种非常常见的形式。一种有趣的提示是对免疫应答的干扰可能是这种免疫缺陷综合征的整体的一部分。
Lutz近来研究了对非己的初次免疫应答的基础，并提出包含抗原和天然抗体的补体激活免疫复合物的信息在体内起着至关重要的作用。这种观点对胸腺依赖型抗原和一些胸腺非依赖型抗原而言是有根据的。MBL所起的作用可能类似于天然抗体的作用。
发明概述如果继补体功能紊乱之后的免疫应答降低造成与C3补充受损有关的病症中出现的免疫性下降，那么就会出现问题。因为重要的一点是，在抗原以低浓度存在时，对胸腺非依赖型抗原的免疫应答主要需要补体。
在个体发生过程中，糖免疫力的成熟较慢，且可能部分取决于接触低剂量抗原时的一系列亚临床免疫事件。这样，就可以设想补体的缺陷可能会延迟免疫性的建立。另一方面，在C3和备解素(旁路激活途径的一个成分)缺陷时接种多糖的不同应答已经得到证实，且所述应答也可能出现在经典途径缺陷的状态下。
Slander等1999的发现提示，在C2缺陷的情况下对一些糖抗原的免疫应答下降，并且提示在免疫系统成熟过程中MBL途径在同种型转换中可能起着关键的作用。
补体功能紊乱对免疫应答的影响反映出固有免疫和获得性免疫之间的有趣的联系，且就先天和后天补体缺陷状态下免疫性的建立而言，这种影响具有临床意义。
考虑到对100％的疫苗接种产生适当的，保护性的应答的重要性，需要强调探索提高疫苗免疫原性的途径的重要性，尤其是对那些已知没有令人满意的成功率的疫苗。这样的一个实例是，乙型肝炎病毒不仅引起肝炎，还可导致肝癌的产生，致使每年有7000,000以上的人死亡。用乙型肝炎病毒表面抗原接种可在90％的人中产生有效的保护，但还有10％的人反复接种后不能产生抗体应答。
因此，提供免疫原性增强的改进的疫苗有着极其重要的意义。佐剂通常可以用来改善免疫原性组合物的效力。一般情况下，佐剂由包含在制剂中的试剂组成，用来提供和/或改善免疫原性组合物诱导所需免疫应答的能力。
因此，本发明的第一个目的是提供一种组合物，该组合物包含作为佐剂的药用有效量的至少一种集合素和/或集合素同系物以及用作疫苗的至少一种免疫原性决定簇。
本发明的第二个目的是提供一种用免疫原性决定簇免疫个体的方法，包括给药所述个体至少一种集合素和/或集合素同系物以及至少一种免疫原性决定簇，所述免疫原性决定簇选自细菌，真菌，病毒和其它病原体免疫原性决定簇或这些感染物的任何衍生物。
本发明的第三个目的是药用可接受量的至少一种集合素和/或集合素同系物在制备改善免疫应答的药物组合物中的用途，所述免疫应答是接种细菌，真菌，病毒和/或其它病原体免疫原性决定簇和/或这些感染物的任何衍生物之后的免疫应答。
另外，本发明的另一个目的是药用可接受量的至少一种集合素和/或集合素同系物以及至少一种选自细菌，真菌，病毒和其它病原体免疫原性决定簇或这些感染物的任何衍生物的免疫原性决定簇在制备疫苗组合物中的用途。
提供一种药盒是本发明的另一个目的，该药盒包含用作佐剂的药用有效量的集合素和/或集合素同系物以及用作疫苗的至少一种免疫原性决定簇。
定义佐剂与所给药的免疫原性决定簇混合后能增加或者改变对所述决定簇的免疫应答的任何物质。
载体一种支架结构，例如免疫原性决定簇能与之结合的多肽或多糖。
集合素在结构上相关的固有免疫的糖识别蛋白家族，包括甘露聚糖结合凝集素和表面活性剂蛋白A和D。该名称是指该蛋白存在胶原蛋白样区和C型凝集素结构域。
补体一组存在于血浆和组织液中的蛋白，该蛋白在感染后帮助机体防御。补体参与破坏外来细胞且可吸引吞噬细胞到达机体的冲突部位。
偶联的在两个化合物之间形成的连接，例如在免疫原性决定簇和集合素和/或集合素同系物之间，或在免疫原性决定簇和糖之间形成的连接。这种连接可以是通过例如化学键如共价键的形成而产生的物理连接。
CRD糖识别功能域，其是在集合素的C末端发现的一种C型凝集素结构域。
免疫原性决定簇包含一种或多种表位的分子或其部分，所述表位将刺激宿主生物体的免疫系统以产生分泌性的，体液的和/或细胞性的抗原特异性应答。免疫原性决定簇也可以是能在脊椎动物体内产生所述免疫原的DNA分子。
免疫应答对包含免疫原性决定簇的免疫原性组合物的应答。免疫应答涉及宿主体内针对所给药的组合物或疫苗的细胞和/或体液免疫应答的形成。免疫应答通常涉及如下的一种或多种物质的行为i)所产生的抗体，ii)B细胞，iii)T辅助细胞，iv)T抑制细胞，v)细胞毒性T细胞和iv)特异性或非特异性针对存在于所给药的免疫原性组合物中的免疫原性决定簇的补体。
MBL甘露聚糖结合凝集素。
接种在生物体内诱导保护性免疫应答的过程。
疫苗能在受试者体内产生保护性免疫应答的免疫原性组合物。
图1所示测血清(a-BO，a-CO，a-DO)中沙门氏菌O抗原特异性IgG抗体的浓度。指定浓度的免疫固定IgG的量用人血清蛋白标准品(X 0908)的稀释液以及ELISA微滴板上包被有抗Fab抗体的孔来评估。在所述微量滴定板的其它部分，将抗BO，抗CO和抗DO血清的稀释液加入包被了沙门氏菌O抗原特异性寡糖的孔。平行曲线允许抗体以μg/ml表示。在所述检测系统中，用IgM和IgA抗体获得了类似的结果。IgG的X 0908曲线是在10次试验的基础上得出的，在该曲线的线性部分，数值的变异系数是13.0％。特异性IgG的检测重复两次(变异系数是10.7％)。
图2表示C2缺陷成人(C2D，实心符号)中和正常人对照血清(NHS，空心符号)中抗沙门氏菌血清型B，C和D(BO，CO和DO)的IgG抗体。用双尾Mann-Whitney检验进行统计学分析(n.s.＝不显著)。
图3表示抗沙门氏菌血清型B，C和D的IgM抗体。缩写和符号如图2所示。
图4表示正常人对照中(4a)，C2缺陷成人中(4b)和有低水平MBL的健康人中(4c)与抗沙门氏菌血清型C的IgG抗体相关联的MBL水平。所述MBL的检测用ELISA进行。
发明详述集合素在本发明的一个实施方案中提供了一种包含至少一种集合素和/或集合素同系物的组合物。这种集合素和/或集合素同系物优选包含一个或多个集合素亚单位，如例如2个亚单位(二聚物)或例如3个亚单位(三聚物)或例如4个亚单位(四聚物)或例如5个亚单位(五聚物)或例如6个亚单位(六聚物)。更优选，所述集合素和/集合素同系物包含集合素和/或集合素同系物的混合物，而每个集合素和/集合素同系物都包含不同数量的亚单位。
优选集合素亚单位的四聚物，五聚物和/或六聚物与集合素亚单位的二聚物之比至少是2∶1，更优选至少是3∶1，还更优选至少是4∶1，最优至少是5∶1。
在一个实施方案中，所述集合素和/或集合素同系物的所有亚单位是相同的。
每个集合素亚单位优选包含3个集合素多肽，在优选实施方案中，这3个集合素多肽是相同的。这样的集合素多肽链优选包含N末端区的半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域，颈区和/或糖识别结构域(CRD)，更优选集合素多肽链包含N末端区的半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域，颈区和糖识别结构域(CRD)。
所述糖识别结构域优选是C型凝集素结构域，该结构域优选能以Ca2+依赖的方式与糖相互作用。
所述颈区优选包含α-螺旋状的二级结构，更优选能与其它两个颈区的α螺旋相互作用，以形成卷曲螺旋型的三倍体螺旋。
