编码血管生成基因的副粘病毒载体及其应用的制作方法

专利名称：编码血管生成基因的副粘病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码血管生成基因的副粘病毒载体及其应用。
背景技术：
近年来开展了用诱导血管生成的生长因子治疗缺血性疾病方面的研究。例如，研究了成纤维细胞生长因子2(FGF2)(Baffour，R.等，J.Vasc.Surg.16(2)181-91，1992)和内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor(ECGF))(Pu，L.Q.等，J.Surg，Res.54(6)575-83，1993)对心肌梗塞和急性肢体缺血的疗效。最近的研究显示，血管内皮生长因子(VEGF)/血管透过因子(vascular permeability factor；VPF)在心肌缺血和肢体缺血的动物模型中促进血管形成(Takeshita，S.等，Circulation 90(5 Pt 2)II228-34，1994；Takeshita，S.等，J.Clin，Invest.93(2)662-70，1994)。
最近开始了将诱导血管生成的生长因子用于人基因治疗的临床试验，也研究了人基因治疗在缺血肢体血管生成治疗中的临床应用。人们认为内皮细胞特异性生长因子——血管内皮生长因子/血管透过因子(VEGF/VPF)是实现上述目的的潜在治疗基因，实际上，已经有报告指出其在通过质粒载体将基因导入人体的基因治疗中有较好的疗效(Baumgartner，I.，等，Circulation 97，1114-1123(1998)；Isner，J.M.，等，J.Vasc.Surg.28，964-973(1998))。但是，质粒介导的肌肉内基因导入及其表达效率并不高，现在几乎没有关于肌内给与VEGF基因的有害副作用或毒性水平的报告。最近的报告指出，转基因(Thurston，G.，等，Science 286，2511-2514(1999))或腺病毒(Thurston，G.，等，Nature Med.6，460-463(2000))介导的VEGF的过度表达引起导入了基因的动物的血管生成异常，另外，质粒介导的VEGF基因导入在人的缺血肢体中引起一过性的浮肿(Baumgartner，I.，等，Circulation 97，1114-1123(1998)；Isner，J.M.，等，J.Vasc.Surg.28，964-973(1998))，但这些病理现象的详细机理尚不明确。另外，VEGF的过度表达破坏了血管生成信号的平衡，从而可能形成血管瘤样的脆弱毛细血管(Carmeliet，P.，NatureMed.6，1102-1103(2000))。当在体内将VEGF基因导入血管壁时，血管瘤样的内皮生长使新生内膜明显肥厚，可能导致红血球溢出(extravasation)血管外(Yonemitsu，Y.，等，Lab.Invest.75，313-323(1996))。在心肌中使逆转录病毒介导的VEGF持续过度表达时也观察到同样的病理现象(Lee，R.J.，等，Circulation 102，898-901(2000))。另外，从临床适用性方面考虑，局部表达的上述血管生成因子渗漏到全身循环系统的水平是个极其重要的问题，这种渗漏引起的意外的血管生成并发症可能导致糖尿病性视网膜病或肿瘤生长。
另一方面，急性主动脉闭塞导致的急性重症肢体缺血主要是由血栓性闭塞引起，是治疗性血管生成的重要目标。急性重症肢体缺血的后期疗效很不理想，多导致截肢。并且，截肢患者的长期预后不好，术后一年生存率只有50％。质粒介导的基因表达水平低，因此对更严重的急性动脉闭塞的疗效尚不明确。

发明内容
本发明的目的是提供编码血管生成基因的副粘病毒载体及其用途。具体地，本发明提供编码血管生成基因的副粘病毒载体，含有该载体的血管生成组合物以及利用该载体促进缺血组织血管生成的方法。
本发明人的预备研究中，导入以质粒为基础的VEGF165基因没能挽救急性重症肢体缺血的小鼠模型的肢体(省略数据)。为了确证能否通过增强转基因的表达而获得更好的结果，本发明人用在多种器官中能高效导入基因的重组仙台病毒(SeV)介导的基因导入方法导入治疗基因。在实施例中，本发明人着眼于作为肢体缺血治疗工具的2种重组SeV载体，其中一种表达人VEGF165，另一种表达作为蛋白质给药显示血管生成作用的鼠成纤维细胞生长因子FGF2(也称作bFGF)(Baffour，R.等，J.Vasc.Surg.16181-191(1992))。用上述载体进行实验，研究(1)SeV介导的肌内基因导入中导入基因的表达水平及其动力学，(2)血管生成因子的高水平表达是防止急性重症缺血肢体的坏死还是反而起有害作用，(3)在肌内高水平表达的血管生成蛋白是否渗漏到全身循环系统。
用下述模型作为缺血模型从外骼骨动静脉到膝上大腿动静脉全部切除(重症缺血模型)的BALB/c nu/nu小鼠后肢脱落模型(auto-amputation模型)和按上述同法操作后由于生理性血管生成而使后肢不脱落的C57BL/6小鼠救肢模型(limb salvage模型)。构建表达人VEGF165、小鼠FGF2或萤光素酶的载体(分别为SeV-hVEGF165、SeV-mFGF2或SeV-萤光素酶)，在缺血手术两天前给予大腿肌肉和小腿肌肉，观察后肢状态至手术后10天。
将萤光素酶基因导入小鼠后肢骨骼肌时，与给与100μg质粒(相当于临床人用量200mg/60kg体重的25～50倍)的表达水平相比，SeV基因以5～120倍的高水平表达。在多种培养细胞中，SeV-hVEGF165和SeV-mFGF2的蛋白分泌水平都很高(50～500ng/105个细胞/24小时)。与非给药组(基线)相比，肌内给与SeV-mFGF2使FGF2水平提高5～100倍，而给与SeV-hVEGF165时FGF2的肌内表达有限(最大为基线的2倍)，内源性VEGF的表达显著增加。给与SeV-hVEGF165后第二天肌肉组织出现大面积坏死，促进了后肢脱落，而给与SeV-mFGF2在增加内源性VEGF表达的同时，对救肢具有明显疗效。两种情况下都没发现来自载体的蛋白明显渗漏到血清中(＜5pg/ml)。救肢模型中，非给药组、SeV-萤光素酶组和SeV-mFGF2组全部救肢成功，仅在SeV-hVEGF组中有1/3的小鼠后肢脱落。后肢脱落模型中，仅FGF2组的救肢效果好，其它组几乎全都后肢脱落。
本发明证明了肌内给与重组仙台病毒载体能显著增强转基因的表达。重组仙台病毒载体的表达为质粒载体的10～100倍，但发现急性重症肢体缺血的小鼠体内给与表达VEGF165的重组仙台病毒载体反而促进肢体脱落。给与SeV-hVEGF165诱发浮肿(实施例4，图8)，阻止缺血手术后的血流恢复(实施例5，

图11和12)，明显增加缺血导致的肢体脱落比率(实施例5，图9和10)，VEGF的强血管透过性增强作用可能是这些病理现象的原因之一。相反，给与表达FGF2的仙台病毒载体的疗效高。两组模型都没有检测出分泌到全身循环系统的重组蛋白，因此表明SeV-介导的FGF2治疗对其它器官的影响小，安全范围广。上述结果表明，在人的临床应用中，必须注意VEGF在特定的肢体状态中产生的不良作用。因此，在广范围内显示出安全性和疗效的FGF2基因治疗能成为安全的基因治疗系统。另外，本发明还证明了体内导入治疗基因的强有力工具——SeV载体的有效性，因此可能将其用于急性重症肢体缺血的临床治疗。
本发明涉及编码血管生成因子的副粘病毒载体及其用途，具体地，本发明涉及
(1)编码能表达的血管生成基因的副粘病毒载体；(2)(1)项记载的副粘病毒载体，其中血管生成基因为成纤维细胞生长因子2(FGF2)；(3)(1)项记载的副粘病毒载体，其中副粘病毒为仙台病毒；(4)缺失F基因的(1)项记载的副粘病毒载体；(5)血管生成组合物，其含有(1)项记载的副粘病毒载体或含有该载体的细胞和可药用载体；(6)用于处理缺血组织的(5)项记载的组合物；(7)肌内给药用的(5)项记载的组合物；(8)血管生成诱导方法，其包括给与(5)～(7)任意一项记载的血管生成组合物的步骤。
根据本发明，(1)肢体缺血诱导的内源性VEGF不是局部集中在肌肉中，而是扩散到全身循环系统，但本发明载体介导的VEGF165的表达不明显渗漏到全身循环系统；(2)即使表达水平比内源性FGF2高5～100倍，外源性FGF2也不明显扩散到全身循环系统；(3)FGF2的此表达水平诱导内源性VEGF的表达，显著增加肢体血流，表现出明显的救肢效果；(4)与FGF2相反，VEGF165的过度表达诱导肢体损伤。上述结果表明，FGF2适于临床应用，作为处理急性重症肢体缺血的治疗性血管生成因子，其安全范围广。另外，本发明还首次揭示导入VEGF165基因可能给肢体缺血带来严重副作用。
有趣的是，肢体缺血诱导的内源性VEGF不集中在肌肉中而扩散到全身循环系统。虽然已知缺血手术诱导内源性VEGF在肌肉和内皮细胞(EC)中的表达(Florkiewicz，R.Z.等，J.Cell.Physiol.162，388-399(1995))，本发明还首次公开了内源性VEGF诱导全身而不是局部血管生成反应的可能性实验数据。Asahara等指出VEGF的全身用药提高内皮前体细胞(endothelialprogenitor cells，EPCs)的移动性(Asahara，T.等，EMBO J.18，3964-3972(1999))，对肢体缺血的生理反应导致的侧支血管(collateral vessels)形成可能在某种程度上依赖于EPC介导的“血管生成样”新血管形成(“vasculogenesis-like”neovascularization)，而不是从现有血管释放的增殖性EC介导的局部血管生成(Isner J.M.，J.Clin.Invest.106，615-619(2000))。已经明确导入缺血肢体的VEGF的诱导不能带来足够的血流灌注，从而导致肢体脱落。在这种情况下，VEGF可能主要作为“血管透过因子”发挥作用，而不是“血管生成因子”。肌肉组织学观察发现VEGF165给药组出现更严重的肌肉间浮肿，这也支持了上述观点。
其次，根据本发明，单独实施FGF2基因治疗能有效治疗缺血肢体，这与体内内源性VEGF的功能相关。通过导入FGF2基因而在肌肉中产生的VEGF的总蛋白浓度与导入VEGF基因时相当，但FGF2基因治疗本身与VEGF基因治疗不同在于它显示充分的疗效。这些发现意味着在缺血肢体的治疗中，为了灌注必要的血液且不发生血管渗漏，在成熟血管形成的过程中不仅需要VEGF，FGF2也是必需的。对VEGF诱导的未成熟血管的渗漏具有抑制作用的血管生成因子——血管生成素-1可能对此有贡献。
SeV-VEGF165在体外分泌基因产物的水平与SeV-FGF2相同，但注入体内肌肉中的SeV-VEGF165的表达水平不同于SeV-FGF2或SeV-萤光素酶，其理由完全不知。与组织学分析一样，激光多普勒灌注图像(LDPI)分析中也显示肌肉组织严重损伤和血液灌注少，因此，VEGF165诱导的浮肿等组织损伤可能损害微管蛋白(Moyer，S.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，5405-5409(1986))和磷酸甘油酸激酶(Ogino，T.，等，J.Biol.Chem.274，35999-36008(1999))等SeV介导的转录的细胞机制。或者，可能由于较低水平的内源性VEGF165基因的表达(约200pg/g肌肉)在重症缺血肌肉中显著增加(1,400pg/g肌肉)，促进肢体脱落。上述结果有力地表明，肌肉中VEGF浓度升高，例如即使在约两倍于基线的低水平，也可能导致重症肢体缺血。
血管生成是一个协调很好的过程，有许多因子参与，其中，VEGF的生物学功能有高度的用量依赖性，即使只缺失一个等位基因也能导致致命的缺失(Carmeliet，P.等，Nature 380，435-439(1996))。血管完善和成熟的全过程中，VEGF必须持续表达，VEGF的一过性表达只诱导短时间的血管生成反应(Pettersson，A.等，Lab.Invest.80，99-115(2000))，并且VEGF诱导的毛细管样结构基本上不与现存的血管相联(Springer，M.L.，等，Mol.Cell 2，549-558(1998))。因此，本发明的结果表明，当没有足够的FGF2存在时，肌肉中的VEGF浓度上升两倍，可能出现严重的毒性。综合以上考虑，虽然VEGF在治疗性血管生成中具有很大的临床潜力，但使用VEGF时应该比以往更加注意。另外，还证明了将FGF2基因导入肌肉内对急性重症肢体缺血的救肢安全且有显著疗效。
本发明中，术语“副粘病毒载体”是指衍生自副粘病毒并可将基因导入宿主细胞的载体。本发明的副粘病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染力的病毒颗粒。术语“感染力”是指重组副粘病毒载体通过保持其细胞粘附和膜融合能力，将载体内部的基因导入该载体所粘附的细胞的能力。本发明的副粘病毒载体可以具有复制能力，也可以是不具有复制能力的缺陷载体。本文中，“复制能力”是指病毒在感染了该病毒载体的宿主细胞中复制并产生感染性病毒颗粒的能力。可以用例如来自猴肾脏的细胞株LLC-MK2或CV-1等研究复制能力。
本说明书中，“重组”副粘病毒载体是指通过基因操作构建的副粘病毒载体或其扩增产物。例如，重组副粘病毒载体可以通过重组副粘病毒cDNA的重建来制备。
本发明中，“副粘病毒”是指属于副粘病毒科的病毒或其衍生物。适用于本发明的副粘病毒包括副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、牛瘟病毒、温热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒的I、II和III型等。本发明的病毒优选副粘病毒属的病毒或其衍生物。适用于本发明的副粘病毒属病毒包括例如人副流感病毒I型(HPIV-I)、人副流感病毒III型(HPIV-III)、牛副流感病毒III型(BPIV-III)、仙台病毒(也称作小鼠副流感病毒I型)和猴副流感病毒X型(SPIV-X)和其它大多数副粘病毒属病毒，本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可以是天然株、野生株、突变株、实验室传代株和人工构建株等。DI颗粒(J.Virol.，1994，68，8413-8417)等不完整病毒、合成的寡聚核苷酸等也可以作为制备本发明病毒载体的材料。
编码副粘病毒蛋白的基因包括NP、P、M、F、HN和L基因。“NP、P、M、F、HN和L基因”分别指编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和大分子蛋白的基因。副粘病毒亚科中每种病毒的基因通常表示如下，NP基因通常也描述为“N基因”。
