胶原酶在促进导线在完全动脉闭塞内通过中的应用的制作方法

专利名称：胶原酶在促进导线在完全动脉闭塞内通过中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用局部输注胶原酶或包括胶原酶的酶组合来经皮干预动脉闭塞的领域。
背景技术：
问题范围慢性完全闭塞(CTO)在进行诊断性导管插入术的患者中及其常见。据报道，在进行血管造影术的患者当中，有最高达20％的患者具有一种或多种慢性完全冠状动脉闭塞1。气囊式血管成形术是CTO的一种治疗手段，在1982年报道了首次成功2。1998年，在世界范围内，经皮冠状动脉干预术(PCI)在以每年一百万例以上的速度不断增加3，并且目前CTO占PCI的大约10％-15％4-7。然而，由于PCI在这类患者中的严重局限性，临床医生经常决定让这些患者接受旁路手术或坚持使用内科治疗(经常无效)。给心肌的有活力区域供血的血管出现一种或多种CTO是采用旁路手术而不是尝试PCI的最常见原因。
PCI的局限性PCI在CTO中的主要局限性是，与动脉狭窄(但不完全闭塞)相比下降的治疗成功率，和高的再狭窄比例。通过使用支架，再狭窄问题已经得到了改善8-10。然而，在过去的20年间，即使由于血管成形术装置例如亲水性导线方面的某些改进16，17，治疗成功率也仅表现出有限的提高，即从二十世纪八十年代的50-60％11，12提高到二十世纪九十年代的60-70％5，13-15。然而，在狭窄但没有闭塞的动脉中，PCI达到了95％以上的成功率。实际上，对于CTO来说，70％的成功率可能是高估了PCI，因为通常只有在感觉到对于损伤有合理的成功机会时才会作这样的尝试。已经鉴定了作为手术成功的预示，并影响进行血管成形术的决定的几种损伤特征。经常难以确定的闭塞持续时间是主要预示。当可以对此作出可靠估计时，据有人在两个试验中报道，新近发生的冠状动脉闭塞(即持续时间＜3个月)以74％和89％的比例(占受试病例的比例)被成功扩张5，13。然而，如果闭塞持续时间超过3个月，成功率分别降至59％和45％。可作为手术失败的预示的其它变量包括长的闭塞节段损伤长度(＞15mm)1，18，19、存在桥连侧组织(collateral)、没有引入闭塞节段内的锥形漏斗以及可能较小的血管尺寸20。与功能性完全闭塞(具有远侧节段的微弱晚期前行不透性，没有明显连续性的次完全闭塞)相比，在绝对闭塞(没有远侧不透性)中的失败率更高6，19，21。
为何PCT在慢性完全闭塞中失败？不能让导线通过CTO是PCI失败的最主要原因，占失败的75％以上5，19。与常规导线技术相比28，29，具有专门设计用于完全闭塞的新型导线，例如MagnumTM导线22，低速转动血管成形术装置23，24和受激准分子激光器粉末导线的(PrimaTMTotal Occlusion Device)25-27的最近的技术创新没能提高成功率。因此，设计更坚硬和更强力的导线以试图通过纤维变性完全闭塞的纯机械方法仅具有有限的效力。虽然血栓溶解治疗对于急性冠状动脉闭塞是有效的，但是仅对少量天生的慢性冠状动脉闭塞通过长期血栓溶解输注治疗过，并且效果有限30，31，该策略在很大程度上已被放弃了。没有关于慢性闭塞动脉的药物治疗以改善血管成形术效果的任何其它公开报道。
为什么应当将CTO打开？由慢性闭塞动脉供血的心肌区域可能仍然是有活力的，特别是对于与广泛侧组织化有关的缓慢发展的闭塞更是如此。心肌缺血是CTO的常见继发症，因为对于增加的心肌需求情形(锻炼、餐后、紧张状态)，经由侧组织的血流不充分。因此，对于CTO，严重的心绞痛是尝试采用PCI的最常见原因。对有活力心肌供血不足(称为“蛰伏心肌”)也是导致心力衰竭的可能可逆心肌机能障碍的主要原因。此外，有越来越多的数据表明，CTO成为不良预后的前兆。据报道，患有完全闭塞的患者的两年修正死亡率要高于患有次完全闭塞的患者32。对于患有持续平均4年的单一血管病的患者，具有CTO的患者的猝死率(15％)显著高于具有高级狭窄的患者(3％)33。最近的数据表明，CTO的再血管化改善了左心室功能(心力衰竭的主要决定因素)和可能的长期死亡率34-38。Suero与同事证实了，与失败的CTO治疗相比，对于成功的CTO治疗，10年存活率有显著提高(73.5％对65.1％)7。开放动脉在存活方面的益处可能是由于提高了心肌的电稳定性，同时降低了心室性心律加快，没有晚期可能以及保护了迷走神经紧张53-55。