所述胶原蛋白样结构域优选包含重复的胶原蛋白基序Gly-X-Y，优选Y位置包含羟脯氨酸。在一个实施方案中，胶原蛋白样结构域包含至少1个，如至少2个，例如至少5个，如至少10个，例如至少15个重复的胶原蛋白基序。这种重复序列可以是一个接着一个不间断，或者也可以是间断的。在优选实施方案中，它们被一个或多个Gln残基至少间断一次。
在本发明的一个实施方案中，集合素选自SP-A，SP-D，CL43，共凝集素，CL1或甘露聚糖结合凝集素(MBL)。
我们已经注意到集合素可通过其它补体因子不必参与的机制发挥佐剂活性。这对本申请来说是不重要的，因为本申请可不论任何机制而要求佐剂的活性。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含另外的补体因子。所述这些补体因子可以是例如C2，C3，C4或C5。
依照本发明的集合素还可以是集合素的杂合体，例如选自SP-A，SP-D，CL43，共凝集素，CL1，甘露聚糖结合凝集素(MBL)和它们的同系物的集合素的杂合体。因此，本发明的集合素可以包含来自一个集合素的一个或多个结构域或来自不同集合素的一个或多个其它的结构域。应用这些集合素的杂合体可增加不同种类集合素识别糖的谱型。
例如，N末端半胱氨酸丰富区可源自SP-A，SP-D，CL43，共凝集素，CL1，MBL或者它们的同系物；胶原蛋白样结构域可源自SP-A，SP-D，CL43，其凝集素，CL1，MBL或者它们的同系物；颈区可源自SP-A，SP-D，CL43，共凝集素，CL1，MBL或者它们的同系物；糖识别功能域(CRD)可源自SP-A，SP-D，CL43，共凝集素，CL1，MBL或者它们的同系物。
在一个实施方案中，N末端半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域和颈区可源自MBL，而糖识别功能域(CRD)可源自PS-A或SP-D。这样产生的杂合体将是MBL样分子，其所识别的糖与SP-A或SP-D识别的糖相同。
另外，本发明的集合素还可以是集合素和抗体之间形成的杂合体。这种杂合体可包含来自一种或多种集合素的一种或多种结构域。优选所述杂合体包含N末端半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域和/或颈区，更优选所述杂合体包含N末端半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域和颈区。进一步地，所述杂合体可包含来自抗体的一种或多种结构域或片段。优选，所述杂合体包含抗体的抗原结合片段例如Fc片段。
因此，本发明的集合素在一个实施方案中包含源自MBL的N末端半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域和颈区，所述MBL与抗体的抗原结合片段偶联。
优选，对上述抗体的抗原结合片段进行选择，以使其可与包含在本发明特定实施方案的免疫原性决定簇中的抗原特异性地相互作用。
MBLMBL是可应用于本发明的集合素的非限制性实例。
在一个实施方案中，MBL可直接与抗原相连接。例如MBL可以是抗原上天然存在的，或MBL能自然地与所述抗原相连。或者，可将MBL化学偶联到抗原上，或通过其它任何有用的方法偶联到抗原上。
优选，所述MBL是哺乳动物MBL，更优选是人MBL。具体地，MBL可以是国际专利申请00/70043中SEQ ID1所示序列的MBL，所示序列对应于数据库登陆号为P11226的MBL序列。
所述MBL可源自本领域技术人员已知的任何途径。在本发明的一个实施方案中，MBL是天然存在的MBL。优选，这种天然存在的MBL纯化自哺乳动物血浆，更优选纯化自人血浆。
在优选实施方案中，MBL是重组的，表达自基因表达构建体，所述构建体包含编码MBL多肽或其功能性同系物的核苷酸序列，该核苷酸序列与自然状态下不与之相连的表达信号可操作地连接。所述编码MBL多肽的核苷酸序列可以是例如cDNA序列，也可以是基因组DNA序列。
所述重组的MBL可以在本领域技术人员已知的任何适当的宿主中产生，例如所述宿主可以选自转基因动物，哺乳动物细胞系(包括人细胞系)，昆虫细胞，酵母细胞，细菌细胞或植物。
优选，所述重组MBL包含MBL亚单位的寡聚物，更优选，重组MBL包含大于二聚物的MBL寡聚物。例如所述重组的MBL可包含MBL亚单位的寡聚物，使MBL亚单位的四聚物，五聚物和/或六聚物与MBL亚单位的二聚物之比至少是2∶1，优选至少是3∶1，更优选至少是4∶1，最优选至少是5∶1。
在本发明的优选实施方案中，用SDS-PAGE和/或Western印迹分析时，至少50％的MBL寡聚物的表观分子量大于200 kDa。例如至少60％，如至少70％，例如至少80％，如至少90％，例如至少95％的MBL寡聚物用SDS-PAGE和/或Western印迹分析时，表观分子量大于200kDa。在对表观分子量大于200kDa的MBL的量进行确定时，可使用光密度分析，在分析中，SDS-PAGE凝胶上的蛋白带用蛋白染色法染色，例如银染色或考马氏亮兰染色，或使用MBL特异性抗体的Western印迹的特定染色。
在尤其优选的实施方案中，重组的MBL如专利申请PCT/DK00/00246所述进行制备和纯化，该专利申请全文引入本文作参考。
MASP是丝氨酸蛋白酶，其以与MBL形成的复合物形式参与补体活化的MBL途径。在本发明的一个实施方案中，该组合物进一步包含一个或多个丝氨酸蛋白酶，优选一个或多个MASP，更优选一个或多个活化的MASP。优选，所述MASP是与本发明的MBL或MBL同系物形成的复合物。所述MASP选自MASP-1，MASP-2和MASP-3，优选所述MASP是MASP-2的活化形式。
集合素的同系物本发明范围内的包括MBL的集合素同系物应理解为能发挥类似集合素所具有的功能的任何蛋白质。具体地，所述功能是指在与一种或多种糖结合后活化补体的能力。
同系物可包含一个或多个保守的氨基酸取代，如至少2个保守的氨基酸取代，例如至少3个保守的氨基酸取代，如至少5个保守的氨基酸取代，例如至少10个保守的氨基酸取代，如至少20个保守的氨基酸取代，例如至少50个保守的氨基酸取代，如至少75个保守的氨基酸取代，例如至少100个保守的氨基酸取代。
在本发明中保守的氨基酸取代是指预先确定的氨基酸组中的一种氨基酸由同一预先确定的氨基酸组中的另一氨基酸(显示类似或基本类似的特征)所取代。上述预先确定的氨基酸组是指，例如i)极性侧链的氨基酸组(Asp，Glu，Lys，Arg，His，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr和Cys)，ii)非极性侧链的氨基酸组(Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，和Met)，iii)脂肪族侧链氨基酸组(Gly，Ala，Val，Leu，Ile)，iv)环状侧链氨基酸组(Phe，Tyr，Trp，His，Pro)，v)芳香族侧链氨基酸组(Phe，Tyr，Trp)，vi)酸性侧链氨基酸组(Asp，Glu)，vii)碱性侧链氨基酸组(Lys，Arg，His)，viii)酰胺基侧链氨基酸组(Asn，Gln)，ix)羟基侧链氨基酸组(Ser，Thr)，x)含硫侧链氨基酸组(Cys，Met)和xi)单氨-二羧酸或单氨单羧基-单酰胺羧酸的氨基酸组(Asp，Glu，Asn，Gln)。
保守取代可引入优选的集合素的任何位置。