副粘病毒属(Paramyxovirus)NP P/C/V M F HN -L风疹病毒属(Rublavirus) NP P/V M F HN (SH) L麻疹病毒属(Morbillivirus)NP P/C/V M F H -L例如，核苷酸序列数据库中，归类为副粘病毒科呼吸道病毒属的仙台病毒，其NP基因的录入号是M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218；P基因的是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008；M基因的是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056；F基因的是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131；HN基因的是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131；L基因的是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。
本发明中，术语“基因”是指遗传物质，包括RNA和DNA等核酸。基因可以编码或不编码蛋白，可以编码核酶或反义RNA等功能性RNA。基因可以是天然序列或人工设计的序列。此外，本发明中，术语“DNA”包括单链DNA和双链DNA。
本发明提供编码血管生成因子的副粘病毒载体及其用途。本发明人证明了通过体内肌内给与编码血管生成因子的副粘病毒载体能使给药部位的转基因高水平地表达。本发明人进行的小鼠缺血后肢的救肢实验结果表明，通过给与编码血管生成因子(FGF2)的重组副粘病毒载体，能防止缺血组织坏死和预防后肢脱落。上述载体在缺血组织中能有效诱导血管生成和防止坏死，因此，本发明的载体适用于缺血疾病的基因治疗。
另外，本发明人发现通过重组副粘病毒载体肌内给与的基因能持续表达1～2周。这一结果表明利用重组副粘病毒载体进行基因治疗时能获得持续的疗效。并且，由肌内给与的重组副粘病毒载体表达的血管生成因子在全身循环系统未被检出，在靶组织以外的组织不产生不良副作用。因此，根据本发明，副粘病毒载体在血管生成基因的导入中具有多种优点，这可能给靶向缺血组织的基因治疗等带来巨大的进步。
从安全性考虑，由于副粘病毒载体对人无致病性，这意味着它优选用于人类基因治疗的临床试验中。首先，质粒DNA介导的外源基因的表达中，导入的DNA必须转运到核内或其核膜必须消失，这成了提高基因表达成功率的主要障碍。但在仙台病毒等情况中，外源基因的表达由细胞质中的细胞微管蛋白及其本身所具有的RNA聚合酶(L蛋白)随着病毒基因组的复制而驱动。这表明仙台病毒不与宿主染色体相互作用，一般认为不会出现由染色体异常引起细胞癌化等安全性方面的问题。其次，已知仙台病毒对啮齿动物具有致病性，能引发肺炎，但它对人体没有致病性。证据之一是，将野生型仙台病毒鼻内给予非人灵长类不造成严重伤害(Hurwitz J.L.等，Vaccine，1997，15，533-540)。这些特征提示仙台病毒载体可以应用于人类治疗中，它还有望成为血管生成因子基因治疗的一种选择。
本发明中，血管生成基因是指编码直接或间接促进血管生成(angiogenesis)和/或血管形成(vasculogenesis)的因子的基因。该因子可以是蛋白质或肽，也可以是功能性RNA(核酶或反义RNA)等核酸。血管生成蛋白质包括酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)(也称作碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang)(包括Ang-1和Ang-2)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、TGF-β、血小板由来内皮生长因子(PD-ECGF)、血小板由来生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞/巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-8和一氧化氮合成酶(NOS)等(Klagsbrun，M.和D′Amore，P.，A.Annu.Rev.Physiol.53217-39，1991；Folkman，J.和Shing，Y.，J.Biol.Chem.267(16)10931-4，1992；Symes，J.F.和Sniderman，A.D.，Curr.Opin.Lipidol.5(4)305-12，1994)。
本发明优选的血管生成蛋白质可以列举aFGF、FGF2、Ang-1、Ang-2、EGF、TGF-α、TGF-β、PD-ECGF、PDGF、TNF-α、HGF、IGF、EPO、CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-8和NOS等，可以用编码选自上述蛋白的基因制备载体。
用于本发明的血管生成蛋白中，特别优选使新生的血管被从与间质细胞相连的新生内皮细胞分化出的成壁细胞包围的蛋白质，而不是通过VEGF诱导未成熟血管生成的蛋白。已知血管形成有三步(脉管形成、血管生成和血管成熟)，多种转录因子剔除实验结果表明，多种基因与成熟血管的形成相关，具体地，转录因子SCL/tal-1主要与脉管形成有关，HIF-1、Id、ETS-1、HOXD3、COUP-TFII和MEF2C与血管生成相关，进一步地，剔除LKLF(lungkruppel-like因子)或dHAND基因后，壁细胞不能发育，从而导致胚胎死亡。
因此，用于本发明的血管生成基因更优选诱导转录因子(包括LKLF和dHAND)的基因，该转录因子在未成熟间质细胞中与壁细胞的成熟相关。人们认为，FGF2的刺激与上述转录因子的诱导直接相关，或通过其它生长因子——血管生成素和HGF等促进间质细胞的增殖分化。
血管生成蛋白优选含有分泌该蛋白质的分泌信号。但是，FGF2等蛋白质即使不具有天然的典型分泌信号也能分泌到细胞外(参照实施例)，这些蛋白质不一定必须含有分泌信号。可以通过公知的方法制备编码上述血管生成因子的基因，例如采用根据碱基序列信息设计的引物的PCR等。特别优选用于本发明的血管生成因子可以列举FGF2，它在广范围的表达水平内都能稳定发挥疗效(Abraham，J.A.等，1986，EMBO J.52523-2528；Moscatelli，D.A.等，US 4994559；Baird，A.等，US 5155214；Isner，J.M.US 6121246；WO97/14307)。
载体所携带的血管生成基因即使与基因导入的目标个体不同源也能发挥效果，但优选与目标个体同源的基因。载体所携带的血管生成基因优选哺乳动物的血管生成基因，用于人时优选人的基因。
本发明编码血管生成基因的副粘病毒载体尤其对处理缺血组织有效，即通过本发明载体导入血管生成基因，由此可以促进血管生成，防止缺血导致坏死。在本发明中，对缺血组织无特殊限制，只要是已经或正缺血的组织，例如肌肉、脑、肾脏和肺。本发明载体可以治疗的缺血疾病包括脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、缺血性心肌病和心肌缺血等。本发明中，缺血组织处理是指缺血组织的治疗或缺血损伤的预防，具体是指防止缺血组织坏死，保持缺血组织存活，促进缺血组织中的血管新生，组织再生，或防止或减少缺血引起的损伤等。
本发明提供诱导血管生成的方法，其包括给与编码血管生成基因的副粘病毒载体的步骤。另外，本发明还提供处理缺血组织的方法，其特征在于给与编码血管生成基因的副粘病毒载体。对给药对象无特殊限制，例如包括人等目标哺乳动物等。另外，作为给药对象，可以特别列举非人的哺乳动物，具体地，诸如猴等的灵长类(原猿、真猿等阔鼻猿和狭鼻猿等类人猿等)，小鼠、大鼠和豚鼠等啮齿类和牛、狗、猫、马、羊、兔等。用本发明的载体可以治疗上述动物的缺血，或将上述动物作为人缺血治疗的模型(Morinaga，K.等，1987，J.Vasc.Surg.5719-730；Itoh，H.等，1994，Atherosclerosis 110259-270)。
本发明中，诱导血管生成的方法具体包括(1)诱导血管生成的方法，其包括给药编码血管生成基因的副粘病毒载体或含有该载体的细胞的步骤；
(2)(1)项记载的方法，其中血管生成基因是成纤维细胞生长因子2(FGF2)；(3)(1)或(2)记载的方法，其中给药为肌内给药；(4)(1)～(3)任意一项记载的方法，其中副粘病毒为仙台病毒。
本发明处理缺血组织的方法具体包括(1)处理缺血组织的方法，其包括给药编码血管生成基因的副粘病毒载体或含有该载体的细胞的步骤；(2)(1)项记载的方法，其中血管生成基因是成纤维细胞生长因子2(FGF2)；(3)(1)或(2)记载的方法，其中给药为肌内给药；(4)(1)～(3)任意一项记载的方法，其中副粘病毒为仙台病毒。
可以以体内或回体(ex vivo)方式给药。体内给药时，可以通过肌肉注射、皮下注射和导管给药等本领域技术人员公知的方法注入编码血管生成基因的副粘病毒载体。回体给药时，预先在体外将该载体导入细胞中，然后通过肌肉注射、皮下注射和导管给药等方法将导入了载体的细胞注入个体内。回体给药中所用的载体导入细胞可以与给药个体同源或不同源，但优选同源，更优选取自给药个体的细胞，进一步优选取自骨髓或血液的细胞，包括能形成或分化成血管内皮细胞的细胞(即血管内皮前体细胞)。通过给与药学上有效量的本发明载体能诱导给药组织的血管生成，因此，在脑、心脏、肾脏、肺和肢体等缺血时，能进行防止组织坏死和脱落的治疗。
另外，本发明还提供用于处理缺血组织的编码血管生成基因的副粘病毒载体的用途及其方法，具体地，本发明提供(1)用于处理缺血组织的编码血管生成基因的副粘病毒载体；(2)(1)项记载的载体，其中血管生成基因是成纤维细胞生长因子2(FGF2)；(3)肌肉给药用的(1)或(2)记载的载体；(4)(1)～(3)任意一项记载的载体，其中副粘病毒为仙台病毒。
另外，本发明还提供含有上述副粘病毒载体的用于处理缺血组织的组合物。除上述副粘病毒载体外，该组合物还可以含有所需的可药用载体。例如，可以将本发明的载体与生理溶液组合制成注射剂，或者，与固体或半固体物质(凝胶)组合制成体内植入剂。
本发明中，用于导入血管生成基因的副粘病毒载体无特殊限制，例如，合适的副粘病毒载体包括能复制和自我繁殖的载体。通常，天然型副粘病毒的基因组包含短的3′前导区，后随6个基因，分别编码N(核衣壳)、P(磷)、M(基质)、F(融合)、HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白，另一端有一段短的5′尾部区域。本发明能自我复制的载体可通过设计具有与上述相同结构的基因组而获得。另外，表达外源基因的载体可通过将外源基因插入上述载体的基因组而获得。本发明副粘病毒载体中，病毒基因的排列可以不同于野生型病毒。
本发明所用的副粘病毒载体可以缺失野生型副粘病毒中含有的某些基因。例如，重建仙台病毒载体时，一般认为由NP、P/C和L基因编码的蛋白本身是必需的，但本发明的病毒载体不一定必须包含编码上述蛋白的基因作为其组成。例如，携带编码上述蛋白的基因的表达载体可以与编码该载体基因组的表达载体共转染至宿主细胞中，由此重建病毒载体。或者，将编码载体基因组的表达载体导入携带有编码上述蛋白的基因的宿主细胞中，由该宿主细胞提供给上述蛋白，由此重建病毒载体。这些蛋白的氨基酸序列可以与来自起始病毒的序列不同，只要它们在核酸导入过程中具有与天然株相比等效或更强的活性，它们可以突变或者被另一种病毒的同源基因取代。
一般认为，由M、F和HN基因编码的蛋白是副粘病毒载体的细胞-细胞繁殖所必需的。但是，当副粘病毒载体为RNP形式时，不需要这些蛋白。如果RNP中的基因组包含M、F和HN基因，当其导入宿主细胞时，产生这些基因的产物，并产生具有感染性的病毒颗粒。产生感染性病毒的RNP载体可以列举含有编码N、P、M、F、HN和L基因的病毒基因组RNA和N蛋白、P蛋白和L蛋白的RNP。将上述RNP导入细胞后，在N蛋白、P蛋白和L蛋白的作用下，表达基因组被表达、复制，感染性病毒载体扩增。
可将RNP与转染试剂如脂转染胺(lipofectamine)和聚阳离子脂质体一起形成复合体再导入细胞中。具体地，可使用各种转染试剂，例如，DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)等。可加入氯喹以防止在核内体中的降解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。如果是复制型病毒，所产生的病毒可以通过再感染培养细胞、鸡卵或动物(例如小鼠等哺乳动物)等而扩增或传代。
缺乏M、F和/或HN基因的副粘病毒载体也可以作为本发明的副粘病毒载体。这些载体可以通过例如外源提供缺失的基因产物而重建。这样制备的病毒载体仍然可以像野生型病毒一样粘附于宿主细胞并诱导细胞融合，但子代病毒颗粒不具有与起始病毒相同的感染力，因为导入细胞的载体基因组缺乏上述基因中的一种。因此，这些载体可用作仅能进行一次基因导入的安全病毒载体。基因缺失是指该基因功能实质上已经丧失，该基因编码蛋白质时，是指与野生型蛋白质具有同等功能的蛋白质不表达。例如该基因不转录、该基因是功能丧失突变体或该基因缺失等。优选地，基因缺失是指该基因的密码子区域至少部分、优选全部缺失。例如，缺失F基因的载体优选F蛋白质的密码子区域部分、更优选全部缺失的载体。本发明中，F基因缺失载体更优选负链中缺失的F基因在3′侧翼部位进一步缺失起始信号序列，由此可以抑制缺失部位不必要的多肽的表达。当缺失部位存在编码不必要的多肽的开放阅读框架(ORF)时，优选通过定点诱变等方法除去该ORF(后述)。
制备F基因缺失型载体时，例如，可以将表达F基因缺失型重组副粘病毒载体基因组的质粒与F蛋白的表达载体以及NP、P/C和L蛋白的表达载体一起共转染至宿主细胞，由此重建病毒载体(WO00/70055和WO00/70070)。另外，例如也可以用将F基因整合到染色体的宿主细胞来制备。外源提供这些蛋白质时，其氨基酸序列可以与来自起始病毒的序列不同，只要它们在核酸导入过程中具有与天然型相比等效或更强的活性，它们可以突变或者被另一种病毒的同源基因取代。
可以制备下述载体其在包膜蛋白中，包含与载体基因组编码的病毒包膜蛋白不同的蛋白。对这种蛋白没有限制，可以包括其它病毒的包膜蛋白，如水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本发明的副粘病毒载体包括VSV-G等假型病毒载体，所述假型病毒载体带有源自基因组编码病毒以外的病毒的包膜蛋白。
本发明的副粘病毒载体在病毒包膜表面还包含下述蛋白，例如能粘附于特定细胞的粘附因子、配体和受体等蛋白，或者嵌合蛋白(其在病毒外表面包含上述蛋白质，在病毒的内侧包含病毒包膜衍生的多肽)，这样就能产生靶向特定组织的载体。这些蛋白质可以由病毒基因组自身编码，也可以在重建病毒载体时由病毒基因组以外的基因(例如其它表达载体或宿主细胞染色体的基因)表达来提供。
可以改变本发明病毒载体中所含的病毒基因，例如，为了降低抗原性或提高RNA转录效率或复制效率。具体地，可以改变复制因子NP、P/C和L基因中的至少一种，以增强转录或复制功能。结构蛋白之一的HN蛋白具有血凝素活性和神经氨酸酶活性，如果能减弱前一种的活性，则可能提高病毒在血液中的稳定性；改变后一种的活性则可能调节感染力。通过改变F蛋白(它参与膜融合)可以调节膜融合脂质体的融合能力。例如，对可能成为细胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的抗原呈递表位进行分析，由此可以制备抗原呈递能力减弱的副粘病毒。