实验使用基质金属蛋白酶
胶原酶制剂用于体外细胞培养实验已有很长时间。这些制剂通过降解周围基质而使细胞与组织分离开，并且这些细胞随后被用于细胞培养。关于使用胶原酶制剂来进行体内实验的报道非常少。已通过将细菌胶原酶(XI型和VII型)或者胶原酶与肝素的组合直接全身输注到尾状核内而发展出了大鼠脑内出血实验模型48-50。在该模型中，注射后10分钟，红细胞在尾状核血管附近聚集，注射后4小时出现了大面积出血，估计这是由于薄壁脑内血管的间质和基底膜胶原降解所致49。
Kerényi和同事51报道了在兔子动脉粥样硬化模型中使用几种不同的酶，包括胶原酶。这些酶是经由双气囊导管递送，其中是给这两个气囊充气，并将酶注射到位于这两个充气的气囊之间的空间内。这些酶放置最多30分钟，然后立即除去动脉。在该模型中，给兔子喂高胆固醇食物，导致发展成中等动脉粥样硬化斑，该动脉粥样硬化斑是极小程度狭窄(约30％)，并因此不闭塞或者不成为让导线或血管成形术气囊导管通过的屏障。经常释放多种酶(单独或者与胶原酶组合的胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)不仅导致动脉粥样硬化斑溶解，而且还引起动脉血管中层的广泛损害。胶原酶自身具有很小作用。这些研究支持了下述理论使用胶原酶降解血管壁内的细胞外基质，但是小心以高剂量进行的这种治疗的可能限制，特别是在薄壁动脉中的限制。
此外，这些研究都没有解决其中长节段的动脉完全闭塞，并且不能让导线(是进行气囊血管成形术和放置支架所绝对需要的)通过的慢性闭塞动脉的独特临床病症。另外，在该具体病症(慢性完全闭塞)中，成功治疗方法的参数例如确切的酶组成和量，局部给药策略以及在试图让导线通过之前的酶的适当培养时间都是未知的。临床闭塞动脉的实验研究受到缺乏合适的动物模型的限制。因此，虽然有某些实验基础支持利用胶原酶的基质降解性质来解决通常的动脉粥样硬化斑，但是慢性完全动脉闭塞是动脉粥样硬化疾病的独特表现。
有几篇公布的专利包括使用胶原酶或其它基质降解酶来降低血管内动脉粥样硬化斑的量的权利要求。在美国专利6,025,477中，Calendoff提出了让酶靶向作用于动脉粥样硬化斑的方法，这是通过让酶原[成纤维细胞胶原酶、明胶酶、多形核胶原酶、粒细胞胶原酶、溶基质素I、溶基质素II或弹性蛋白酶]与能够特异性结合动脉粥样硬化斑以形成试剂-动脉粥样硬化斑复合物的试剂(优选双功能抗体)结合来实现的(第16栏；第61-66行)。也与该试剂结合的酶原随后通过裂解并转化成能将动脉粥样硬化斑组分溶解的酶而被激活(第42栏，第19-32列)。
在美国专利5,811,248(Ditlow)和美国专利6,020,181(Bini)中，提出了用于将基质降解酶靶向递送给动脉粥样硬化斑的类似方法。Ditlow提出了一种方法，所述方法使用与能够降解动脉粥样硬化斑的酶缀合的包含CDR移植抗体或其片段的试剂(第5栏，第11-15行)。Bini提出了一种方法，其中是将血纤蛋白溶解基质金属蛋白酶与对生物靶向分子例如抗体有特异性的部分结合，这样的生物靶向分子将优先指向血纤蛋白(原)基质以提高血纤蛋白(原)溶解效力(第14栏，第1-10行)。然而，这些酶递送方法可能仅与未闭塞的动脉，特别是一般性动脉粥样硬化疾病有关。这些教导不适于将在闭塞的动脉中进行血管成形术的特殊应用，闭塞动脉由于完全闭塞而仅接受非常少量的循环血流。在这样的情况下，需要仅可能通过局部递送系统实现的很高浓度的酶。另外，必须将这些酶的确切递送参数和量优化，以确保充分改变闭塞性斑的组成和物质，同时不损害动脉壁的外层(中层和外膜)。