除保守取代之外，人们也期望引入非保守取代。非保守取代可产生能呈现与所述集合素相似的功能的集合素同系物。所述取代的氨基酸可以例如i)在疏水性方面显著不同，例如疏水性残基(Val，Ile，Leu，Phe或Met)取代了亲水性残基如Arg，Lys，Trp或Asn，或者亲水性残基如Thr，Ser，His，Gin，Asn，Lys，Asp，Glu或Trp取代了疏水性残基；和/或ii)对多肽主链的方向产生显著不同的作用，如Pro或Gly被其它氨基酸取代，或Pro或Gly取代了其它氨基酸；和/或iii)在电荷方面显著不同，例如带负电荷的残基如Glu或Asp取代了带正电荷的残基如Lys，His或Arg(反之亦然)；和/或iv)在空间体积方面显著不同，例如体积大的残基如his，Trp，Phe或Tyr取代了具有较小侧链的残基如Ala，Gly或Ser(反之亦然)。
本发明另一实施方案涉及优选集合素的同系物，其中所述同系物包含取代的氨基酸，该氨基酸的亲水/疏水倾向性指数值在其取代的氨基酸的指数值的+/-2.5之内，例如+/-2.3之内，如+/-2.1之内，例如+/-2.0之内，如+/-1.8之内，例如+/-1.6之内，如+/-1.5之内，例如+/-1.4之内，如+/1.3之内，例如+/-1.2之内，如+/-1.1之内，例如+/-1.0之内，如+/-0.9之内，例如+/-0.8之内，如+/-0.7之内，例如+/-0.6之内，如+/-0.5之内，例如+/-0.4之内，如+/-0.3之内，例如+/-0.25之内，如+/-0.2之内。
氨基酸亲水/疏水倾向性指数在赋予蛋白质以相互作用式生物功能方面的重要性是本领域公知的(Kyte和Doolittle，1982和Hopp，美国专利4,554,101，都引入本文作参考)。
本文所应用的氨基酸的亲水指数值是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)； 谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)(Kyte和Doolittle，1982)。
氨基酸的亲水性值是精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)(美国专利4,554,101)。
因此，在一个实施方案中，氨基酸的取代可根据它们的疏水性值和亲水性值，以及氨基酸侧链取代物的相对相似性(包括电荷，大小等)来制备。将前述各种特征加以考虑的例证性氨基酸取代是本领域技术人员熟知的，它们包括精氨酸和赖氨酸的取代；谷氨酸和天冬氨酸的取代；丝氨酸和苏氨酸的取代；谷氨酰胺和天冬酰胺的取代以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的取代。
另外，同系物可以包含氨基酸的添加或缺失，例如添加或缺失2到100个氨基酸，如2到50个氨基酸，例如2到20个氨基酸，如2到10个氨基酸，例如2到5个氨基酸，如2到3个氨基酸。
然而，添加100个以上的氨基酸，如100到500个氨基酸也包括在本发明的范围之内。与优选的集合素至少有一些同源性的蛋白质可视为落入了本发明的范围之内，所述有一些同源性的蛋白是指这些蛋白与优选的集合素至少约40％同源，如至少约50％同源，例如至少约60％同源，如至少约70％同源，例如至少约75％同源，如至少约80％同源，例如至少约85％同源，如至少约90％同源，例如至少92％同源，如至少94％同源，例如至少95％同源，如至少96％，例如至少97％同源，如至少98％同源，例如至少99％同源。
免疫原性决定簇本发明的免疫原性决定簇可以是任何免疫原性决定簇，针对这些决定簇，人们期望能在宿主机体内获得分泌型的抗原特异性体液免疫应答和/或抗原特异性细胞免疫应答。具体地，所述免疫原性决定簇可以是细菌，真菌，病毒和/或其它病原体免疫原性决定簇和/或这些感染物的任何衍生物。
在优选实施方案中，所述免疫原性决定簇包含一种或多种糖。所述糖可选自单糖，双糖，三糖，寡糖或多糖。所述二糖，三糖和多糖可包含仅仅一种糖的单糖单位，或它们也可包含一种糖以上的单糖单位。
每种单糖单位可选自酮糖或醛糖。酮糖例如二羟基丙酮(DHA)，赤藓酮糖，核酮糖，木酮糖，果糖和山梨糖，以及它们的衍生物。醛糖例如赤藓糖，苏糖，木糖，阿拉伯糖，核糖，去氧核糖，葡萄糖，甘露聚糖(甘露糖)和半乳糖，以及它们的衍生物。二糖可选自蔗糖，乳糖，麦芽糖，纤维二糖，海藻糖或蜜二糖。所述糖还进一步包含甘露醇，山梨醇，肌醇，葡庚糖和L-来苏糖。
优选，所述糖能与本发明的集合素相互作用。当本发明的集合素选自MBL和MBL同系物时，免疫原性决定簇优选包含一种或多种与MBL反应的单糖，寡糖或多糖，包括例如甘露聚糖和甘露糖。
在本发明一个实施方案中，免疫原性决定簇包含以上所述的糖，所述的那些糖天然状态下不与所述免疫原性决定簇相连。优选所述糖能够与本发明的集合素相互作用。在集合素选自MBL或MBL同系物的情况下，所述糖，例如可以是单糖，寡糖或多糖，优选是与MBL反应的，包括例如甘露聚糖和甘露糖。
所述糖优选通过共价键与所述免疫原性决定簇偶联。所述糖可以通过本领域技术人员已知的任何方法与免疫原性决定簇偶联。例如，该方法可以是Allen和Kisailus编辑的(Marcel Dekker Inc.)糖偶联物一书中所描述的任何方法，具体是第6章121页至165页所描述的方法。另外，可利用本领域技术人员可得到的任何有用的交联剂将糖和免疫原性决定簇进行连接。具体是可利用双功能交联试剂，例如2001-2001 Perbio产品目录第294-343页所描述的任何试剂。
在另一个实施方案中，免疫原性决定簇直接与本发明的集合素偶联。优选所述免疫原性决定簇通过共价键与所述集合素偶联。所述免疫原性决定簇可通过的本文以上所述的任何将糖和免疫原性决定簇相偶联方法与集合素偶联。在优选实施方案中，所述免疫原性决定簇与MBL偶联。
然而，免疫原性决定簇和本发明的集合素彼此不直接连接的情况也包括在本发明的范围之内。
在一个优选实施方案中，所述免疫原性决定簇是一种或多种细菌抗原和/或细菌抗原的衍生物。这些细菌抗原可来源于选自如下的细菌百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，流产布鲁氏菌(Brucella abortis)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，沙门氏菌，伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)，链球菌(Streptococci)，弧菌(Vibrio)(霍乱弧菌，副溶血弧菌(V.parahaemolyticus))，志贺氏菌(Shigella)，假单胞菌(Pseudomonas)，布鲁氏菌(Brucella species)，分枝杆菌(Mycobacteria species)(结核，鸟，BCG，麻风)，肺炎球菌(Pneumococci)，葡萄球菌(Staphlylococci)，肠杆菌(Enterobacter species)，汉氏罗卡利马氏体(Rochalimaia henselae)，巴斯德氏菌(Pasterurella)(溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica)，多杀巴斯德氏菌(P.multocida))，衣原体(Chlamydia)(砂眼衣原体C.trachomatis)，鹦鹉热衣原体(C.psittaci)，性病淋巴肉芽肿变体颗粒瘤(Lymphogranuloma venereum))，梅毒(Syphilis)(苍白密螺旋体(Treponema pallidum))，嗜血菌(Haemophilus species)，支原体病，莱姆病(Lymedisease)(布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))，军团菌病(Legionnaires′disease)，肉毒中毒(肉毒梭状芽孢杆菌(Colstridium botulinum))，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia entercolitica)和立克次氏体(Rickettsiae)。