本发明的副粘病毒载体还可以缺失辅助基因。例如剔除SeV的辅助基因之一V基因后，培养细胞中的基因表达或复制不受影响，但SeV对小鼠等宿主的致病性显著降低(Kato，A.et al.1997.J.Virol.717266-7272；Kato，A.et al.1997.EMBO J.16578-587；Curran，J.等，WO01/04272，EP1067179)。这样的减毒载体特别适合用作体内或回体基因导入用的病毒载体。
本发明的病毒载体可在基因组RNA中编码血管生成基因。可通过将外源基因插入副粘病毒载体基因组中来制备携带外源基因的重组副粘病毒载体。可以用需要在靶组织(缺血组织等)中表达的血管生成基因作为外源基因。外源基因可以是编码天然蛋白的基因，或者是编码通过缺失、取代或插入修饰天然蛋白所得的蛋白的基因，只要该修饰蛋白与天然蛋白有等效的功能。例如，为了进行基因治疗等目的，可以将目标疾病的治疗基因插入编码所述病毒载体基因组的DNA(病毒载体DNA)中。在将外源基因导入仙台病毒载体DNA的例子中，优选在转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间插入包含6的倍数的核苷酸的序列(Calain P.和Roux L.，J.Virol.，1993，67(8)，4822-4830)。可将外源基因插入病毒每种基因(NP、P、M、F、HN和L基因)的上游和/或下游。为了不干扰上游和下游基因的表达，可在外源基因上游或下游适当插入E-I-S序列(转录终止序列-间插序列-转录起始序列)或其一部分，在各基因之间设置E-I-S序列，或者，可借助IRES插入外源基因。
所插入的外源基因的表达水平可通过连接在所述基因上游的转录起始序列的类型来调节(WO01/18223)，也可通过插入点的位置和所述基因前后的碱基序列来调节。例如，在仙台病毒中，插入点越靠近病毒基因组负链RNA的3′-末端(野生型病毒基因组的基因排列中越靠近NP基因)，插入基因的表达水平越高。为了获得外源基因的高水平表达，优选将其插入负链基因组的上游区，如NP基因的上游(负链上的3′侧翼序列)，或NP与P基因之间。相反，插入点越靠近负链RNA的5′-末端(野生型病毒基因组的基因排列中越靠近L基因)，插入基因的表达水平越低。为了降低外源基因的表达水平，可将其插入负链上的5′最末端位置，即野生型病毒基因组的L基因下游(负链上L基因的5′侧翼区)或L基因的上游(负链上L基因的3′侧翼区)。这样，可以适当调整外源基因的插入位置，以便获得所需的基因表达水平，或者使插入子与其周边编码病毒蛋白的基因的组合最佳化。例如，给与高滴度病毒载体导致血管生成因子的高水平表达表现出毒性时，除了可以控制所给病毒的滴度外，还可以将血管生成基因的插入点设置在载体负链的5′-末端，或将转录起始序列替换成低效率的序列等，由此可以降低各病毒载体的表达水平，从而获得合适的疗效。
为了使外源基因易于插入，可以在插入位置设计克隆位点。例如，克隆位点可以是限制酶的识别序列。编码基因组的载体DNA中，限制性位点可以插入外源基因。所述克隆位点可以是包含限制酶识的多个别序列的多克隆位点。另外，本发明的载体还可以在上述插入位置以外的其它位置具有其它外源基因。对这些外源基因无限制，可以是其它血管生成基因或其它基因。
可以按照例如Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.，1997，782813-2820，KatoA.等，EMBO J.，1997，16578-587和Yu D.等，Genes Cells，1997，2457-466中记载方法，如下构建带有外源基因的重组仙台病毒载体。
首先，制备包含所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选此DNA样品在25ng/μl或更高的浓度可以通过电泳确认为单个质粒。下面是将外源基因插入病毒基因组DNA的NotI位点的一个实施例。如果目的cDNA核苷酸序列中包含NotI识别位点，优选事先用定点诱变法等改变核苷酸序列以除去该位点，但不改变所编码的氨基酸序列。从所述DNA样品通过PCR扩增回收所需的DNA片段。为了获得两个末端都带有NotI位点的扩增片段，并在其中一个末端添加仙台病毒转录终止序列(E)、间插序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)的一个拷贝，制备了作为引物对的正向DNA序列和反向DNA序列(反义链)，该引物对包含NotI限制酶识别序列、转录终止序列(E)、间插序列(I)、转录起始序列(S)和目的基因的部分序列。
例如，正向合成性DNA序列在5′-末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)，以确保用NotI消化。在该序列的3′-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3′-末端还添加任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔序列。进一步地，还在3′-末端添加ORF的约25个核苷酸的序列，它从所需cDNA的起始密码子ATG开始并包括ATG。优选地，从所需cDNA选取约25个核苷酸作为正向合成性寡DNA的3′-末端，使最后一个核苷酸为G或C。
反向合成性DNA序列在5′-末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)。在该序列的3′-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3′-末端还添加插入片断寡DNA以调节引物的长度。寡DNA的长度按下述方法设计包括NotI识别序列GCGGCCGC、cDNA的互补序列和后述源自仙台病毒基因组的EIS序列，核苷酸总数为6的倍数(所谓“6的法则”；Kolakofski D.等，J.Virol.，1998，72，891-899；Calain P.和Roux L.，J.Virol.，1993，67，4822-4830)。此外，在插入片断的3′-末端，进一步添加仙台病毒S序列的互补序列(优选5′-CTTTCACCCT-3′；序列号1)、I序列(优选5′-AAG-3′)、E序列的互补序列(优选5′-TTTTTCTTACTACGG-3′；序列号2)。进一步地，在该3′-末端添加所需cDNA的互补序列，使最后一个核苷酸为G或C，此最后一个核苷酸位于该cDNA终止密码子上游约25个核苷酸处，以此作为反向合成性寡DNA的3′-末端。
可以利用ExTaq聚合酶(TaKaRa)通过常规方法进行PCR。优选使用Vent聚合酶(NEB)，扩增了的目的片段用NotI消化，然后插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用自动DNA测序仪检测所得PCR产物的核苷酸序列，选出具有正确序列的质粒。通过NotI消化而将插入片段从该质粒上切下来，克隆至包含副粘病毒基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，不通过质粒载体pBluescript而将PCR产物直接插入NotI位点，也可以获得重组仙台病毒cDNA。
例如，可以根据文献记载的方法构建重组仙台病毒基因组cDNA(Kato，A.等，EMBO J.16578-598，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.，782813-2820，1997；Yu，D.等，Genes Cells，1997，2，457-466；和Li，H.O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000)。例如，首先将带有NotI识别位点的18bp间隔序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′；序列号3)插到克隆化仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与编码N-蛋白质的序列的5′-末端之间的相邻基因座上，得到带有源自δ肝炎病毒反基因组链的自我裂解性核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan M.K.等，J.General Virol.，1997，78，2813-2820)。将外源基因片断插入pSeV18+b(+)的NotI位点，能获得插入了所需外源基因的重组仙台病毒cDNA。
将按上述方法制备的重组副粘病毒载体DNA在试管或细胞中转录，在病毒的L、P和NP蛋白的存在下重建RNP，这样就能生成含有该RNP的表达载体。本发明提供编码血管生成基因的副粘病毒载体的制备方法，其包括在存在转录和复制本发明副粘病毒载体基因组的蛋白质的条件下，在细胞中转录编码该基因组的DNA的步骤和回收所得副粘病毒载体的步骤。转录和复制本发明副粘病毒载体基因组的蛋白质包括N、L和P蛋白质等。另外，本发明还提供含有上述DNA的用于制备本发明副粘病毒载体的DNA。本发明还涉及用于制备本发明副粘病毒载体的编码该载体基因组的DNA的用途。可以按照公知的方法由病毒载体DNA重建病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P.等，Virol.，1997，235，323-332；Whelan S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，8388-8392；Schnell M.J.等，EMBO J.，1994，13，4195-4203；Radecke F.等，EMBO J.，1995，14，5773-5784；Lawson N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，4477-4481；GarcinD.等，EMBO J.，1995，14，6087-6094；Kato A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Baron M.D.和Barrett T.，J.Virology，1997，71，1265-1271；Bridgen A.和Elliott R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，15400-15404)。用这些方法能从DNA重建所需的包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒等的副粘病毒载体。病毒载体DNA中缺失F、HN和/或M基因时，无法形成感染性病毒颗粒，但有可能将这些缺失基因和/或编码其它病毒包膜蛋白的基因从另一种病毒导入宿主细胞中并进行表达，从而能产生感染性病毒颗粒。
将载体DNA导入细胞的方法包括(1)制备能掺入所需细胞的DNA沉淀，(2)制备包含带正电的DNA的复合体，它适于掺入所需细胞并且具有较低细胞毒性，和(3)利用电脉冲在所需细胞胞浆膜上打开一个瞬时性小孔，其大小仅足以让DNA通过。
方法(2)中可以使用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法(1)中，可以用磷酸钙进行转染。在这种方法中，DNA以吞噬泡的形式被细胞摄入，但已知足量的DNA也能被摄入细胞核中(Graham F.L.和VanDer Eb J.，Virology.，1973，52，456；Wigler M.和Silverstein S.，Cell，1977，11，223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报道说(1)细胞和共沉淀物的温育条件为2～4％CO2，35℃，15～24hr，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，和(3)当沉淀混合溶液中DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen C.和Okayama H.，Mol.Cell.Biol.，1987，7，2745)。方法(2)适于瞬时转染。已知更早的方法是配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885 M.W.5×105)混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。方法(3)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(1)和(2)应用更广。可通过最优化脉冲电流的持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电性、DNA浓度和细胞密度使转染效力最大化。
在上述三种方法中，使用转染试剂进行的方法(2)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量样品，因此适用于本发明，转染试剂优选但不限于Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，#301305)和DOSPER LiposomalTransfection Reagent(Boehringer Mannheim #1811169)。