在美国专利6,020,181中，Bini提出了通过使用血纤蛋白溶解基质金属蛋白酶，优选MMP-3或MMP-7来引起血纤蛋白(原)降解的方法。该专利是关于急性动脉闭塞，这种急性动脉闭塞含有大量血栓和血纤蛋白，并且是急性心肌梗塞和猝死的原因。该方法可作为血栓溶解治疗方法在体内进行，其中是将血纤蛋白溶解基质金属蛋白酶使用给个体以在原位降解血栓。然而，该血纤蛋白溶解基质金属蛋白酶的应用不是关于在慢性闭塞动脉中进行血管成形术的问题，慢性闭塞动脉含有大量胶原和其它细胞外基质组分，并含有非常少量的血纤蛋白或血纤蛋白原，此外，如上所述，该全身给药方法不涉及局部动脉闭塞。
综上所述，CTO仍然是一类重要的PCI损伤，具有很有限的成功率，主要是由于不能将导线通过闭塞。这些闭塞性斑的富含纤维变性胶原的特征是妨碍导线通过的原因。绝大多数具有慢性完全闭塞症状的患者是通过有效性通常很有限的药物疗法或进行侵入行旁路手术来进行治疗。除了引起显著心绞痛以外，还有强有力的证据表明，CTO也与左心室功能不佳有关，并且存活率低于狭窄(但未闭塞)损伤或成功扩张的慢性闭塞。CTO的放置支架治疗具有显著提高的长期开放，这是血管成形术的其它限制。因此，目前的证据表明，通过经皮干预术来打开完全闭塞是未充分使用，并且需要新的方法。
需要治疗闭塞性斑以促进导线通过闭塞—成功的血管成形术的先决条件。更具体来说，需要化学改变这些闭塞性纤维性斑中的胶原含量和结构，以促进常规导线通过。
还需要慢性完全动脉闭塞动物模型，以帮助研究和开发治疗不能被常规血管成形术导线通过的慢性动脉闭塞的方法。
发明概述本发明提供了发展慢性动脉闭塞体内动物模型的方法，所述方法包括下列步骤分离出动物动脉节段，用闭塞结扎线停止所分离的动物动脉的动脉节段的血流，将凝血酶局部注射到所述动脉节段内以形成急性血栓形成性闭塞，等待以让所述急性血栓形成性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。
本发明提供了治疗慢性闭塞的动物管和腔的方法。该方法的第一个步骤是将治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂施用到闭塞性动脉粥样硬化斑的邻近处。然后是在血管成形术导线通过闭塞性斑(plaque)之前的血管成形术前等待期。该等待期之后，让血管成形术导线通过闭塞性斑。
附图简述选择本发明的优选实施方案来举例说明和描述，但这不是以任何方式限制本发明的范围。附图中显示了本发明一些方面的优选实施方案，其中附

图1表示的是慢性闭塞的兔子股动脉的病理学特征(12周的持续时间)。M＝血管中层，A＝外膜，A，B＝Movat，10×原本；C＝Movat，20×；D＝苏木精(Hematolylin)和曙红20×。
A表示被纤维变性内膜损害闭塞的腔(L)。
B表示还含有小血管通道的闭塞的腔。
C表示小血管通道(通过箭头指示)的放大。
D表示闭塞的腔(L)的纤维变性和细胞组分。
附图2表示的是根据本发明治疗慢性闭塞的管和腔的方法的一个实施方案。
A表示慢性完全动脉闭塞。
B表示使用线型血管成形术气囊式导管让两种不同导线(ChoicePTTM和WizdomTM)通过闭塞的失败。
C表示邻近完全闭塞处的充气的血管成形术气囊式导管。该导线已经从血管成形术气囊式导管的线口上拆除，并把胶原酶输注到充气的血管成形术气囊和闭塞的动脉节段之间的小空间内(以防止邻近流出)。
D表示胶原酶溶液沿着动脉闭塞和闭塞节段的降解部分扩散。
E表示在放置胶原酶后72小时导线成功地通过了动脉。闭塞动脉节段已经被胶原酶部分降解，使得导线能够通过动脉的真腔进入动脉闭塞远处的未闭塞的动脉内。
附图3表示的是在兔子股动脉慢性完全闭塞模型中导线通过尝试的血管造影术结果。A-C在输注胶原酶后72小时成功的尝试。D-F在无效对照剂输注后72小时不成功的尝试。BI＝膀胱中的对比。