优选，所述细菌抗原是沙门氏菌，肺炎链球菌或脑膜炎球菌抗原，更优选免疫原性决定簇是沙门氏菌O抗原。
在本发明一个实施方案中，所述免疫原性决定簇是一种或多种病毒抗原和/或病毒抗原的衍生物。病毒抗原可以来源于选自如下的病毒腺伴随病毒(Adeno-associated virus)，腺病毒(Adenovirus)，禽传染性支气管炎病毒(Avianinfectious bronchitis virus)，杆状病毒(Baculovirus)，水痘病毒(Chicken pox)，冠状病毒(Corona virus)，巨细胞病毒(Cytomegalovirus)，肠道病毒(Enterovirus)，EB病毒(Epstein Barr virus)，猫白血病病毒(Feline leukemiavirus)，口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus)，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，疱疹病毒(Herpes species)，单纯疱疹病毒(Herpes simplex)，流感病毒，HIV-1，HIV-2，HTLV 1，甲型流感病毒和乙型流感病毒(Influenza A and B)，库宁病毒(Kunjin virus)，拉萨热病毒(Lassa fever virus)，LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitis virus))，慢病毒(lentivirus)，麻疹病毒(Measles)，曼哥病毒(Mengo virus)，乳头状瘤病毒(Papilloma virus)，Parovirus，副流感病毒(Parainfluenza virus)，副粘病毒(Paramyxovirus)，细小病毒(Parvovirus)，Pokovirus，脊髓灰质炎病毒(Polio virus)，多瘤病毒(Polyoma tumor virus)，假狂犬病毒(pseudorabies)，狂犬病毒(Rabies virus)，呼肠孤病毒(Reovirus)，呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)，逆转录病毒，鼻病毒(rhinovirus)，牛瘟病毒(Rinderpest)，轮状病毒(Rotavirus)，塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus)，仙台病毒(Sendai virus)，猴病毒40(Simian Virus)，新培斯病毒(Sindbisvirus)，SV5，蜱传脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)，披膜病毒(Togavirus)(风疹，黄热(yellow fever)，登革热(dengue fever))，痘苗病毒(Vaccina virus)，委内瑞拉马脑脊髓炎和水泡性口炎病毒(Venezuelan equineencephalomyelitis and Vesicular stomatis virus)。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒抗原优选流感病毒抗原或乙型肝炎病毒抗原。
所述免疫原性决定簇还可以是来自如下寄生虫的抗原疟疾(恶性疟原虫(Plasmodium.Falciparum)，间日疟原虫(P.vivax)，三日疟原虫(P.malariae)，血吸虫(Schistosomes)，锥虫(Trypanosomes)，利什曼原虫(Leishmania)，丝状线虫(Filarial nematodes)，毛滴虫病，肉孢子虫病，绦虫(Taenia)(牛肉绦虫(T.saginata)，猪肉绦虫(T.solium))，岗氏弓形体(Toxoplasma gondii)，旋毛虫病(旋毛线虫(Trichinella spiralis))或球虫病(艾美球虫(Eimeria species))。
免疫原性决定簇还可以是来自如下真菌的抗原新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，白色念珠菌(Candida albicans)，烟曲霉(Apergillusfumigatus)以及球孢子菌病(Coccidioidomycosis)。
特异性免疫原性决定簇可以是例如蛋白，多糖，脂多糖或脂肽；或者可以是这些物质中任何物质的组合。具体地，特定免疫原性决定簇可包含天然蛋白或蛋白片段，或合成的蛋白或蛋白片段或肽；其可以包括糖蛋白，糖肽，脂蛋白，脂肽，核蛋白，核肽；其可以包括肽-肽偶联物；其可以包括重组的核酸表达产物。所述蛋白和/或肽可以在细菌，酵母或哺乳动物细胞中表达，或者可以分离自病毒制品。另外，所述肽可以在体外合成。
在一个实施方案中，免疫原性决定簇是减毒活病原体即没有毒力的病原体，这些病原体已通过基因突变的方式被“破坏”。所述突变阻止了病原体在将接种的受体或受试者体内导致疾病。
在另一实施方案中，免疫原性决定簇是无活力的完整生物体，具体地，所述无活力的完整生物体是指通过化学处理，即通过福尔马林处理被灭活，或已通过致死量放射线处理被灭活的病原体。
在另一实施方案中，免疫原性决定簇包含纯化自病原体的亚细胞成分，针对这种病原体，人们期望个体获得免疫力。给药这种免疫原性决定簇通常是安全的，因为所述亚细胞成分在受体内不可能引起疾病。这种纯化的亚细胞成分可以是具有免疫原性决定簇的确定亚细胞组分，纯化的蛋白，核酸或多糖，能够刺激针对所述病原体的免疫应答。所述免疫原性决定簇可纯化自破裂的病原体的9制品。或者，免疫原性决定簇如蛋白，核酸或多糖也可以用本领域熟知的方法合成。
本发明还包括这样的免疫原性决定簇，它们实际上是如上所述的一种以上的免疫原性决定簇的混合物。
疫苗本发明包含集合素的疫苗优选能在受试者体内产生保护性的免疫应答。这种保护性的免疫应答可保护所述受试者抗御各种临床病症，尤其是病毒感染或细菌感染。