具体地，按下述方法从cDNA进行重建在24～6孔左右的塑料板或100mm Petri培养皿中，用极限必需培养基(MEM)将猴肾细胞LLC-MK2培养至70-80％铺满，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)。将表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3在1μg/ml补骨脂素的存在下于UV中暴露20分钟灭活，然后以2PFU/细胞的量感染细胞(Fuerst T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126；和Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)，可以适当调整补骨脂素的加入量和暴露于UV的时间长短。感染1小时后，将2-60μg(更优选3-5μg)上述重组仙台病毒cDNA和表达病毒蛋白的质粒(24-0.5μg pGEM-N、12-0.25μg pGEM-P和24-0.5μg pGEM-L，或更优选1μg pGEM-N、0.5μg pGEM-P和1μg pGEM-L)(Kato.A.等，GenesCells，1996，1，569-579)通过采用Superfect(QIAGEN公司)的脂转染方法等进行转染，所述表达病毒蛋白的质粒能用于产生全长仙台病毒基因组并且是必需的。在MEM中培养转染细胞，所述MEM不含血清，根据需要，可以仅含有100μg/ml利福平(Sigma)和优选浓度为40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞毒性最小而病毒的回收率最高(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)。转染后将细胞培养48-72hr，然后收集并通过三次冻融而裂解。用细胞裂解物转染LLC-MK2细胞，培养3天-7天，收集培养基。为了重建缺乏编码包膜蛋白的基因并且不能复制的病毒载体，可以用表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞进行转染，或与包膜蛋白的表达质粒一起转染。另一种方法是，将转染过的细胞覆盖在表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞的上层并进行培养，使缺陷型病毒载体繁殖(参照WO00/70055和WO00/70070)。培养上清中所含病毒的滴度可通过测定血凝素活性(HA)来确定。HA可通过“内点稀释法”来测定(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Yonemitsu Y.和Kaneda Y.，Hemagglutinatingvirus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.，MolecularBiology of Vascular Diseases.Methods in Molecular Medicine，Baker A.H.，Humana Press编辑，1999，295-306)。为了除去可能混入的痘苗病毒vTF7-3，可以适当稀释(例如106倍)所得的尿囊液样品，在鸡卵中进行重扩增，重扩增可以重复3次或更多次。所得病毒可以在-80℃保存。
对用于重建的宿主细胞类型无特殊限制，只要所述病毒载体能在这些细胞中重建。宿主细胞包括来自猴肾的LLC-MK2细胞、CV-1细胞和来自仓鼠肾的BHK细胞等的培养细胞和来自人的细胞等。此外，为了获得大量仙台病毒载体，可以用从上述宿主细胞获得的病毒载体感染受孕鸡卵，从而扩增该载体。已经开发了用鸡卵制备病毒载体的方法(Advanced protocolsin neuroscience study III，Molecular physiology in neuroscience.，Nakanishi等编辑，Kouseisha，Osaka，1993，153-172)。具体地，例如，将受精卵在孵化器中37-38℃培养9-12天以形成胚。将病毒载体接种到尿囊腔，进一步将该受精卵培养数日使载体繁殖。可根据所用的重组仙台病毒类型的不同而改变培养时间等条件。然后，回收含有病毒的尿囊液。可以用常规方法从尿囊液样品中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro M.，Protocols in virus experiments.，Nagai和Ishihama编辑，MEDICAL VIEW，1995，68-73)。另外，大量生产下述的F基因缺失型仙台病毒时，优选抗胰蛋白酶的细胞(例如LLC-MK2细胞)。
可以如下构建和制备F基因缺失型仙台病毒载体(参照WO00/70055和WO00/70070)。
1、构建包含外源基因的F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA用SphI/KpnI消化SeV的全长cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997)(“pSeV18+b(+)”也叫“pSeV18+”)，回收消化片断(14673bp)。将消化片断克隆到pUC18，得质粒pUC18/KS，在此pUC18/KS上，联合应用PCR-连接反应来构建F基因缺失部位，除去F基因ORF(ATG-TGA＝1698bp)，用atgcatgccggcagatga(序列号4)填满空隙，由此构建了F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。PCR中，采用如下引物对F基因上游正向5′-gttgagtactgcaagagc(序列号5)，反向5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc(序列号6)；F基因下游正向5′-atgcatgccggcagatga(序列号7)，反向5′-tgggtgaatgagagaatcagc(序列号8)。将所得的PCR产物用EcoT22I连接。用SacI和SalI消化按上述方法获得的质粒，回收含有F基因缺失部位的片断(4931bp)并将其克隆到pUC18，得pUC18/dFSS。用DraIII消化所得的pUC18/dFSS，回收片断，用pSeV18+中包含F基因区域的DraIII片断置换，连接后得到质粒pSeV18+/ΔF。
F基因的EIS序列(SeV特异序列，E，末端；I，基因间；S，起始)残留在上述结构中。即使除去了F基因的下游ORF，该结构仍有可能表达由用于连接间隙的引物衍生的五肽。
用pUC18/dFSS中F基因缺失部位的NsiI和NgoMIV限制酶位点将外源基因插入F基因缺失部位。为此，例如，可以用末端为NsiI的引物和末端为NgoMIV的引物扩增外源基因片断。
例如，首先用PCR扩增EGFP基因以构建含有EGFP基因的cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)。为了使EGFP基因片断中核苷酸数量为6的倍数(Hausmann，S.等，RNA 2，1033-1045，1996)，用末端为NsiI的5′-引物(5′-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/序列号9)、末端为NgoMIV的3′-引物(5′-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/序列号10)进行PCR。用NsiI和NgoMIV限制酶消化PCR产物，从凝胶中回收片断，将其利用NsiI和NgoMIV限制酶位点连接到pUC18/dFSS中的F基因缺失部位后，测序。回收含有EGFP基因的DraIII片断，用pSeV18+/ΔF中包含F基因区域的DraIII片断置换、连接，得质粒pSeV18+/ΔF-GFP。
用pSeV18+/ΔF或pSeV18+/ΔF-GFP中的限制酶NotI识别位点将外源基因插入NP基因的上游。但是，当用pSeV18+/ΔF时，可能表达由连接F基因缺失部位的引物所衍生的五肽；当用pSeV18+/ΔF-GFP时GFP共表达。因此，如果必要，构建不表达上述肽和GFP的基因构建体，其方法如下用SalI和NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP，回收含有F基因缺失部位的片断(6288bp)，将其克隆到Litmus 38(New England Biolabs，Beverly，MA)，得LitmusSalINheIfrg/ΔF-GFP。用反向PCR使含有F缺失基因上游EIS序列的EGFP缺失。即，用含有GEP基因上游SexAI限制酶识别序列的反向引物(5′-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/序列号11)和含有GEP基因下游SexAI限制酶识别序列的正向引物(5′-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/序列号12)进行PCR。切除所需大小的片断(10855bp)并进行连接，使含有F缺失基因上游EIS序列的EGFP缺失。
但是，由于引物的设计，使所得构建体在两个SexAI位点之间插入了一个多余的15bp序列，因此，通过转化大肠杆菌SCS110株(dcm-/dam-SCS110株，因其中SexAI被甲基化，故不能被消化)制备质粒，用SexAI限制酶消化质粒后，回收1628bp和9219bp两个基因片断并进行连接，除去多余的15bp序列，构建出LitmusSalINheIfrg/ΔF(Δ5aa)，在该构建体中，包含F基因上游EIS序列的EGFP基因已缺失，所述缺失区域含有6的倍数个核苷酸。用SalI和NheI消化该质粒，回收片断，用包含pSeV18+中F基因区域的SalI/DraIII片断置换、连接，得质粒pSeV18+/ΔF(Δ5aa)。
用例如位于NP基因上游的NotI限制酶识别序列将外源基因插入该质粒。
2、构建含有hFGF2基因的F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA已知有多种获得人FGF2(hFGF2)cDNA的方法，例如，在征得患者本人同意的条件下，从大隐静脉采取血管平滑肌细胞，用RT-PCR从中分离cDNA，将其亚克隆到pBluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，CA)的HindIII(5′-末端)和EcoRI(3′-末端)，由此制备FGF2(hFGF2)cDNA。hFGF2 cDNA的序列与Abraham等报告的序列一致(Abraham，J.A.等，EMBO J.5(10)，2523-2528，1986)测定。
为了将hFGF2基因插入NP基因上游的NotI限制酶位点，可以在hFGF2基因的3′-末端添加SeV特异序列(EIS序列)，制成两端都有NotI识别序列的片断。具体地，以上述hFGF2 cDNA为模板，用包含起始密码子的N-末端引物(5′-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgcc/序列号13)和包含终止密码子区域和EIS序列的C-末端引物(5′-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacattggaagaaaaagtatagc/序列号14)进行PCR，扩增片断用NotI消化后亚克隆到pBluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，CA)的NotI位点，得pBS-hFGF2。测定核苷酸序列后，当所得基因存在变异时，用例如QuickChangeTMSite-directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA)按试剂盒中记载的方法校正到目的序列。用NotI消化pBS-hFGF2后，将包含hFGF2 cDNA的片断插到pSeV18+/ΔF(5aa)中NP基因上游的NotI位点，构建包含hFGF2基因的F缺失型病毒基因组cDNA pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)。pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)后面也称作pSeV18+hFGF2/ΔF。
3、构建F表达质粒可以用为了能通过Cre DNA重组酶诱导基因产物表达而设计的质粒pCALNdLw(Cre/loxP诱导型表达载体；Arai，T.等，J.Virol.72(2)，1115-1121，1998)表达仙台病毒F基因(SeV-F)。用StyI和BstUI消化pUC18/KS后，切除包含SeV-F基因的片断(1783bp)，进行平端处理后，插到pCALNdLw的特定SwaI位点，构建F表达质粒pCALNdLw/F。
4、制备诱导表达SeV-F蛋白质的辅助细胞建立表达SeV-F蛋白质的辅助细胞株，以便从F基因缺失基因组回收感染病毒颗粒，可以用例如SeV扩增中常用的猴肾细胞株LLC-MK2细胞。在37℃和5％CO2中用含有下列成分的MEM培养LLC-MK2细胞10％的热处理灭活胎牛血清(FBS)、50U/ml的青霉素G钠和50μg/ml的链霉素。用磷酸钙法(Mammalian Transfection Kit；Stratagene，La Jolla，CA)将为了能通过Cre DNA重组酶诱导F基因产物表达而设计的上述质粒pCALNdLw/F按公知的方案导入LLC-MK2细胞。
具体地，例如，将10μg质粒pCALNdLw/F导入在10cm培养皿中培养至40％铺满的LLC-MK2细胞中，然后用10ml含10％FBS的MEM培养基在37℃、5％CO2的恒温箱中培养24小时。24小时后将细胞剥下，悬浮于10ml培养基后，播种到五个10ml的培养皿中，例如5ml的一皿、2ml的两皿、0.2ml的两皿，用10ml含G418(Gibco-BRL，Rockville，MD)1,200μg/m和10％FBS的MEM培养基培养14天，每两天更换一次培养基，选出稳定的基因导入株。用克隆环回收例如30株在上述培养基中繁殖的G418抗性细胞。各克隆均在10cm的培养皿中扩增到铺满。
选择F基因稳定导入株的方法如下可以通过蛋白印迹对F蛋白的表达进行半定量分析。在6cm培养皿中将细胞扩增到铺满，按照齐藤等的方法(Saito等，Nucl.Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72(2)，1115-1121，1998)以moi＝3的感染复数感染腺病毒AxCANCre，诱导每一克隆中F蛋白的表达。感染3天后，除去培养上清，用PBS将细胞洗涤两次，用刮器将细胞刮落，以1500xg离心5分钟后回收细胞，在-80℃保存该细胞，解冻后将其悬浮于150μl PBS缓冲液中，再加入等量的2x Tris-SDS-BME上样缓冲液(0.625M Tris(pH6.8)，5％SDS，25％2-ME，50％甘油和0.025％BPB，Owl公司)，在98℃加热3分钟，然后进行电泳。按照公知的方案对该样品(1×105细胞/泳道)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹。蛋白印迹中，用以1∶1000的比例稀释的抗SeV-F(f236)抗体作为第一抗体，对各个克隆的SeV-F表达水平进行半定量分析。
通过上述方法证实了诱导SeV-F基因产物表达的LLC-MK2细胞的建立。后面将SeV-F基因诱导表达前的细胞表示为LLC-MK2/F，诱导表达后的细胞表示为LLC-MK2/F/Ad。