A表示在胶原酶处理的动脉中，在进行导线通过尝试之前，血管造影照片中两个箭头之间有明显闭塞。
B表示导线(用箭头表示)已成功地通过了闭塞。
C表示在导线通过后没有任何解剖证据。
D表示无效对照剂处理的动脉中，在进行导线通过尝试之前，血管造影照片中两个箭头之间有明显闭塞。
E表示导线(箭头)不能通过闭塞前行。
F表示在不成功的通过完全闭塞的尝试中，导线解剖(D)的对比外渗是明显的。
4在胶原酶输注后72小时导线通过。Movat10×原本，P＝内膜斑(其将腔闭塞)，W＝导线通过的位置，M＝血管中层，Ad＝外膜层。
附图4A表示在胶原酶处理的动脉(450μg)中的成功导线通过(充满血红细胞的区域)。某些闭塞斑降解的证据是明显的。内部弹性层(箭头)和中层保持完整。
附图4B表示具有不成功的导线通过的无效对照剂处理的动脉。存在广泛且闭塞的内膜斑(P)。
附图5在胶原酶输注后72小时导线通过。Movat10×原本，P＝内膜斑(其将腔闭塞)，W＝导线通过的位置，M＝血管中层，Ad＝外膜层。
A表示在胶原酶处理的动脉(450μg)中的成功导线通过(充满开放空间和血红细胞的区域)。某些闭塞斑降解的证据是明显的。内部弹性层(箭头)和中层保持完整。
B表示具有不成功的导线通过的无效对照剂处理的动脉。存在广泛且闭塞的具有微血管的内膜斑(P)。一部分中层(在3点与5点之间)被降解和萎缩。
附图6表示处理72小时后，与无效对照剂处理相比，在胶原酶处理中，成功导线通过方面具有统计学显著差异(p＜0.03)。处理是随机的，并且操作者对于处理分配是不知道的。
附图7表示的是处理24小时后，在胶原酶和无效对照剂处理的动脉中，关于间质胶原酶(MMP-1)的Western印迹分析。进行任一处理的慢性动脉闭塞表现出在≈93kD存在谱带，这证实了存在间质胶原酶(MMP-1)。与无效对照剂处理的动脉(道3和4)相比，在胶原酶处理的动脉(道1和2)中，该谱带显著增强，这表明在胶原酶处理的动脉中，间质胶原酶增加了。道5表示在胶原酶制剂中存在的MMP-1蛋白，并作为阳性对照。
附图8表示的是，在慢性闭塞动脉中，处理24小时后，胶原酶处理的动脉(道1)和无效对照剂处理的动脉(道2)的明胶酶谱。仅在胶原酶处理的动脉中有92-kD明胶酶(MMP-9)的增加，在无效对照剂处理的动脉中没有发现任何MMP-9活性。在92和82kD存在溶解谱带，这反映了在胶原酶处理的动脉中的酶原和激活形式的MMP-9。胶原酶和无效对照剂处理的动脉还都具有72-kD明胶酶(MMP-2)的证据。
附图9表示的是，在慢性闭塞动脉中，用胶原酶(道1和2)或无效对照剂(道3和4)处理24小时后，关于胶原降解片段(胶原片段的羧基末端)的Western印迹分析。在胶原酶处理的动脉中，胶原片段有显著增加。
附图10表明了在没有尝试让导线通过的情况下，在第24小时，胶原酶和无效对照剂处理的作用。Movat10×原本，P＝内膜斑(其将腔闭塞)，M＝血管中层，Ad＝外膜层。
A表示在先前闭塞的腔(L)内具有广泛闭塞斑降解的胶原酶处理的动脉。内部弹性层(箭头)和中层保持完整。
B表示具有广泛且闭塞的内膜斑(P)的无效对照剂处理的动脉，其中存在微血管。闭塞后，在慢性改变期间，还有相当广泛的内部弹性层的分解(用箭头表示)和中层萎缩。无效对照剂处理的动脉具有与上面在慢性完全闭塞模型中描述的动脉相同的病理特征。
发明详述依据本发明，描述了显著改善慢性闭塞治疗结果的方法。局部递送治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂的方法可有效地以下述方式改变闭塞性斑中的基质内容物显著促进导线通过和实质性提高治疗成功率，同时不引起这些酶对闭塞动脉和相邻未闭塞动脉节段的不利影响，所述制剂具有属于下列家族的基质降解酶基质金属蛋白酶、丝氨酸弹性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、天冬氨酸酶、半胱氨酸酶和梭菌蛋白酶。