所述临床病症可选自放线菌病，腺病毒感染，Antrax，细菌性痢疾，肉毒中毒(Botulisme)，布鲁氏菌病(Bang′s病)，优选是由马尔他布鲁氏杆菌(B.melitensis)和猪布鲁氏杆菌(B.suis)引起的布鲁氏菌病，念珠菌病，蜂窝织炎，软下疳，霍乱，球孢子菌病，急性无热病(Acute afebril)，结膜炎，膀胱炎，皮肤真菌病，Difteri，细菌性心内膜炎，会厌炎，丹毒，类丹毒，胃肠炎，生殖器疱疹，腺(Glandulae)，淋病，病毒性肝炎，组织胞浆菌病(Histoplasmose)，脓疱病，单核细胞增多症，流行性感冒，军团菌病，麻风，钩端螺旋体病，莱姆病，麻疹，惠特莫尔氏热，脑膜炎球菌感染，脑膜炎，流行性腮腺炎，诺卡放线菌病(Nocardiosis)(星形诺卡菌Nocardia asteroids)，非淋球菌性尿道炎(Non-gonococcal urethritis)，品他病(Pinta)，鼠疫(Pest)，肺炎球菌性肺炎，脊髓灰质炎，原发性肺感染(Primary lung infection)，假膜性小肠结肠炎，抗生素相关性产后脓毒症(antibiotic-associated Puerperal sepsis)，狂犬病，回归热(Relaps-fever)，风湿热，落矶山斑疹热，风疹(Rubella)，麻疹(Rubeola)，沙门氏菌感染，葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征，链球菌性肺炎，链球菌性咽炎(strep咽喉)，Syfilis，破伤风，毒性休克综合征，弓形体病，结核病，土拉菌病，伤寒，Tyfus，荨麻疹，阴道炎，水痘，疣，百日咳，雅司病(Yaws)和黄热病。
药物组合物本发明的组合物和/或组配药盒优选包含药用有效量的至少一种作为佐剂的集合素和/或集合素同系物。所述药用有效量是指与免疫原性决定簇联合应用时足以诱导个体内产生期望的保护性免疫应答的集合素和/或集合素同系物的量。
给药MBL的量取决于特定个体，具体是取决于所述个体的大小。优选，每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药1ng-1μg MBL，更优选每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药5ng-500ng MBL，甚至更优选每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药7ng-250ng MBL，最优选每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药10ng-100ng MBL。
在本发明的一个优选实施方案中，以不明显改变个体的血清MBL水平的量向所述个体给药MBL。例如可以向MBL血清水平下降的个体给药不足以重建正常的MBL血清水平的量的MBL。
本发明的组合物或组配药盒优选包含药用有效量的至少一种免疫原性决定簇。所述药用有效量是指与相应佐剂联合应用时足以诱导个体内期望的保护性免疫应答的免疫原性决定簇的量。
给药免疫原性决定簇的量取决于特定的个体，具体是取决于所述个体的大小以及特定的免疫原性决定簇。优选，每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药0.01-5μg免疫原性决定簇，更优选每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药0.05-4μg免疫原性决定簇，甚至更优选每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药0.1-3μg免疫原性决定簇，最优选每单位剂量的给药范围是每公斤体重给药0.5-2.5μg免疫原性决定簇。
在本发明一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种另外的佐剂。所述佐剂可以是具有本领域技术人员已知的佐剂效应的任何化合物。例如，所述佐剂可以是矿物源的，细菌源的，植物源的，合成的或宿主源的，或者它们也可以是水包油乳剂。
所述佐剂可以选自AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)，硅石，明矾，Al(OH)3，Ca3(PO4)2，高岭土，碳，氢氧化铝，胞壁酰二肽，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰-降胞壁酰(nomuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也称为降(nor)-MDP)，N-乙酰胞壁酰(acetylmuramyul)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰(isoglutaminyl)-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰(dipalmitoyl)-锡(sn)-甘油基(glycerol)-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，也称作MTP-PE)，RIBI(MPL+TDM+CWS)的2％角鲨烯/吐温-80.RTM.乳剂，脂多糖及其各种衍生物，包括脂质A，弗氏完全佐剂(FCA)，弗氏不完全佐剂，Merck佐剂65，多核苷酸(例如，多聚IC和多聚AU)，来自结核分枝杆菌的蜡质(wax)D，在小棒杆菌(Corynebacterium parvum)，百日咳博德特氏菌以及布鲁氏菌属成员中发现的物质，脂质体或其它的脂质乳剂，Titermax，ISCOMS，Quil A，ALUN(参见美国专利58767和5,554,372)，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成的肽基质或GMDP，白细胞介素1和白细胞介素2。
在本发明的一个实施方案中所述组合物还包含载体。所述载体可以独立于佐剂存在。载体的功能可以是例如增加免疫原性决定簇的分子量，以增强免疫原性决定簇的活性或免疫原性，赋予决定簇的稳定性，延长其血清半寿期。所述载体可以是本领域技术人员已知的任何适当的载体，例如蛋白。载体蛋白可以是如下蛋白，但不限于此，这些蛋白是匙孔血蓝蛋白，血清蛋白如转铁蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，甲状腺球蛋白或卵白蛋白，免疫球蛋白，或激素，如胰岛素或棕榈酸。对人进行免疫时，所述载体必须是对人而言生理上可接受的，并且是安全的载体。但在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是适当的载体。另外，所述载体可以是葡聚糖例如琼脂糖。
本发明的免疫原性决定簇以及集合素和/或集合素同系物可制备成中性的或盐形式的疫苗。可药用盐如酸加成盐是与肽的游离氨基形成的盐，并且是与无机酸如盐酸或磷酸，或如下的有机酸如醋酸，草酸，酒石酸，马来酸或本领域已知的其它有机酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以得自无机碱如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁等，并可得自如下的有机碱如异丙胺，三甲基胺，2-乙氨乙醇，组氨酸普鲁卡因和本领域已知的其它有机碱。
本发明的组合物可以是适合肠胃外给药的药物组合物。所述组合物优选包含水性或非水性无菌注射溶液以及水性或非水性无菌悬浮剂，所述无菌注射溶液中可包含润湿试剂或乳化试剂，抗氧化物，pH缓冲剂，抑制细菌的化合物和使制剂与体液，优选与特定个体的血液等渗的溶质；所述无菌悬浮剂中可包含悬浮剂或增稠剂。所述药物组合物可以存放在单位剂量的容器中或多剂的容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，还可以冻干储存，只需要在使用前添加无菌液体。