5、F基因缺失型SeV病毒的重建和扩增将携带血管生成基因的F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA转染至F基因表达型辅助细胞中并使其表达，由此可以重建病毒。例如，当用上述携带hFGF2基因的F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA(pSeV18+hFGF2/ΔF)时，用如下方法将所述cDNA转染至LLC-MK2细胞中。将LLC-MK2细胞以5×106个细胞/皿的浓度播种到直径为10cm的Petri皿中，培养24小时后，用经Solaren和长波长紫外线(365nm)处理20分钟的表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)室温转染1小时(moi＝2～3，优选moi＝2)。用例如装有5只15瓦灯泡的UVStratalinker 2400(商品目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，美国)进行痘苗病毒的紫外线照射。将细胞洗涤两次后，将质粒pSeV18+hFGF2/ΔF、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L(Kato，A.，等，Genes Cells1，569-579，1996)和pGEM/F-HN(WO00/70070)分别以12μg，4μg，2μg，4μg和4μg/皿的量悬浮于OptiMEM(GIBCO)，加入SuperFect转染试剂(1μg DNA/5μl Superfect，QIAGEN)混合，室温放置15分钟后，最后加入3ml含3％FBS的OptiMEM。将所得混合物加到细胞中，培养3～5小时后，用不含血清的MEM将细胞洗涤两次，然后在含40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)且不含血清的MEM中培养24小时。
除去培养上清，在细胞上层覆盖按上述克隆的F基因表达型辅助细胞LLC-MK2/F/Ad细胞。具体地，将分散在不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中的LLC-MK2/F/Ad覆盖在除去培养上清的细胞上，继续培养48小时。用刮器回收细胞，将颗粒悬浮于OptiMEM(107个细胞/ml)并反复冻融三次。将冻融裂解物(200μl/孔)加到LLC-MK2/F/Ad细胞的上层(12孔板中，4×106个细胞/孔)，加入300μl/孔的不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)后培养15～24小时。除去培养上清，细胞用不含血清的MEM洗净后，加入新鲜的不含血清的MEM(含40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)，培养5～9天后回收上清。回收所得的上清中含有重建的F基因缺失型SeV粒子，将其感染LLC-MK2/F/Ad细胞，与上述同法用不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养(或重复该步骤)，由此扩增F基因缺失型SeV。
此时，用0.22μm的过滤器将含有F基因缺失型SeV粒子的培养上清反复过滤两次，这样就能基本上避免在重建时混入表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒。具体地，将用含AraC而不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)扩增两次或更多次的培养上清(P2以后的样品)用0.22μm的过滤器过滤两次，再用含AraC而不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)扩增一次，获F基因缺失型SeV，其可以作为不含重组痘苗病毒污染的SeV。
制备缺损病毒载体时，例如，如果将基因组上缺损不同包膜基因的两种载体导入同一细胞时，每种缺失的包膜蛋白通过另一载体的表达来提供，这种互补导致产生感染性病毒颗粒，它们能复制并繁殖。即，如果将两种或多种包膜蛋白互补的本发明病毒载体同时混合接种，能以较低成本产生各种包膜基因缺陷型病毒载体的大量混合物。由于这些包膜基因缺陷的病毒具有较小的基因组，它们允许插入较长的外源基因。此外，这些本身没有感染能力的病毒在细胞外稀释后很难维持共感染状态，因此它们不会产生后代，对环境的损害也较小。
如果用治疗疾病的基因作为外源基因制备病毒载体，就能给与该载体以实施基因治疗。将本发明的病毒载体用于基因治疗时，通过直接给药或间接(回体)给药的方法都能表达具有所需治疗效果的外源基因或患者体内供应不足的内源基因等。如果血管生成因子或促进血管生成的基因作为外源基因，对其无特殊限制，不仅包括编码蛋白的核酸，还包括抑制血管生成的基因的反义核酸或核酶等不编码蛋白的核酸。
可以将回收的副粘病毒纯化使其达到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离和柱纯化等公知的纯化分离方法或上述方法的组合。“基本纯”是指病毒是其所在样品的主要成分，一般来说，当样品所含的全部蛋白质中，来自病毒载体的蛋白质比例为50％或以上，优选70％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上时，可以确定为基本纯的病毒载体。副粘病毒的具体纯化方法包括采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)和吸附于含有岩藻糖硫酸的多糖和/或其分解产物上的方法(WO97/32010)。
本发明的副粘病毒载体可以与所需的可药用载体一起构成组合物。本文中，“可药用载体”是指能与载体一起给药但不抑制通过该载体进行的基因导入的物质。例如，本发明的副粘病毒载体可以用生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等适当稀释，制成组合物。当本发明的副粘病毒载体是在鸡卵中繁殖时，组合物可含有尿囊液。组合物还可以包含介质，如去离子水或5％的葡萄糖水溶液，进一步地，还可以包含稳定剂、抗生素等。本发明还提供制备本发明血管生成组合物的方法，其包括将本发明载体和可药用载体混合的步骤。另外，本发明涉及用于制备本发明血管生成组合物的本发明载体的用途。本发明的组合物也可作为医药组合物。本发明还涉及含有本发明载体和可药用载体的缺血治疗制剂，以及本发明载体或上述组合物作为医药品的用途。
通过给与按上述方法制得的副粘病毒载体或含有该载体的组合物可以导入副粘病毒所携带的血管生成基因。本发明提供诱导血管生成的方法，其包括给与本发明的副粘病毒载体或本发明的血管生成组合物。该方法尤其对处理缺血组织有效。对给药部位无特别限制，优选在缺血组织或其周围局部给药，以使缺血处理时转基因产物集中在缺血组织而不渗漏到全身循环系统，或通过合适的基因递送系统在目标组织周围局部表达。例如，从缺血组织内部或外部直接给与含有本发明副粘病毒载体的组合物，使外源基因在缺血组织表达，由此实现基因递送。另外，也可以间接给药，例如，将编码血管生成基因的副粘病毒载体感染的细胞注入缺血组织或流过缺血组织的动脉。
另外，也可以选择用导管进行局部给药方法。例如，可以用双球导管法(其中用两个气球将血管隔离并将载体组合物注入隔离的血管间隙)或采用多孔球给药法等给与本发明的载体(Jorgensen，B.等，Lancet 1(8647)1106-8，1989；Wolinsky，H.和Thung，S.N.，J.Am Coll.Cardiol.15(2)475-81，1990；WO93/00051；WO93/00052)。上述给药方法中，可以用涂有水凝胶的球(Takeshita，S.等，Lab.Invest.75(4)487-501，1996)。
例如，在心肌梗塞、心绞痛和其它缺血性心疾病的治疗中，可以用导管直接将本发明的载体组合物经心室内腔注入心肌。另外，通过用导管局部注入本发明的载体可以促进冠状动脉狭窄部分的血管生成和侧支循环。
但是，通过导管给与载体时所需保温时间较长，球可能造成血管损伤，并且，往缺血组织的弥漫性血管中插入导管通常比较困难。本发明中，缺血组织处理时特别优选肌内(IM)给与载体。肌内注入比通过导管的给药方式简便，血管损伤的危险性也小。例如在缺血组织或其近旁的横纹肌中给与本发明的载体，横纹肌包括骨骼肌和心肌。给与病毒载体之前还可以给与布帕卡因，已知布帕卡因通过诱导肌肉再生而增强转基因的表达。另外，也可以选择皮内(ID)给药方式。将载体导入肌肉中的方法包括经皮导入法或切皮直接导入法等。导入载体时必须采取措施保证肌外膜不破损。可以用针和注射器给药，也可通过不用针的生物注射器给药。可以在一个或多个部位给药，并且给药次数可以是一次或多次。
本发明载体以基质形式给药时也有效。已知的方法中，使病毒载体分散在动脉胶原(aterocollagen)基质中，冷冻干燥使所得混合物固化，然后使基质缓慢崩解。有报告指出上述方法能使短暂性表达的腺病毒载体或裸露DNA的效果持续(Ochida，T.等，Nature Medicine 5，707-710，1999)。本发明的病毒载体可以与这样的助剂一起配制，也可以冷冻干燥。另外，还可以加入脂类阳离子(lipid cation)以增强表达效果。
已知即使是小量的基质也能在长时间内通过18G左右的注射针缓慢释放生长因子等。例如，在蛋白质制剂中，生长激素等在血液中的持续时间比单独给与生长激素等要长例如7天或7天以上。有报告指出其效果通常能持续10天或10天以上(特开平JP10-001440)。因此能减少给药次数和患者的痛苦。上述制剂可以用作皮下或肌内给药的固体注射剂(植入剂等)或栓剂等粘膜吸收剂。固体注射剂通常为能通过注射针给药的柱状或粒状剂型。优选的制剂形状包括方柱状和圆柱状等柱状和球状等粒状。
可以根据给药方式确定本发明非口服制剂的大小，只要不给造成患者过度的痛苦。注射剂由柱状基质构成时，直径为3mm或3mm以下(例如0.1～3mm)，长度为30mm或30mm以下(例如0.5～30mm)，优选能用14G或14G以下的注射针给药的直径为1.3mm或1.3mm以下(例如0.1～1.2mm)、长度为20mm或20mm以下(例如0.5～20mm)的大小，更优选直径为0.1～1mm、长度为1～20mm的大小，优选圆柱状。粒状基质构成的注射剂的最大直径为1mm或1mm以下(例如0.1μm～1mm)，优选150μm或150μm以下(例如0.5～100μm)，更优选1～100μm。基质重量可以根据制剂形状选择，注射剂的基质重量通常为40mg或40mg以下，优选1～25mg。
对用本发明副粘病毒载体导入的基因的类型无特别限制，只要是血管生成和/或促进血管形成的基因。例如，编码上述aFGF、FGF2(bFGF)、VEGF、Ang(包括Ang-1和Ang-2)、EGF、TGF-α、TGF-β、PD-ECGF、PDGF、TNF-α、HGF、IGF、EPO、CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-8和NOS的基因。这些蛋白质包括各个家族的每一成员和同种型(isoform)。用本发明副粘病毒载体导入的血管生成基因的一个特别合适的例子是编码FGF2的基因。FGF2有望用于治疗急性缺血，例如它在急性重症肢体缺血等的治疗中可能有明显的疗效。另外，FGF2对心肌梗塞也有疗效(Yanagisawa-Miwa，A.等，Science 257(5075)1401-3，1992)。蛋白质可以是分泌蛋白、跨膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白等，优选分泌蛋白，也可以是人工构建的蛋白质，人工蛋白包括与其它蛋白质的融合蛋白、显性阴性蛋白(包括受体的可溶性分子和膜结合型显性阴性受体)、缺陷型细胞粘附分子和细胞表面分子等。另外，还可以是带有分泌信号、膜定位信号或核转位信号等的蛋白质。所导入的基因可以是缺血组织中内源性诱导表达的基因，也可使不被诱导表达的基因在不同的部位表达。另外，也可以通过表达反义RNA分子或切割RNA的核酶而抑制缺血组织表达中不想要的基因的功能。
人们期待本发明的载体可以适用于各种缺血疾病和通过血管生成可以治疗的疾病的基因治疗。这样的基因治疗包括对血管切断、梗塞或血管分离引起血流阻断等导致的缺血的治疗。可以用本发明载体治疗的缺血疾病包括脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、缺血性心肌症和心肌缺血等。对基因治疗的组织无特别限制，包括肌肉、脑、肾脏和肺。另外，基因治疗能促进移植中的血管生成，对制作各种疾病模型和开发、评价疾病模型的治疗方法也有用。
使用载体对血管生成产生的促进效果可以通过测定活检样品中的毛细管数量、密度和分析血管造影图像等来确定，也可以通过采用多普勒灌注图像分析的血流量分析来确定。缺血组织的处理效果可以通过肉眼观察或组织切片显微镜观察组织坏死或脱落的情况来确定。
向靶组织给与药学有效量的本发明副粘病毒载体，由此将该载体导入靶组织的细胞中。“药学有效量”是指至少部分产生所需治疗或预防效果时靶组织细胞中的基因导入量。通过给与有效量的携带所需血管生成基因的本发明副粘病毒载体，导入该载体的细胞产生血管生成因子。优选地，通过给与有效量的携带所需血管生成基因的本发明副粘病毒载体，在给药组织中检出显著水平的血管生成因子。“显著水平”是指通过本发明载体导入的基因的表达量(转录产物或翻译产物的量)能被检出。例如，当存在转基因的对应内源基因时，转基因的最大表达水平是指比内源基因表达水平明显升高。优选给药部位的血管生成基因表达量为内源基因表达量的约1.2倍，优选约1.5倍，更优选约2倍，进一步优选约10倍或10倍以上，最优选约20倍或20倍以上。但是，转基因的表达量应该考虑其有效表达量和中毒水平而确定。
可以用本领域技术人员公知的方法测定细胞中转基因的表达量。例如，基因的转录产物可以通过Northern杂交、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)或RNA保护试验等方法来检测。通过Northern杂交或RT-PCR的进行检测也可在原位进行。对翻译产物的检测可如下进行应用抗体进行Western印迹、免疫沉淀、RIA、酶联免疫吸附试验(ELISA)，pull-down试验等。为了便于检测转基因的表达产物，可以使将要表达的蛋白带上标签，或者可以插入报告基因以确保它的表达。报告基因包括但不限于编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白(GFP)的基因等。
载体的用量可以根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的和导入基因的种类等而改变，可以由本领域技术人员作出适当决定。优选载体含有可药用载体，给药量约为105细胞传染单位(CIU)/ml～1011CIU/ml，更优选约107CIU/ml～109CIU/ml，最优选约1×108CIU/ml～5×108CIU/ml。包含本发明病毒的组合物可以给予包括所有哺乳动物在内的受试者，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和狗等。
人的给药量通常优选每个给药部位为2×108CIU～2×1010CIU，更优选2×109CIU左右的量，例如5×108CIU～1×1010CIU等。给药次数为一次或在临床上允许的副作用范围内的多次。一天中的给药次数也同此。对人以外的动物，可以根据给药动物与人的体重比或给药部位(缺血组织等)的重量比或体积比增减给药部位的数量或计算给药量。
附图简述图1示小鼠中度(左)和重症(右)急性后肢缺血的手术步骤。分支线表示后肢的动脉和静脉，短粗线表示血管切除部位。