人冠状动脉中慢性完全闭塞的病理特征形成CTO中动脉粥样硬化斑的因素主要是纤维钙化物39，其主要由平滑肌细胞、细胞外基质和钙以及可变量的细胞内和细胞外脂质组成40。通常存在炎性细胞39。胶原是细胞外基质的主要结构组分，占干重的最高达50％41，42，在动脉粥样硬化斑的纤维性基质中主要I和III型(以及少量的IV、V和VI)。在持续不到1年的CTO中，内膜中通常也存在蛋白聚糖。血栓形成带来不同的影响程度，这取决于动脉粥样硬化斑形成因素的严重性，并且可导致形成一层或多层凝块。随着时间的过去，血栓变得机化，并转化成富含胶原的纤维性组织(称为纤维内膜增生)，其最终成为动脉粥样硬化斑形成因素40。最新发展成的纤维内膜增生是血管成形术导线必须穿过以通过完全闭塞的最可能的结构。之前机化的富含胶原的纤维性组织是让目前血管成形技术成功通过的障碍。在腔内存在最新形成的纤维性组织是本发明胶原酶治疗的靶目标。不论闭塞持续时间有多长，内膜斑新血管通道在CTO中也很常见(＞75％)39。经由闭塞形成几个新的通道(动脉内动脉)，和/或脉管壁血管(vasa vasorum)(即桥侧组织)扩张经由闭塞的节段供给血管供给物和可能的活性剂例如胶原酶。然而，这些小通道不足以提供充分的远侧冠状动脉灌注来预防症状。
本发明涉及治疗慢性闭塞的动物管和腔的方法。用语“动物管和腔”是指在其中本发明方法具有医疗和兽医应用的人和其它动物，此外，本发明方法可应用于含有富含胶原的组织的闭塞的管和腔，例如牙根管、输卵管、胆管、窦、输尿管和尿道、动脉、静脉和用于动脉导管的静脉移植物。本发明方法主要是用于冠状动脉闭塞，但是也可用于闭塞的非冠状动脉，例如髂动脉、股动脉、股动脉、颈动脉或锁骨下静脉。本文包括将所述方法做常规适应性改变，以可应用于闭塞的体管和腔，包括静脉、静脉移植物、牙根管、输卵管、胆管、窦、输尿管和尿道。
动物模型本发明提供了以前没有尝试过的治疗慢性闭塞动脉的方法，所述慢性闭塞动脉由于导线不能通过损伤部位而不易于用血管成形术治疗。以前没有能够利用的慢性闭塞实验模型。使得其难以被通过的慢性闭塞的独特性质包括高胶原含量和限制闭塞部分与治疗直接接触的闭塞长度。为了评价胶原酶的作用，依据本发明发展了体内慢性完全闭塞动物模型(附图1)。所述动物模型可用任何典型的实验室实验动物建立，这些动物包括但不限于兔子、猪、狗、绵羊、大鼠和非人类灵长目动物。可能需要根据物种和身体大小的改变来调节剂量和时间。为了举例说明，下面用重3.0-3.5kg的雄性新西兰白兔来描述本发明的动物模型。
该方法的第一个步骤是分离出动物动脉的动脉节段(例如附图1所示的股动脉)，用闭塞结扎线停止所分离的动物动脉的动脉节段的血流。在优选的本发明实施方案中，该步骤是这样完成的用异氟烷将雄性兔子麻醉，在腹股沟韧带两侧制作切口。然后放置间隔至少约5mm的结扎线，以分离出股动脉节段。在优选的实施方案中，放置间隔至少约15mm的结扎线。结扎线不仅分离出来，而且将动脉节段实际闭塞。
该方法中的下一个步骤是将凝血酶局部注射到动脉节段内以形成急性血栓形成性闭塞。该步骤是通过使用27规格的针头将100IU牛凝血酶溶液(ThrombostatTM，Parke-Davis)注射到分离出的动脉节段内来进行的。等待至少20分钟后，松开缝线，以确定是否形成了闭塞。这可通过将结扎线(通常是缝线)松开以确定是否仍然存在前行的血流来实现。如果仍然存在前行的血流，则使用相同技术再进行另外一次或两次凝血酶注射直至产生急性闭塞。一般施以结扎线足够60分钟之后再除去。
然后是等待期，在该等待期间，急性血栓形成性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。该等待期是约10周-25周的期间。为了确定合适的等待期，在16(±4)周的平均持续时间，通过血管造影术(使用左颈动脉)评价动脉开放。