优选，本发明的组合物包含一种或多种适当的药用赋形剂，这些药物赋形剂可以是非无菌或无菌的，用于细胞，组织或生物体，如适合给药个体的药物赋形剂。所述赋形剂可包括但不限于盐水，缓冲的盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇以及不同用量的这些赋形剂的组合。在一个实施方案中，所述稀释剂是弗氏完全佐剂。制剂的制备应该适合给药的方式。本发明进一步涉及包含有一个或多个容器的组配药盒，所述容器中装有一种或多种本发明前述组合物的成分。非水性赋形剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如乙基油酸酯。
优选，将本发明的药物组合物制备成可注射的形式，如制备成液体溶液(liquid solutions)或悬浮液；另外，还可制备成适合在注射前配成溶液或悬浮液的固体形式，这也包括在本发明的范围内。可以使所述制剂乳化，或者将本发明的免疫原性决定簇以及集合素和/或集合素同系物都包裹在脂质体中。
给药方法包含免疫原性决定簇和集合素和/或集合素同系物的本发明的组合物或药盒，可以以适合在所述个体内诱导期望的免疫应答的方式和剂量，给药需要所述组合物或药盒的个体，这对本领域技术人员而言是已知的。
所述免疫原性决定簇和集合素和/或集合素同系物，可作为分开的制剂或以单位剂量组合的形式，同时或顺序给药。优选，所述免疫原性决定簇和集合素和/或集合素同系物同时给药，更优选免疫原性决定簇和集合素和/或集合素同系物以单位剂量形式组合。
本发明的所述组合物或药盒可以单独给药或与其它化合物，如治疗化合物联合给药。
给药方法可以是例如肠胃外注射，快速输注，鼻咽吸收，皮肤吸收和肠内如经口给药。肠胃外注射可以是例如静脉内注射，肌肉内注射，皮内或皮下注射。优选，所述给药是通过注射肠胃外给药，更优选是肌肉内或皮下注射，最优选是在周边解剖部位，如人的周边解剖部位，例如手臂，臀部或腿的皮下注射。
本发明的组合物或药盒的给药次数和每次给药的间隔大多取决于免疫原性决定簇的性质。
然而，本发明的组合物或药盒优选给药有此需要的个体至少一次，如至少二次，例如至少3次，如4次左右，例如5次左右。优选，所述给药是3次左右。
优选，在2次给药之间间隔至少一天，如至少2天，例如至少3天，如至少5天，例如至少1周，如至少2周，例如至少1个月，如至少6个月，例如至少1年，如至少2年，例如至少3年，如至少5年，例如至少10年。
在本发明的一个实施方案中，本发明的一种或多种集合素和一种或多种免疫原性决定簇在给药前与其它的补体因子预先孵育。所述其它的补体因子可以是例如C2，C3，C4或C5。
需要所述给药的个体包括易受感染影响的任何动物，优选任何哺乳动物，包括人，所述感染优选病毒感染，细菌感染，真菌感染或寄生虫感染。更优选所述感染历经上述提及的一种或多种临床疾病。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含选自MBL或MBL同系物的集合素，需要所述给药的个体优选是血清MBL水平下降的个体，更优选是MBL缺陷的个体。血清MBL水平下降例如少于500ng/ml，如少于400ng/ml，例如少于300ng/ml，如少于200ng/ml，例如少于100ng/ml，如少于50ng/ml。但易受感染影响的任何个体都是需要所述给药的个体。
实施例实施例1该实施例显示，含有低水平MBL的个体与正常对照个体相比，具有较低水平的成熟抗体。
材料和方法血清样本血清得自具有纯合C2缺陷的20名成年人(年龄在16岁以上)和20名健康的血液捐赠者。通过火箭电泳确定血清中选择性C2的缺陷，且大部分病例在分子遗传基础上经过进一步鉴定39。所有血清分成等份在-80℃保存。另外的对照组(n＝20)由含有低浓度MBL19和正常C2的健康人组成。
细菌抗原鼠伤寒沙门氏菌(血清型BO-4，12)SH4809辛糖聚丙烯酰胺偶联物，汤普森氏沙门氏菌(Salmonella Thompson)(血清型CO-6，7)IS40癸糖聚丙烯酰胺偶联物以及肠炎沙门氏菌(血清型DO-9，12)SH 1262辛糖聚丙烯酰胺偶联物，依照Chernyak等所述制备40。制备成的偶联物称为BO，CO和DO。
缓冲液包被缓冲液50mM碳酸盐缓冲液，pH9.5用于沙门氏菌属的寡糖；磷酸缓冲的盐溶液，pH7.2(PBS)用于肺炎球菌多糖和单克隆抗体。洗液包含0.05％吐温(PBS-T)的PBS或包含0.05％吐温(PBS-T)的Tris缓冲的盐溶液pH7.4(TBS)。MBL检测中的稀释缓冲液含有5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的TBS-T。封闭和稀释缓冲液包含1％牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA)。
免疫球蛋白试剂山羊抗人IgG碱性磷酸酶偶联物(γ链特异性的F(ab′)2片段，产品序号A-3312 Sigma Biosciences，St.Louis，MO，U.S.A.)；山羊抗人IgM碱性磷酸酶偶联物(μ链特异性的F(ab′)2片段，产品序号A-1067，Sigma)；山羊抗人IgA碱性磷酸酶偶联物(α链特异性的F(ab＇)2片段，产品序号A-3062，Sigma)；山羊抗人Ig(Fab特异性的F(ab′)2片段，产品序号1-3266，Sigma)；编号为X 0908的人血清蛋白校准物(DAKO，Glostrup，丹麦)；小鼠单克隆抗MBL(克隆131-1，1gG1，κ.Statens Serum Institut，Copenhagen，丹麦)；对照小鼠IgG1，κ，M 7894，Sigma)。
沙门氏菌BO，CO和DO的抗体的参照血清为了易于评估结果，抗沙门氏菌属抗原的抗体浓度依照Guttormsen等所用原则以mg/L表示41。因此，在酶联免疫吸附试验(ELISA)系统中抗原固定的抗体的量，通过与人血清蛋白校准物所获得的结果(其中，免疫球蛋白通过Fab特异性抗体固定到固相上)相比较来测定。对照试验用已知浓度的IgA1和IgA2的κ和λ骨髓瘤蛋白和所述校准物进行，以保证Fab特异性抗体以可比较的效力与不同的免疫球蛋白结合，并且在所用的血清稀释物的抗Fab结合位点处没有明显的竞争。
指定针对沙门氏菌BO，CO和DO的特异性IgM和IgG抗体的浓缩物为选择血清，用作之后的操作参照血清。进行校正时，将微量滴定板(Nunc-Immunoplates，Maxisorp，A/S Nunc，Kamstrup，丹麦)的一部分用Fab特异性的山羊F(ab′)2(0.05ml，1000ng/孔)包被，而该微量滴定板的另一部分用沙门氏菌BO，CO或DO抗原(0.05ml，100ng/孔)包被，4℃过夜。每一血清样品用三个孔，其中的二个孔包被，一个孔不包被。洗涤之后，各孔用PBS-BSA封闭2小时，然后再洗涤。将适当稀释的人血清蛋白校准物加入到包被有Fab特异性抗体的所述部分的微量滴定板中。然后将含抗所述沙门氏菌抗原的抗体的选择血清进行连续稀释，再将该稀释液加入到包被有沙门氏菌BO，CO或DO的孔中(图1)。在室温下孵育2小时然后洗涤，再加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgM(1∶1000)或IgG(1∶10,000)。在室温下孵育该微量滴定板2小时。然后用对硝基苯磷酸酯(1mg/ml)的二乙醇胺溶液(pH9.8)在室温下显色60分钟。用Multiskan Plus光度计(Labsystems Ltd，Helsinki，芬兰)在405nm检测吸光度。用包被孔的平均吸光度值减去未包被孔的背景吸光度值得出样本值。绘制人血清蛋白校准物的吸光度值对应于各稀释液的IgG浓度的曲线图，同时绘制特定抗体的吸光度值对应于血清稀释液的曲线图。这两条吸光度曲线的平行部分用于计算操作参照血清中特定抗体的浓度(图1)。IgM和IgA的浓度计算也用同样的方法。