图2表示后肢缺血时肌肉(左图)和血清(右图)中内源性VEGF(实心)和FGF2(空心)的表达。采用C57BL/6小鼠的中度和重症缺血模型，手术的两天后取全大腿肌肉和腓肠肌(n＝6)以及血清(n＝6)，进行ELISA。结果分别用肌肉的总提取蛋白或体积进行标准化，以平均值±S.D.表示。肌肉的数据包括大腿肌肉和腓肠肌两组数据(因此每组均为n＝12)。图中示出了平均值。*P＜0.01，#P＜0.05(单向方差分析)。
图3为通过RT-PCR检测的缺血诱导的VEGF表达照片。
图4表示通过SeV导入肌肉中的萤光素酶基因的表达水平(左图)和经时变化(右图)。用C57BL/6小鼠中度缺血模型研究未处理组、pCMV-luc(100μg)组和SeV-luc(107pfu或108pfu)组的萤光素酶活性(左图)。右图表示导入中度缺血模型中的萤光素酶基因表达水平的经时变化。空心圆点表示给与pCMV-luc(100μg)的C57BL/6小鼠组，实心圆点表示给与SeV-luc(108pfu)的C57BL/6小鼠组，阴影圆点表示给与SeV-luc(108pfu)的BALB/c nu/nu小鼠组，粗线表示临界值，其以上表示转基因表达显著。各图中的基因表达水平均采用相同的log标尺。
图5表示用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、COS7细胞、牛血管平滑肌细胞(BSMC)和心肌成肌细胞(H9C2)测定血管生成蛋白体外分泌水平的结果。“基础释放”表示没有载体时各因子的生成量。“临界值”表示转基因表达水平超过其以上的部分为显著。
图6表示外源导入中度缺血C57BL/6小鼠的FGF2(a)和VEGF(b)基因在肌肉(左)和血清(右)中的体内表达。手术后立即将各种载体溶液各50μl注入大腿肌肉和腓肠肌中。手术两天后取全大腿肌肉和腓肠肌(n＝6)以及血清(n＝6)，分别进行小鼠FGF2(a)的ELISA以及小鼠和人VEGF(b)的ELISA。结果分别用肌肉的总提取蛋白或体积进行标准化，以平均值±S.D.表示。图中表示了平均值。标尺为log标尺。
图7为基因导入方式介导的内源性鼠VEGF的表达增强图。即不进行手术(左)、中度缺血(中)和重症缺血(右)的C57BL/6小鼠的肢体肌肉中，基因导入方式介导的内源性小鼠VEGF表达的增强。手术后立即将各种载体溶液各50μl注入大腿肌肉和腓肠肌中。手术两天后取全大腿肌肉和腓肠肌以及血清(各组n＝6，全部n＝12)，进行鼠VEGF的ELISA。结果用肌肉的总提取蛋白进行标准化，以平均值±S.D.表示。图中表示了平均值。*P＜0.01，#P＜0.05(单向方差分析)。
图8为导入基因的小鼠的肢体肌肉组织图像照片。对C57BL/6小鼠进行重症缺血手术，然后按照图7所述的方法处理，手术两天后进行组织学观察。与未处理组小鼠(左上，非缺血)相比，模拟给药组(SeV-萤光素酶，模拟)小鼠的大腿肌肉(右上)上发现明显的炎性浸润和基质细胞浮肿。VEGF165处理组小鼠(左下，VEGF165)中观察到严重肌纤维损伤、细胞内浮肿和炎性浸润，导入FGF2基因(右下，FGF2)能抑制上述损伤。每组用6只小鼠，都得到相同的结果。苏木精-伊红染色，放大倍数×200。
图9为小鼠左后肢手术10天后将外源血管生成因子基因导入重症缺血肌肉中的治疗或恶化效果的照片。各图都显示了救肢分数(limb salvage score，LSS)。上半部分显示了C57BL/6小鼠重症缺血模型(救肢模型(limb salvagemodel))中典型的恶化效果，导入了VEGF165的小鼠后肢完全脱落(中上图)，萤光素酶对照组(左上图)和FGF2处理组(右上图)肢体获救。下半部分显示了BALB/c nu/nu小鼠重症缺血模型(后肢脱落模型(auto-amputation model))中的典型疗效。FGF2处理组(右下图)肢体获救，萤光素酶对照组(左下图)和VEGF165处理组(右下图)后肢几乎全部脱落。
图10为救肢模型和后肢脱落模型在给与载体后其后肢的预后曲线图，显示了载体给药后保留了后肢的动物个体的比率(救肢率)。将血管生成基因导入肌肉以后，A图显示C57BL/6小鼠重症缺血模型(救肢模型)中VEGF165的恶化作用，B图显示BALB/c nu/nu小鼠重症缺血模型(后肢脱落模型)中FGF2的治疗作用。各组分别进行三次独立实验(n＝10)。用Kaplen-Mayer法绘制曲线，数据用log-秩检验进行分析，*P＜0.0001。
图11是用C57BL/6小鼠重症缺血模型(救肢模型)通过激光多普勒灌注图像分析测定体内血管生成效果的照片。小鼠以107pfu的量给与SeV-萤光素酶、SeV-VEGF165和SeV-FGF2，观察血流灌注的恢复。各组显示同一个体的经时变化。上组图表示SeV-萤光素酶处理(模拟转染)小鼠血流恢复经时变化的典型结果。在手术4天后观察到大腿肌肉的血液再灌注，第7天明显，但在第10天也没检查到小腿的明显灌注，结果肢体萎缩，发现脚趾坏死征候(最右图)。中组图表示SeV-VEGF165处理小鼠的典型经时变化。在观察期间，大腿和小腿没有发现明显显著的再灌注，结果肢体脱落(最右图)。下组图表示SeV-FGF2处理小鼠的典型经时变化。第4天开始大腿出现明显的再灌注，第10天开始在整个肢体发现显著的血流，结果肢体完全获救(最右图)。
图12表示C57BL/6小鼠重症缺血模型(救肢模型)中血管生成基因治疗引起的血液灌注恢复。按照图11中所述的相同方法进行实验，算出缺血肢体和非缺血肢体的平均血流量，表示为左肢(缺血肢)血流值/右肢(非缺血肢)血流值的比值。*P＜0.001(与其它所有组相比)，#p＜0.05(与其它所有组相比)，##p＜0.05[与模拟给药组相比]。
图13表示，小鼠重症缺血模型(肢体脱落模型)，在给与携带hFGF2基因的复制型SeV载体或携带hFGF2基因的F基因缺失型SeV载体后，救肢率的经时变化观察结果。实验个体数量(n)和载体的给药量如图中所示。
实施发明的最佳方案下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。另外，本说明书中所引用的文献全部在此引用作为参考。
按照现有记载的方法(Yu，D.等，Genes Cells 2(7)457-66，1997；Yonemitsu，Y.，等，Nature Biotech.18，970-973(2000)；Kato，A.，等，Genes Cells1，569-579(1996)；Hasan，M.K.，等，J.Gen.Virol.78，2813-2820(1997))制备重组SeV。
通过鸡红血球的血凝素分析实验测定病毒滴度。高滴度的原液(109pfu/ml)在-80℃保存到使用。按照现有记载的方法(Yonemitsu，Y.，等，Lab.Invest.75，313-323(1996))通过RT-PCR分离人VEGF165 cDNA。在今村博士(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Tsukuba，日本)提供的cDNA的部分序列的基础上通过PCR制备全长FGF2 cDNA(Imamura，T.，等，Science 249，1567-1570(1990))。具体地，以缺失起始密码子区域和终止密码子区域的小鼠FGF2 cDNA部分片断(登记号为M30644的核酸中第7～435位核苷酸的片断)为模板，用包含小鼠FGF2 cDNA起始密码子的N-末端引物(5′-ACGTGCGGCCGCCAAAGTTCATCCACCATGGCTGCCAGCGGCATCACCTCGCTTCCC-3′/序列号15)及包含终止密码子区域和SeV特异序列的C-末端引物(5′-ACGTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGCGGATCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGTCCCGT-3′/序列号16)扩增全长cDNA。在确定按上述方法制得的人VEGF165 cDNA和小鼠FGF2 cDNA的核苷酸序列正确后，将其插到pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，1997，J.General Virology 782813-2820)的NotI位点。将表达人VEGF165或小鼠FGF2的仙台病毒载体分别命名为SeV-VEGF165或SeV-FGF2。SeV-萤光素酶(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78(Pt 11)2813-2820，1997；Yonemitsu，Y.等，Nature Biotechnol.18970-973，2000)和pCMV-萤光素酶(Yonemitsu，Y.等，Nature Biotechnol.18970-973，2000)的制备方法同上。
在统计分析中，本发明实施例的所有数据都以平均值±S.D.表示。救肢以外的数据用带Scheffe校正的单向方差分析法分析。救肢比率以救肢分数(LSS)表示，救肢数据用Kaplen-Mayer法分析。救肢实验的统计学显著性用log-秩检验确定，在所有统计分析中，将p＜0.05视为有显著统计学差异。
缺血诱导的内源性VEGF表达不引起后肢肌肉中的局部蛋白蓄积为了明确血管生成因子的治疗作用或有害作用，本发明人通过两个不同的手术构建三种肢体缺血模型(图1)。即(1)C57BL/6小鼠全大腿动静脉和隐动静脉切除的中度肢体缺血模型(图1左所示的中度缺血模型)(Couffinhal，T.，等，Am.J.Pathol.152，1667-1679(1998)；Kalka，C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，3422-3427(2000))；(2)C57BL/6小鼠全外髂骨动静脉、大腿动静脉及其外髂骨动静脉和大腿动静脉周围分支血管全部切除的模型(图1右所示的重症缺血模型)；(3)用免疫缺陷的BALB/c nu/nu小鼠按上述(2)的相同方法进行手术所得的模型(即BALB/c nu/nu小鼠重症缺血模型)。
从KBT Oriental Co.Ltd.(Tosu，Saga，日本)购进成熟雄性C57BL/6、BALB/c和BALB/c nu/nu小鼠(6-8周龄，Charles River Grade)。动物实验采用已被认可的方案，按照九州大学动物、重组DNA和病原性感染实验委员会推荐的实验室动物饲养和使用方法及日本政府的法律(第105号)和告示(第6号)进行，另外，还遵照美国国立卫生研究所制定的《Principles of LaboratoryAnimal Care》和《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》(publication No.NIH 80-23，1985修订)。
腹腔注入戊巴比妥使小鼠充分麻醉，切开皮肤。中度缺血模型中，将整个表层全肌动脉和股静脉以及隐动脉和隐静脉(从深部股动脉的正下方到腘动静脉)结扎并切除(图1左)(Couffinhal，T.，等，Am.J.Pathol.152，1667-1679(1998)；Kalka，C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，3422-3427(2000))。重症缺血模型中，还切除了外部髂骨动静脉和深部股动脉(图1右)。同一操作者(I.M.)进行3～5次独立实验验证这些模型肢体恢复状态的重现性，每个手术中各模型均用10只或更多的小鼠。各救肢实验由同一操作者在相同条件下重复进行四次。
上述模型(1)决不会丧失其肢体，仅偶尔发现脚趾坏死征候；模型(2)(即C57BL/6小鼠重症缺血模型)中没有出现肢体坏死(也称为“救肢模型”)；模型(3)(BALB/c nu/nu小鼠重症缺血模型)中所有小鼠在手术后10天内几乎全肢脱落(也称为后肢脱落模型)。免疫活性BALB/c小鼠重症缺血模型中观察到与BALB/c nu/nu小鼠同等程度的肢体坏死现象(数据省略)。有报告指出BALB/c系小鼠血管生成对生长因子的敏感性比C57BL/6系小鼠高(Rohan，M.R.等，FASEB J.14，871-876(2000))，如果综合考虑这一点，则上述结果意味着C57BL/6系小鼠的救肢对侧支循环的敏感性可能比对血管生成的敏感性高。
用上述中度和重症缺血模型研究VEGF和FGF2在缺血肌肉和血清中的内源性表达。手术两天后，取C57BL/6小鼠的各肢体肌肉(全大腿肌肉和腓肠肌)和血清，将组织匀浆或溶解后，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。用人VEGF或小鼠FGF2用的Quantikine免疫测定系统(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)根据其说明书测定重组蛋白的合成量，用蛋白质测定系统(Bio-Rad Laboratories，Hertfordshire，英国)按照Bradford法测定总蛋白浓度，其结果进行标准化(Yonemitsu，Y.，等，Nature Biotech.18，970-973(2000))。
全大腿肌和腓肠肌之间的蛋白质浓度无显著差异，因此各组都对两者进行分析。有趣的是，与未处理小鼠的基础水平(489.7±108.6pg/g肌肉，n＝12)相比，缺血手术的两个肢体缺血模型(中度模型847.5±187.7pg/g肌肉，重症模型895.4±209.5pg/g肌肉，每组n＝12)中FGF2蛋白浓度明显上升(P＜0.001)(图2)。另一方面，在重症缺血组中发现缺血导致VEGF蛋白的表达增强，但在肌肉中不明显(未处理174.7±43.1；中度119.2±53.4；重症242.5±244.3，n＝12)。已知VEGF是一种能通过组织缺血而大幅增强其表达的内皮促分裂原(Shweiki，D.等，Nature 359，843-845(1992)；Forsythe，J.A.，等，Mol.Cell.Biol.16，4604-4613(1996))，但上述结果似乎与这一结论不一致。因此，VEGF可能渗漏到全身循环系统，基于这一考虑，测定血清中的VEGF水平。结果跟假设一致，观察到血清中的VEGF蛋白水平呈缺血严重程度依赖性地增加，但在血清中没有检测到FGF2(图2右)。
本发明人假设，肢体缺血可诱导低分子VEGF同种型，已知它们与硫酸肝素的相互作用比高分子量或中分子量型VEGF小(Cohen，T.，等，J.Biol.Chem.270，11322-11326(1995))。为了证实这一假设，本发明人用能识别含有VEGF188、164、144和120的小鼠VEGF剪接同种型(Burchardt，M.，等，Biol.Reproduct.60，398-404(1999))的引物对，通过RT-PCR分析雄性C57BL/6小鼠(不进行手术、中度缺血模型和重症缺血模型)手术一天后VEGF同种型在大腿肌肉中的表达。所述引物对用现有记载(Burchardt，M.，等，Biol.Reproduct.60，398-404(1999))的针对大鼠VEGF外显子1和外显子8的引物对应于小鼠VEGF同种型序列的正向引物(5′-TGC ACC CAC GAC AGAAGG GGA-3′/序列号17)和反向引物(5′-TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACAT-3′/序列号18)。为了检测出最小的VEGF同种型(VEGF115)，使用与上述相同的正向引物和VEGF115特异性反向引物(5′-CTA CCA AAA GTT TCCCAG GCA G-3′/序列号19)(Sugihara，T.等，J.Biol.Chem.273，3033-3038(1998))。RT-PCR条件与文献相同(Burchardt，M.，等，Biol.Reproduct.60，398-404(1999)；Sugihara，T.等，J.Biol.Chem.273，3033-3038(1998))。