据信，可将发展出慢性闭塞体内动物模型的本发明方法做适应性改变以适用于含有富含纤维变性胶原的组织的其它体管和腔，例如牙根管、输卵管、胆管、窦、输尿管和尿道、静脉和静脉移植物。这样的方法将包括下列步骤分离出所选动物管的节段，在所分离出的动物管节段中，用间隔至少约5mm的闭塞结扎线停止经由该管的液体流，然后将致硬化剂(例如四环素或适于所选腔或管的其它活性剂)局部注射到节段内以形成急性闭塞；等待，让急性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。
慢性完全闭塞模型的病理特征在表现出持续股动脉闭塞的前2只兔子(在第10和15周)中，取出动脉，并做病理学检查以证实已发展出的慢性闭塞的组织学特征。在慢性纤维变性闭塞(附图1)中，有极少到没有明显的血纤蛋白残余物。除了成熟的纤维性组织以外，还有很多小的管腔内血管通道和有时存在的细胞外脂质沉积物、充满色素的巨噬细胞和淋巴细胞。在血管中层没有血管钙化和/或炎症的证据。与相邻的动脉节段相比，闭塞的节段还已经经受了实质性的向内改变。慢性闭塞模型中的共有特征是在几个位置有内部弹性层的分解，并出现了纤维性组织。所有这些改变都类似于慢性人冠状动脉完全闭塞。
该模型反映了多种治疗手段的特征。平均闭塞程度大约为28mm(14mm-56mm)，其比将采取经皮冠状动脉干预术的大部分临床冠状动脉闭塞要长得多。而且，由于向内的改变，闭塞的腔和整个血管尺寸非常小。
治疗慢性闭塞的动物管和腔的方法在本申请说明书和权利要求书中提及了“含有蛋白水解酶的制剂”。在本发明中，所述蛋白水解酶选自基质金属蛋白酶、丝氨酸弹性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、天冬氨酸酶、半胱氨酸酶和梭菌蛋白酶。基质金属蛋白酶(MMP)是一类含有锌的酶，它们降解细胞外基质(ECM)组分，包括纤连蛋白、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖和层粘连蛋白(laminin)。这些ECM组分是闭塞性动脉粥样硬化斑的重要组分。MMP在正常胚胎发生、炎症、伤口愈合以及肿瘤侵袭中起重要作用45，46。这些酶在广义上被分为3类胶原酶、明胶酶和溶基质素。胶原酶是间质胶原降解的细胞外途径的初始介质47，在胶原分子中的特定位点发生裂解，使得胶原易于被细胞外间隙的其它中性蛋白酶(例如明胶酶)分解。含有蛋白水解酶的制剂优选包含选自下列的基质金属蛋白酶胶原酶、1A型胶原酶、明胶酶和溶基质素。含有蛋白水解酶的制剂最优选包含单独或者与其它酶组合的胶原酶。应当理解，在本说明书中提及使用“胶原酶制剂”是为了举例说明本发明的优选实施方案，而不是限制性的。
治疗不能被常规血管成形术导线(0.014″或0.018″直径)(附图2A)通过的慢性闭塞的动物管和腔例如冠状动脉的方法包括下列步骤将治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂施用到闭塞性动脉粥样硬化斑的邻近处，经历在血管成形术导线通过闭塞性斑之前的血管成形术前等待期，然后让血管成形术导线通过闭塞性斑。
如下所述进行施用治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂的步骤。通过血管造影术确定冠状动脉被完全闭塞后，使用荧光镜指导，将在导线上的线型血管成形术气囊式导管引入到闭塞的冠状动脉内。如果闭塞不能被常规0.014″或0.018″冠状动脉血管成形术导线(附图2B)通过，则取出导线。将血管成形术气囊在约1-5大气压的低压下充气，以防止胶原酶制剂在给药期间流出。给血管成形术气囊充气至约4大气压的压力是优选的(附图2C)。含胶原酶的制剂缓慢地加入充气的气囊与闭塞之间的小空间内。如附图2C所示，将含有胶原酶的制剂经由血管成形术气囊式导管的线口直接输注。输注在约0.5大气压-3.5大气压的压力下进行。优选在约1-2大气压的低压下进行输注。还可以经由输注针头或导管将制剂直接输注到闭塞自身的邻近部位。