针对沙门氏菌BO，CO和DO的抗体针对沙门氏菌BO，CO和DO的IgM和IgG抗体用以上所述的ELISA法测定。进行分析时血清样品以1∶100稀释还是以更高稀释度稀释取决于抗体的浓度。每块微量滴定板都作操作参照血清的校正曲线。抗体的浓度以mg/L表示。
MBL的浓度用ELISA检测MBL。通用的检测步骤在此之前已有描述42，其是在单克隆抗MBL(克隆131-1)用作捕获抗体和生物素化的第二抗体的基础上进行的。另一小鼠IgG1κ蛋白用于包被背景对照孔。含低MBL的组的MBL也通过时间分辨免疫荧光检测法(TRIFMA)来测定19。简言之，将血浆或血清的稀释物加入到包被有单克隆抗MBL(克隆131-1)的微量滴定板孔中。孵育并洗涤后，用铕标记的第二单克隆抗MBL显影。结合的铕在时间分辨荧光计上检测。校准物血浆用纯化的MBL制品校正，所述MBL制品已经过定量氨基酸分析。相同的校准物用于ELISA和TRIFMA测定。
统计学分析用双尾Mann-Whitney检验和Spearman秩相关检验(Spearman rank correlation test)进行统计学分析。
结果和讨论本研究的重要发现是C2缺陷组和对照组相比抗沙门氏菌CO抗原的IgG抗体的浓度有显著差异(p＜0.001)。中值分别是＜0.05mg/L和0.54mg/L(图2)。对照组抗BO的IgM抗体的浓度高于C2缺陷组(p＜0.05)，抗CO和DO的IgM抗体也具有类似的趋势(图2和图3)。我们认为在C2缺陷组中对CO的IgM和IgG应答之间的差异是由于同种型转换受到影响而引起的。
不同亚类的IgM向IgG的同种型转换以IgG3和IgG1，然后IgG2和IgG4的顺序进行，与重链基因座的编排一致。在个体发育期间同种型浓度逐渐增加，IgM，IgG3和IgG1在早年便达到成人水平，相反IgG2和IgG4的发育却很慢44， 45，这提示所述转换过程在免疫系统的成熟过程中是可操作的。在先天性C3缺陷和C1，C2或C4缺陷时，血清IgG2和IgG4亚类的浓度显示低于正常，这提示C3和功能性的经典途径可促进这个过程46。对于特定抗体而言，C3缺陷患者有低水平的抗肺炎链球菌混合荚膜多糖的IgG47。相反，在C1，C2或C4缺陷患者中，特异性的IgG水平大多是正常的。
上述对沙门氏菌CO应答的发现，第一次清楚地提示，在免疫系统成熟过程中，特定抗体的IgM/IgG转换存在着依赖于MBL途径C3转化酶的不良影响。
沙门氏菌CO不同于BO和DO之处在于其与MBL的反应性38。MBL识别糖结构如N乙酰葡萄糖胺和甘露糖，并被认为通过由MBL/MASP1/MASP2复合物活化经典途径的C3转化酶C4bC2a来募集C37。在我们的研究中，C2缺陷组对CO的不良IgG应答可能涉及凝集素途径依赖的机制这一推断促进了对血清中MBL的分析，以及对低MBL水平组的针对CO的抗体应答的补充研究。
用ELISA对三类人的MBL进行检测(图4)。健康对照和C2缺陷的人的MBL浓度都在相同的范围内。低MBL组MBL值的范围用TRIFMA检测是6到80mg/L，用ELISA检测的值是在＜15和130mg/L之间。我们注意到，对两种血清用上述方法检测的结果存在中度的差异。
MBL水平当与抗CO的特异性IgG相比较时，明显发现C2缺陷组中应答的下降不与低MBL浓度有关(图4，a和b)。非选择对照组中也有2名成员的MBL水平极低(＜15mg/L)，并且也显示不良的抗CO IgG应答。
一个重要的发现是，抗CO的特异性IgG浓度在低MBL组中一直很低，中值在0.11mg/L(图4，4c)。在进行统计学分析时，低MBL的上述两个非选择对照也包括在低MBL组中。与健康的MBL足量的对照(n＝18)相比，低MBL的人(n＝22)抗CO的特异性IgG的浓度明显下降(p＜0.01)。与C2缺陷组一样，低MBL组抗CO抗原的特异性IgM的浓度正常。
Lutz49近来对针对非己的初次免疫应答进行了论述，他指出包含抗原和天然抗体的补体活化型免疫复合物的形成在体内可能起着重要的作用。这一观点对胸腺依赖型抗原和一些胸腺非依赖型抗原来说是有确实根据的。在本研究中，发现抗BO的IgM抗体在C2缺陷组中是相当低的(图3)，但该发现并不提示经典途径在激发IgM应答中起作用。
如果继发于补体机能障碍的免疫应答下降导致与C3募集障碍相关的疾病中出现的免疫性下降，则上述问题便出现。重要的是，当抗原以低浓度存在时，对胸腺非依赖型抗原的免疫应答表面看来主要需要补体24，34，50。
对糖的免疫性的成熟在个体发育过程中发育较慢51且可能部分取决于暴露于低剂量抗原时产生的一系列亚临床免疫事件。因此，可以想象，补体缺陷可延缓免疫性的建立。另一方面，在C335，36和备解素(替代活化途径的成分)36，52缺陷时，对多糖的接种产生的不同的应答已得到证实，且这种不同应答也可能出现在经典途径缺陷的状态下。
以上结果指出了在C2缺陷情况下对一些糖抗原的免疫应答的障碍。这提示在免疫系统成熟过程中，在同种型转换方面，MBL途径的参与是相当重要的。
补体机能障碍对免疫应答的影响似乎反映出固有免疫和获得性免疫之间的有趣的联系，且这种影响在先天和获得性补体缺陷情况下对免疫性的建立而言具有临床意义。
实施例2建立转基因小鼠，其中通过同源重组使两种MBL基因，MBL-A和MBL-C中的一种沉默。饲养这些小鼠，并通过交叉繁殖产生双MBL缺陷型小鼠。
将小鼠如下分组●MBL缺陷组●MBL充足组(野生型)●用MBL重建后的MBL缺陷小鼠用如下物质免疫每组小鼠1)多糖(纯化自酵母的甘露聚糖)2)基于多糖的肺炎球菌疫苗(Pneumovax II)；3)糖蛋白(卵白蛋白和/或HbsAg)4)卵白蛋白和/或HbsAg，其中糖已通过糖苷酶的处理除去5)新糖蛋白(neoglycoproteins)(血清白蛋白，其已通过糖的化学偶联糖基化)6)表达糖基化包膜蛋白的完整的被有包膜的病毒(甲型流感病毒)7)在向培养基中加入衣霉素阻止糖基化的情况下生长的甲型流感病毒。
每种抗原以每剂10ng-10μg的量给予。进一步地，给药的每种抗原预先与MBL混合或不混合。给药的MBL是纯化的，重组的人MBL，其是按照国际专利申请00/70043所述而制备的。以不同的剂量给药MBL，所给药的MBL的剂量从与所述抗原的剂量相同到超过抗原剂量的10倍。
所述抗原和/或MBL皮下给予，给予的抗原和/或MBL预先吸附了非特异性佐剂氢氧化铝或没有预先吸附非特异性佐剂氢氧化铝。用相同的抗原免疫每个动物两次，在第一次免疫和第二次免疫之间相隔一个月。在第一次免疫后饲养小鼠两周和第二次免疫后一周，制备血清，检测抗体。