结果只在164同种型中观察到与缺血相关的内源性VEGF表达，而没有检测到其它同种型的明显表达(图3)。并且，通过RT-PCR分析没有检测到已知的最小同种型VEGF115(Sugihara，T.等，J.Biol.Chem.273，3033-3038(1998))的表达。
通过重组仙台病毒将基因肌内导入小鼠后肢的动力学首先用萤火虫萤光素酶研究转基因的表达水平和经时变化以分析其动力学。按照文献方法(Yonemitsu，Y.，等，Nature Biotech.18，970-973(2000))用发光计(型号LB 9507，EG&G Berthold，德国)进行萤光素酶分析，数据用相对光单位(RLU)/mg蛋白质表示。用蛋白质测定系统(Bio-RadLaboratories，Hertfordshire，英国)按照Bradford法测定总蛋白浓度，据此对萤光素酶测定值进行标准化。重症肢体缺血模型的肢体肌肉明显受到严重损伤，这意味着转基因表达的降低，因此用中度缺血模型(图1左)进行分析。手术时分别在大腿肌肉和小腿肌肉的各两处注入基因，每处注射量为25μl，以下的给药量均表示两处的合计值。给与小鼠(C57BL/6小鼠)(6～8周龄，平均体重30g)100μg pCMV-萤光素酶(临床用量的约50倍)(Baumgartner，I.，等，Circulation 97，1114-1123(1998)；Isner，J.M.等，J.Vasc.Surg.28，964-973(1998))，在基因导入两天后的测定中显示较高的萤光素酶活性(平均值±S.D.＝5.1±3.9×106RLU/mg蛋白质，n＝6)，但给与107空斑形成单位(pfu)的SeV-萤光素酶的组显示出约5倍的表达(2.4±3.8×107RLU/mg蛋白质，n＝12)，给与108pfu SeV的组显示出约120倍的表达(7.3±4.7×108RLU/mg蛋白质，n＝6)(图4左)。
按照上述相同方法对C57BL/6小鼠中度缺血模型给与萤光素酶表达质粒(pCMV-luc)或SeV-luc，测定转基因表达的经时变化。肌内给与108pfu SeV-萤光素酶的C57BL/6小鼠中度缺血模型中也发现表达随时间而降低(第2天7.3±4.3×108RLU/mg蛋白质，n＝12；第7天3.4±4.7×107RLU/mg蛋白质，n＝12；第14天2.6±1.2×104RLU/mg蛋白质，n＝12)(图4右)。肌内给与108pfu SeV-萤光素酶的BALB/c nu/nu小鼠中度缺血模型到第7天为止其萤光素酶活性的经时变化与C57BL/6小鼠相同，但其表达在后来一直维持(第2天9.4±3.7×108RLU/mg蛋白质，n＝12；第7天1.3±1.9×107RLU/mg蛋白质，n＝12；第14天0.9±1.3×107RLU/mg蛋白质，n＝12)。
然后，本发明人用原代牛血管平滑肌细胞(BSMC)和心肌成肌细胞(H9C2)、原代人脐带血管内皮细胞(HUVEC)以及COS7细胞等多种培养细胞测定血管生成蛋白在体外的分泌。本实施例中使用了不含蛋白质分泌所需的经典信号序列的FGF2载体(SeV-FGF2)，因为根据本发明人和其它人的在先研究，不含分泌序列的FGF2也可以在细胞外表达(Piotrowicz，R.S.等，J.Biol.Chem.272，7042-7047(1997)；Qu，Z.，等，J.Histochem.Cytochem.46，1119-1128(1998)；Florkiewicz，R.Z.等，J.Cell.Physiol.162，388-399(1995))。跟预想的一致，在培养上清中检出FGF2蛋白呈用量依赖性的有效表达，其表达水平与VEGF165相当(例如MOI＝100时，VEGF165FGF2＝4,354±2,7943,682±1,063(HUVEC)、275±58398±154(BSMC)、16,987±4,7485,976±381(H9C2)、38,648±4,9131,547,237±176,502(COS7)，各组均为pg/105细胞/24小时，n＝3)(图5)。
SeV介导的血管生成因子在体内的肌内表达动力学本发明人测定了C57BL/6小鼠中度缺血模型(图1左)体内肌内给与SeV-VEGF165和SeV-FGF2后，血管生成因子的肌内表达水平。给药部位在大腿肌肉和腓肠肌各两处，每处给药量为25μl，用26号针头在手术时仅给药一次。
血管生成因子的体内表达结果与它们的体外表达结果以及报道基因的体内表达结果相比很有意思。如图6所示，SeV-FGF2介导的蛋白质合成呈用量依赖性地增加，在最高滴度的载体导入中达到内源性基因表达水平的约100倍(大腿肌肉基线429±79，缺血974±150，106pfu4,913±313，107pfu13,469±12,611，108pfu46,703±12,092pg/g肌肉，各组n＝6；腓肠肌基线550±104，缺血720±128，106pfu1,376±158，107pfu8,252±8,190，108pfu59,704±35,297pg/g肌肉，各组n＝6)。SeV-FGF2给药组中，即使在最高滴度也没有检出明显的血清FGF2。另一方面，VEGF165的用量依赖性增加远比FGF2少，在107pfu时还没达到两倍，在108pfu时反而几乎检测不到来自SeV的人VEGF165蛋白的表达(大腿肌肉基线176±44，缺血143±64，106pfu159±67，107pfu224±216，108pfu＜5pg/g肌肉，各组n＝6；腓肠肌基线173±45，缺血95±28，106pfu186±30，107pfu172±101，108pfu＜5pg/g肌肉，各组n＝6)。内源性小鼠VEGF的血清水平在中度肢体缺血中明显增加(37.7±15.4pg/ml，n＝6)，但没有明显检出来自载体的人VEGF165，这表明在肌内表达的VEGF165不扩散到全身循环系统。
导入血管生成基因显著增强缺血诱导的内源性VEGF表达本发明人考虑VEGF165和FGF2表达模式的不同是否与内源性VEGF的表达相关。内源性VEGF的过度表达可通过过强的透过作用使组织缺血恶化，并可能下调SeV介导的转录。另外，有报告指出，在体内和体外，FGF2的血管生成作用部分是由内源性VEGF表达的增强引起的(Asahara，T.，等，Circulation 92，365-371(1995))。
因此，本发明人用小鼠VEGF特异性ELISA系统研究外源导入的血管生成因子基因引起内源性小鼠VEGF蛋白合成在肌内的变化。如图7所示，导入FGF2基因而不是VEGF165基因使正常循环(不进行手术)和中度缺血的肢体条件中内源性鼠VEGF的肌内水平显著升高。重症肢体缺血中，导入两种血管生成因子的基因使内源性小鼠VEGF的表达大大增强，特别是导入VEGF165导致与缺血本身(模拟)相比高出7倍左右。
为了进一步研究上述问题，本发明人对C57BL/6小鼠重症缺血模型中导入血管生成因子基因产生的效果进行组织学观察(图8)。在缺血手术后进行模拟(mock)导入时，分散的紧密肌纤维(diffusely picnotic muscle fibers)在两天后出现炎性浸润并伴有细胞内浮肿(intracellular edema)。这些结果在导入VEGF165基因时显著增强，而导入FGF2基因时则明显受抑制(图8)[实施例5]外源导入的VEGF165在急性重症肢体缺血中是肢体损伤因子而不是救肢因子在上述结果的基础上，本发明用上述中度和重症缺血模型研究导入血管生成因子基因在体内产生的疗效。以最高剂量108pfu给与VEGF165也没有发现转基因产物的产生，因此本发明人给与107pfu的病毒以观察体内疗效。将肢体的坏死程度分成4级救肢分数(Limb Salvage Score；LSS)LSS＝4，完全救肢(complete limb salvage)；LSS＝3，脚后跟以下坏死；LSS＝2，膝以下坏死；LSS＝1，膝以上坏死和LSS＝0，从腹股沟韧带周围开始全后肢脱落(total limb amputation around the inguinal ligament)。根据以上分类，本发明人用C57BL/6小鼠重症肢体缺血的救肢模型研究SeV介导的血管生成因子表达的毒性。血管生成基因的导入方法与实施例2相同。
在缺血手术的两天前注入载体，所有组的小鼠全部保留其肢体(数据省略)。在手术时注入载体，除VEGF165给药组外，包括FGF2给药组在内的所有组小鼠完全救肢(％LLS＝100％)。如图9和10所示，给与VEGF165的小鼠中观察到肢体脱落个体(5/10肢体脱落，％LLS＝52.5％，与其它组相比p＜0.0001)(图10A)。上述结果表明导入VEGF165基因有肢体损伤作用。然后，用BALB/c nu/nu小鼠重症缺血模型(截肢模型)验证血管生成因子的基因治疗的疗效。其结果是给与SeV-FGF2明显抑制nu/nu小鼠的肢体脱落(2/10肢体脱落，％LLS＝77.5％)(图10B)，而给与SeV-VEGF165(8/10肢体脱落，％LLS＝15.0％)与给与表达萤光素酶的SeV(5/6肢体脱落，％LLS＝16.7％)一样没有改善后肢的预后(图10B)。上述结果明确表明，导入FGF2基因具有救肢效果。
然后，本发明人通过激光多普勒灌注图像分析(Couffinhal，T.，等，Am.J.Pathol.152，1667-1679(1998)；Murohara，T.，等，J.Clin.Invest.105，1527-1536(2000))测定了肌内基因导入对接受重症缺血手术的左腿的血流恢复的效果。采用C57BL/6小鼠重症缺血模型(救肢模型)，基因导入条件与前述图10A(救肢模型)中完全相同。按照文献方法(Couffinhal，T.，等，Am.J.Pathol.152，1667-1679(1998)；Murohara，T.，等，J.Clin.Invest.105，1527-1536(2000))用激光多普勒灌注图像(laser Doppler perfusion image，LDPI)分析仪(MoorInstruments，Devon，英国)测定缺血肢体(左)/正常肢体(右)的血流比值。具体地，为了最大限度地减少体温导致的数据波动，在进行激光扫描前将小鼠维持在37℃的恒温板上。在预定时间(实验前和手术后2、4、7和10天)将每只小鼠的目的部位(腿部和足部)连续扫描两次(图11)，两次扫描中没有发现实质性差异。激光扫描后，将保存的图像用电脑测定血流量，算出缺血和非缺血足部的平均血流量。为了减少周围的光或温度影响导致的数据波动，LDPI指数以左肢(缺血)血流值/右肢(非缺血)血流值的比值表示。
SeV-萤光素酶(模拟)给药组和SeV-FGF2给药组都在第4天在大腿上部周围检测出明显的血流，特别是FGF2给药组在第4、7和10天发现腓肠肌有显著的血流，而同时期的萤光素酶给药组在大腿肌肉中发现有限的血流(图11)。代表性结果中，萤光素酶给药组的肢体出现轻度萎缩(mildlyatrophic limb)，而FGF2给药组中几乎没有肢体损伤。相反，VEGF165给药组小鼠大腿肌肉中几乎没有发现血流，结果后肢脱落(图11)。SeV-VEGF165给药组所有小鼠至少在膝水平肢体脱落。下面详细叙述各给药组的肢体血流观察结果。
1.给与SeV-萤光素酶的个体左后肢大部分血流在手术后立即消失，随后血流逐渐恢复，大约在第4天血流恢复到大腿部的中央附近，但到第10天为止该个体的血流尚未恢复到小腿。结果如最右图所示，后肢没有腐烂，稍有萎缩。1/3左右的个体观察到同样的结果，也有恢复程度比上述好的个体。
2.给与SeV-VEGF165的个体与上述一样，大部分血流在手术后立即消失，在随后的观察中几乎没有发现大腿部位的血流恢复。结果如最右图所示，后肢从大腿中部开始脱落。全部10个个体的结果完全相同。
3.给与SeV-FGF2的个体与上述一样，左后肢大部分血流在手术后立即消失，血流消失的范围与SeV-萤光素酶给药组基本相同。第4天开始大腿部出现强大的血流(红点所示)，第7天已经发现小腿出现弱的血流，第10天整个左后肢出现小量但明显的血流(蓝色所示)。结果如最右图所示，后肢保留且在外观上完全正常。
本发明人通过多普勒图像对各组的大腿肌肉血流进行统计学比较。如图12所示，SeV-FGF2给药组小鼠在肢体血流的生理恢复期间，血流值明显比SeV-萤光素酶给药组小鼠高。相反，SeV-VEGF165给药组小鼠的大腿肌肉血流值较低，手术第7天以后，其中的多数小鼠从下肢中部或从更上的部分脱肢。
用无复制能力的仙台病毒载体治疗急性肢体缺血
1、构建携带血管生成基因的F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA首先，通过PCR扩增EGFP基因，并使含有仙台病毒(SeV)全长基因组cDNA的pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997)缺失F基因，得到质粒pSeV18+/ΔF(参照WO00/70055和WO00/70070)，然后将EGFP基因插入上述F基因缺失位点，得到质粒(pSeV18+/ΔF-GFP)。在PCR中，使用以NisI结尾的5′-端引物(5′-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/序列号9)，和以NgoMIV结尾的3′-端引物(5′-tgccggctattattacttgtacagctcgtc/序列号10)，以使EGFP基因片断的核苷酸数量为6的倍数(Hausmann，S.等，RNA 2，1033-1045，1996)。用NsiI和NgoMIV限制酶消化PCR产物并从凝胶回收片断，将其连接到pUC18/dFSS上NsiI和NgoMIV限制酶位点之间的F基因缺失部位，通过测序进行证实。从该载体回收含有EGFP基因的DraIII片断，用pSeV18+中含F基因区域的DraIII片断置换，通过连接得到pSeV18+/ΔF-GFP。但是，即使从pSeV18+/ΔF，除去了F基因的下游ORF，残留的F基因的EIS序列(SeV特异序列，E；末端、I；间插、S；起始)仍有可能表达由连接片段与载体的引物衍生的五肽。此外，由于pSeV18+/ΔF-GFP中GFP发生共表达，因此构建了不可能共表达上述五肽和GFP的载体。按如下方法进行重组。