输注后，通过充气的血管成形术气囊将含有胶原酶的制剂在位置上保持约10-100分钟的制剂暴露等待期。该等待期优选为约50-约80分钟。依据优选的实施方案，制剂暴露等待期为约60分钟，之后取出血管成形术装置(附图2D)。
已经发现，治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂包含约50-2000μg IA型胶原酶。
将治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂给药并取出血管成形术装置以后，需要约1-108小时的血管成形术前等待期。已经发现，约12小时-约86小时的等待期是优选的，约72小时的等待期之后可获得最佳结果。需要该等待期以将含有酶的制剂沿着闭塞节段的长度扩散，和充分降解胶原和“软化”闭塞性斑。
如果动脉壁(中层)胶原作为闭塞腔的斑胶原易于被该治疗破坏，则胶原酶剂量将由于太低而无效，或者由于太高而不能防止过度破坏和弱化动脉壁。然而，在闭塞性斑内新形成的胶原最容易受到基质金属蛋白酶的影响。在正常动脉中层的胶原在血管壁的发育早期形成，并且以非常低的更新速度广泛交联。与之相比，存在闭塞血栓机化作用的内膜斑发展是非常动态的过程，其含有更新近合成的胶原，具有可变交联，易于被MMP例如胶原酶降解。最新机化的血栓是最有可能被血管成形术导线穿过以通过完全闭塞的损伤部分。因此，腔内这种最近形成的较松的纤维性组织是本发明治疗方法的主要目标。在72小时，患者返回导管插入术实验室，操作者又一次尝试让常规血管成形术导线通过，之后进行血管成形术(附图2E)。
已进行了多个体外和体内试验来评价治疗的可行性和效力。试验是用IA型胶原酶(Sigma)—一种通过发酵溶组织梭状芽孢杆菌(clostridium histolyticum)而获得的市售细菌胶原酶制剂—进行的。该酶制剂通常用于从组织中分离出细胞来进行细胞培养。该制剂还含有少量梭菌蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶样活性物质。IA型胶原酶(Sigma)是一种通过发酵溶组织梭状芽孢杆菌而获得的细菌胶原酶制剂。该制剂还含有梭菌蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶样活性物质。剂量范围是基于体外测定的结果确定的，该体外测定评价了一定范围剂量和培养时间的胶原酶制剂对动脉壁结构的影响。含有狭窄性动脉粥样硬化斑的人冠状动脉是在尸体解剖时获得的。将动脉节段切成3mm的横截切片，在培养孔内固定在琼脂凝胶上。这使得能够用细小吸移管将胶原酶选择性地直接递送到腔内。因此，只有闭塞性斑与胶原酶制剂直接接触，与胶原酶的体内腔内递送方法类似。4小时-18小时的培养时间后，结果表明100-500μg/ml的IA型胶原酶引起明确的闭塞性斑的体外降解，虽然在较高剂量范围内血管壁的较深层引起一定损害。
证实了持续存在闭塞后，将线型血管成形术气囊式导管(直径为3.0mm)经由在左颈动脉中的5F鞘和在荧光镜引导下置于和闭塞的股动脉相邻的髂动脉内。尝试着让常规0.014″冠状动脉血管成形术导线[WizdomTM，(Cordis)和Choice PTTM，(Boston Scientific)]通过。如果操作者不能让导线通过，则损伤会带入该试验。将血管成形术气囊式导管置于闭塞处，使用已知气囊长度(标志物之间20mm)作为定标装置来测定闭塞长度。将气囊充气至4大气压以防止酶溶液的邻近流出。然后取出导线，使用线口施用含有IA型胶原酶(n＝33个动脉，总剂量100-450μg)或无效对照剂(n＝24个动脉)的1.5ml溶液。在1-2个大气压缓慢地递送酶制剂。