用ELISA评估抗体的应答。首先，用抗原包被96孔微量滴定板，然后加入1/100-1/1,000,000稀释的小鼠血清，洗涤之后，加入碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠Ig(H链和L链)对结合的小鼠抗体进行定量。确定抗体滴度，即能达到30％的最大结合的稀释度，并比较不同组之间的抗体滴度。
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权利要求
1.一种疫苗组合物，其包含有效量的至少一种集合素和/或集合素同系物和至少一种免疫原性决定簇。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述至少一种集合素和/或集合素同系物包含至少一个亚单位，如2个亚单位，例如3个亚单位，如4个亚单位，例如5个亚单位，如6个亚单位。
3.权利要求1的疫苗组合物，其中所述集合素和/或集合素同系物包含多个集合素和/或多个集合素同系物的混合物，它们分别包含不同数量的亚单位。
4.权利要求2的疫苗组合物，其中每个所述亚单位包含3个单独的集合素多肽链。
5.权利要求4的疫苗组合物，其中每个所述集合素多肽链包含N末端区半胱氨酸丰富区，胶原蛋白样结构域，颈区和/或糖识别结构域(CRD)。
6.权利要求1的疫苗组合物，其中所述至少一种集合素选自SP-A，SP-D，CL43，共凝集素，CL1或甘露糖结合凝集素(MBL)。
7.权利要求1的疫苗组合物，其中所述集合素是MBL和/或MBL同系物。
8.权利要求7的疫苗组合物，其包含按照被接种个体每公斤体重1ng-1μg的MBL和用于接种的至少一种免疫原性决定簇。
9.权利要求7的疫苗组合物，其中包含按照被接种个体每公斤体重1ng-100ng的MBL和用于接种的至少一种免疫原性决定簇。
10.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL和/或MBL同系物是人MBL。
11.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL是天然存在的MBL。
12.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL纯化自哺乳动物血浆，最优选纯化自人血浆。
13.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL是重组的，表达自包含编码MBL多肽或其功能等效物的核苷酸序列的基因表达构建体，其中，该核苷酸序列与在天然状态下不与其相连的表达信号可操作地连接。
14.权利要求13的疫苗组合物，其中所述核苷酸序列是cDNA序列。
15.权利要求13的疫苗组合物，其中所述核苷酸序列是基因组DNA序列。
16.权利要求7的疫苗组合物，其中MBL是重组的，在选自如下的宿主中制备转基因动物，哺乳动物细胞系，包括人细胞系，昆虫细胞，酵母细胞，细菌细胞或植物。
17.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL是重组的，且至少50％的MBL寡聚物在用SDS-PAGE和/或Western印迹分析时，表观分子量大于200kDa。
18.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL是重组的，且至少95％的MBL寡聚物在用SDS-PAGE和/或Western印迹分析时，表观分子量大于200kDa。
19.权利要求7的疫苗组合物，其中所述MBL中MBL亚单位的四聚物，五聚物和/或六聚物与MBL亚单位的二聚物的比例至少是2∶1。
20.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是细菌抗原。
21.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性决定簇是多糖。
22.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是沙门氏菌抗原。
23.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是沙门氏菌O抗原。
24.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是肺炎链球菌抗原。
25.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是脑膜炎球菌抗原。
26.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是乙型肝炎病毒抗原。
27.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇是流感病毒抗原。
28.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇包含至少一种糖，该糖选自单糖，二糖，三糖或多糖。
29.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇包含至少一种糖，该糖选自单糖，二糖，三糖或多糖，而这些糖天然状态下不与所述免疫原性决定簇相连。
30.权利要求28的疫苗组合物，其中所述糖包含甘露聚糖。
31.权利要求1和7任一项的疫苗组合物，其中所述至少一种免疫原性决定簇与MBL偶联。
32.一种使个体被免疫以对抗免疫原性决定簇的方法，该方法包括给药所述个体至少一种集合素和/或集合素同系物和选自如下的至少一种免疫原性决定簇细菌，真菌，病毒或其它致病性的免疫原性决定簇或这些感染因子的任何衍生物。
33.权利要求32的方法，其中所述集合素是MBL和/或MBL同系物。
34.权利要求32的方法，其中所述集合素和/或集合素同系物和至少一种免疫原性决定簇以选自如下的形式给药静脉给药，肌肉给药，皮下给药或口服给药。
35.权利要求32的方法，其中所述集合素和/或集合素同系物和至少一种免疫原性决定簇以分开的制剂形式同时给药，或组合在一起以单位剂量的形式同时给药。
36.药用可接受量的至少一种集合素和/或集合素同系物在制备改善免疫应答的药物组合物中的用途，其中，所述的免疫应答是接种细菌，真菌，病毒和/或其它致病性免疫原性决定簇和/或这些感染因子的任何衍生物后的免疫应答。
37.权利要求36的用途，其中所述集合素是MBL和/或MBL同系物。
38.药用可接受量的至少一种集合素和/或集合素同系物和至少一种免疫原性决定簇在制备疫苗组合物中的用途，所述至少一种免疫原性决定簇选自细菌，真菌，病毒或其它致病性免疫原性决定簇或这些感染因子的任何衍生物。
39.一种组配药盒，其包含药用有效量的集合素和/或集合素同系物和用于免疫接种的至少一种免疫原性决定簇。
40.权利要求39的组配药盒，其中所述集合素是MBL和/或MBL同系物。
全文摘要
本发明提供了一种疫苗组合物，其包含集合素例如甘露糖结合蛋白(MBL)和免疫原性决定簇。本发明还描述了用所述组合物免疫个体的方法，以及集合素在制备疫苗组合物中的用途。
文档编号A61K39/39GK1487839SQ01822291
公开日2004年4月7日 申请日期2001年11月27日 优先权日2000年11月27日
发明者詹斯·C·詹斯尼厄斯, 安德斯·肖霍姆, 肖霍姆, 詹斯 C 詹斯尼厄斯 申请人:詹斯·C·詹斯尼厄斯, 安德斯·肖霍姆, 詹斯 C 詹斯尼厄斯