用SalI和NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP，回收含有F基因缺失区的片断(6288bp)，将其克隆到Litmus38(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)，构建LitmusSalINheIfrg/ΔF-GFP。用反向PCR法使含有F基因缺失区上游EIS序列的EGFP基因缺失。具体地，用反向引物(5′-gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/序列号11)和正向引物(5′-ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/序列号12)进行PCR，所述反向引物在GFP基因上游设有SexAI限制酶识别序列，所述正向引物在GFP基因下游设有SexAI限制酶识别序列。切出目的大小的片断(10855bp)并连接，使含有F基因缺失区上游EIS序列的EGFP基因缺失。
在此构建物中，由于引物的设计，使SexAI位点之间插入了一个多余的15bp序列，因此，通过转化大肠杆菌SCS110株(用dcm-/dam-SCS110株，因其中SexAI被甲基化，不能被消化)制备质粒，用SexAI限制酶消化质粒后，回收1628bp和9219bp两个基因片断并进行连接，除去多余的15bp序列，构建出LitmusSalINheIfrg/ΔF(Δ5aa)，在该构建体中，包含F基因上游EIS序列的EGFP基因已缺失，所述缺失区域含有6的倍数个核苷酸。用SalI和NheI消化该质粒，回收片断，用含pSeV18+中F基因区域的SalI/NheI片断置换，连接，得质粒pSeV18+/ΔF(Δ5aa)。按如下方法，用位于NP基因上游的NotI限制酶识别序列，将血管生成基因(例如人FGF2)插入该质粒。
2、构建含有hFGF2基因的F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA在征得患者本人同意的条件下，从大隐静脉采取血管平滑肌细胞，用RT-PCR从中分离人FGF2(hFGF2)的cDNA，将其亚克隆到pBluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，CA)的HindIII(5′-端)和EcoRJ(3’-端)位点。hFGF2 cDNA的序列经证实与Abraham等报告的序列一致(Abraham，J.A.等，EMBO J.5(10)，2523-2528，1986)。
为了将hFGF2基因插入pSeV18+/ΔF(Δ5aa)中NP基因上游的NotI限制酶位点，首先在hFGF2基因的3′-末端添加SeV特异序列(EIS序列)，制成两端都有NotI识别序列的片断。具体地，以上述hFGF2 cDNA为模板，用包含起始密码子的N-末端引物(5′-atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgcc/序列号13)和包含终止密码子区域和EIS序列的C-末端引物(5′-atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacattggaagaaaaagtatagc/序列号14)进行PCR，扩增片断用NotI消化后亚克隆到pBluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，CA)的NotI位点，得pBS-hFGF2，测序。用NotI消化pBS-hFGF2，得到包含hFGF2 cDNA的片断，将其插到pSeV18+/ΔF(Δ5aa)中NP基因上游的NotI位点，构建包含hFGF2基因的F缺失型病毒基因组cDNA pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)，也称作pSeV18+hFGF2/ΔF。另外，在编码具有复制能力的病毒cDNA的pSeV18+/AF中NotI位点处也插入含有hFGF2 cDNA的NotI片断，从而构建pSeV18+hFGF2。用公知的方法(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457-466)从pSeV18+hFGF2制备表达人FGF2的复制型SeV载体，以构建SeV-hFGF2。
3、重建和扩增F基因缺失型SeV病毒用表达F基因的辅助细胞(LLC-MK2/F，参照WO00/70055和WO00/70070)重建F基因缺失型SeV载体(将诱导SeV-F基因表达之前的细胞表示为LLC-MK2/F，诱导表达后的细胞表示为LLC-MK2/F/Ad)，所述辅助细胞通过Cre DNA重组酶来诱导仙台病毒F基因(SeV-F)表达。将LLC-MK2细胞以5×106个细胞/皿的浓度播种到直径为10cm的Petri皿中，培养24小时后，用经Solaren和长波长紫外线(365nm)处理20分钟的表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)室温转染1小时(moi＝2)。用装有5只15瓦灯泡的UV Stratalinker2400(商品目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，美国)对痘苗病毒进行紫外线照射。将细胞洗涤两次后，将质粒pSeV18+hFGF2/ΔF、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L(Kato，A.，等，Genes Cells 1，569-579，1996)和pGEM/F-HN(WO00/70070)分别以12μg、4μg、2μg、4μg和4μg/皿的量悬浮于OptiMEM(GIBCO)中，加入SuperFect转染试剂(1μg DNA/5μl Superfect，QIAGEN)混合，室温放置15分钟后，最后加入3ml含3％FBS的OptiMEM。将所得混合物加到细胞中，培养3～5小时后，用不含血清的MEM将细胞洗涤两次，然后在含40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)且不含血清的MEM中培养24小时。
除去培养上清，在细胞上层覆盖按照上述克隆的F基因表达型辅助细胞LLC-MK2/F/Ad细胞。具体地，将分散在不含血清的MEM(含40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中的LLC-MK2/F/Ad覆盖在除去培养上清的细胞上，继续培养48小时。用刮器回收细胞，将颗粒悬浮于OptiMEM(107个细胞/ml)中并反复冻融三次。将冻融裂解物(200μl/孔)加到LLC-MK2/F/Ad细胞的上层(12孔板中，4×106个细胞/孔)，加入300μl/孔的不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)后培养15～24小时。除去培养上清，细胞用不含血清的MEM洗净后，加入新鲜的不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)，培养5～9天后回收上清。将回收所得的上清感染LLC-MK2/F/Ad细胞，与上述同法用不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养，由此扩增F基因缺失型SeV。
扩增后，用0.22μm的过滤器将含有F基因缺失型SeV粒子的培养上清反复过滤两次，这样就能基本上避免在重建时混入表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒。具体地，将用含AraC而不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)扩增两次或更多次的培养上清(P2以后的样品)用0.22μm的过滤器过滤两次，再用含AraC而不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)扩增一次，回收培养上清，得到经过扩增并且不含重组痘苗病毒的F基因缺失型SeV(SeV-hFGF2/ΔF)。
4、用复制型和复制能力缺损型人FGF2表达载体SeV载体对肢体缺血进行基因治疗用实施例1记载的BALB/c nu/nu小鼠重症缺血模型(肢体脱落模型)验证复制型和复制能力缺损型人FGF2表达载体SeV载体的疗效。按照实施例2的相同方法导入血管生成基因。在手术时注入载体，观察手术后的肢体脱落情况，计算各时间点的救肢率(保留肢体的个体的比例)(图13)。
给与萤光素酶表达型SeV(SeV-萤光素酶)的对照组小鼠与未给药组小鼠显示同等程度的高肢体脱落比率，而给与人FGF2表达载体(SeV-hFGF2和SeV-hFGF2/ΔF)明显抑制肢体脱落。本实施例表明，表达人FGF2的副粘病毒载体作为缺血治疗所用的血管生成基因转移载体有很高的疗效，同时也证明了复制能力缺损型副粘病毒载体对缺血治疗有效。
产业实用性本发明提供了靶向缺血组织的基因治疗的基本技术，能有效诱导缺血组织的血管生成，防止坏死。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)<120>编码血管生成基因的副粘病毒载体及其应用<130>D3-A0006P<140><141><150>JP 2000-359374<151>2000-11-27<160>19<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>1ctttcaccct 10<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>2tttttcttac tacgg 15<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>3cggccgcaga tcttcacg 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>4atgcatgccg gcagatga 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>5gttgagtact gcaagagc 18<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>6tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc42<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>7atgcatgccg gcagatga18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>8tgggtgaatg agagaatcag c21<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>9atgcatatgg tgatgcggtt ttggcagtac 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>10tgccggctat tattacttgt acagctcgtc30<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>11gtttaccagg tggagagttt tgcaaccaag cac 33<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>12ctttcacctg gtacaagcac agatcatgga tgg 33<210>13<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>13atccgcggcc gccaaagttc acttatggca gccgggagca tcaccacgct gcccgccttg 60cccgaggatg gcggcagcgg cgcc 84<210>14<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的序列<400>14atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag ctcttagcag 60acattggaag aaaaagtata gc 82<210>15<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>15acgtgcggcc gccaaagttc atccaccatg gctgccagcg gcatcacctc gcttccc57<210>16<211>103<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>16acgtgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacgcggat cagctcttag 60cagacat tgg aagaaacagt atggccttct gtccaggtcc cgt 103<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>17tgcacccacg acagaagggg a21<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>18tcaccgcctt ggcttgtcac at 22<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明人工合成的引物序列<400>19ctaccaaaag tttcccaggc ag 2权利要求
1.一种编码能表达的血管生成基因的副粘病毒载体。
2.权利要求1记载的副粘病毒载体，其中所述血管生成基因为成纤维细胞生长因子2(FGF2)。
3.权利要求1记载的副粘病毒载体，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
4.权利要求1记载的副粘病毒载体，它缺失F基因。
5.血管生成组合物，它包含权利要求1记载的副粘病毒载体或包含该载体的细胞和可药用载体。
6.权利要求5记载的组合物，用于处理缺血组织。
7.权利要求5记载的组合物用于肌内给药。
8.诱导血管生成的方法，其包括给与权利要求5～7任意一项记载的血管生成组合物的步骤。
全文摘要
本发明提供一种编码血管生成基因的副粘病毒载体及其用途。该副粘病毒载体能高效将血管生成基因导入个体组织中。体内导入缺血组织的FGF2基因，诱导血管生成基因的表达且不导致浮肿，并防止因缺血导致坏死。本发明的载体适用于靶向缺血组织的基因治疗。
文档编号A61K48/00GK1487999SQ01822290
公开日2004年4月7日 申请日期2001年11月27日 优先权日2000年11月27日
发明者米满吉和, 居石克夫, 福村正之, 侯晓刚, 长谷川护, 之, 夫, 护 申请人:株式会社载体研究所