将血管成形术气囊保持充气最长60分钟。在完成胶原酶给药1小时内所作出的通过慢性闭塞(n＝10)的初次尝试没有成功。所有其它尝试都是在施用胶原酶(n＝23)或无效对照剂(n＝24)后72小时进行的。在72小时，当最初2个用胶原酶处理的动脉有一个成功地通过闭塞时，将其余动脉(n＝45)随机分配到操作者不知道的无效对照剂或胶原酶处理组中。在72小时通过闭塞的尝试是在经由右颈动脉截断评价动脉循环和如上所述放置血管成形术气囊式导管之后进行的。反复注射造影剂以评价血管成形术导线(WizdomTM和Choice PTTM)通过的距离，和保证让导线保留在真实腔内。继续进行导线通过尝试直至导线通过损伤部分，产生大的切口，或者直至用不同导线所作的多次尝试不能取得任何成效时。采用血管造影术，通过导线末端越过闭塞节段在远侧血管床中的自由运动来确定成功的损伤通过。导线通过后，不进行血管成形术，这样让动脉结构保持完整以进行分析。在操作结束时，将兔子杀死，切下股动脉，进行组织学分析(Movat和H & E)。每个闭塞的节段测定至少3个横截切片。
统计学使用Fisher精确检验来评价导线通过闭塞的成功率之间的差异。P值＜0.05认为统计学显著。
闭塞长度在胶原处理的动脉(29.5+/-8.6mm)与无效对照剂处理的动脉(27.9+/-8.7mm)之间，闭塞长度没有任何显著差异。
血管造影术表明的在72小时通过慢性闭塞的成功率
与无效对照剂处理的动脉(7/24，29％)相比，在胶原处理的动脉(14/23，61％)中导线通过成功率有显著增加(p＜0.03)(分别是附图3和5)。
表1
通过尝试后动脉的病理特征当血管造影术表明成功的导线通过时，组织学分析证实了在导线穿过闭塞内膜斑的区域存在填充着血液的血管通道(附图4A和5A)。还有某些斑分解的证据。对于不具有血管造影术表明的切口的失败的导线通过，病理特征与具有浓厚纤维变性斑、新血管形成斑、某些炎性细胞渗滤和内部弹性层频繁破裂以及出现纤维性组织的慢性完全闭塞模型相同(附图4B和5B)。在这些情况下，没有任何导线损伤的证据。对于由于血管造影术表明的切口所致的失败的导线通过，在血管中层以及偶尔在外膜或外膜周围区域中，在内膜斑外有明显的导线通道。在胶原酶处理与无效对照剂处理的动脉中，在血管壁损害(例如内部弹性层或中层壁破裂)程度方面没有可检测到的差异。
关于胶原酶对慢性完全闭塞影响的24小时试验为了确定胶原酶制剂实际上影响闭塞动脉斑中的结构和细胞外基质蛋白，在给药后24小时，取出另外6个动脉(3个用于胶原酶[450μg]，3个用于无效对照剂)。为了在评价胶原酶作用时没有导线的混淆影响，不进行让导线通过这些闭塞的尝试。还评价动脉中存在的MP-1蛋白、胶原降解产物和明胶酶活性。
间质胶原酶(MMP-1)的Western印迹分析将冷冻的动脉在液氮中粉碎，在冷的提取缓冲液(cocodylic acid10mM，NaCl 150mM，ZnCl220mM，NaN31.5mM和SDS 1％w/v)中提取。为了测定胶原降解产物，将含有50μg蛋白的提取物在4-20％三甘氨酸凝胶上于还原条件下分离，并电转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。使用COL 23//4C短多克隆兔子IgG(HDM Diagnostics& Imaging Inc，Toronto)以1∶1000的稀释度作为初级抗体，使用抗兔子IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)作为次级抗体。为了检测间质胶原酶(MMP-1)蛋白，将含有50μg蛋白的提取物在非还原条件下分离，并电印迹到硝酸纤维素膜上。使用抗MMP-1单克隆抗体(Calbiochem)以1∶100的稀释度作为初级抗体，使用抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)作为次级抗体。为了揭示刺激抗体，使用化学发光检测系统(ECL Plus，Amersham)，然后进行放射自显影法。
在胶原酶和无效对照剂处理的动脉中的间质胶原酶(MMP-1)的Western印迹分析表明在≈93kD存在谱带，这证实了存在间质胶原酶(MMP-1)(附图7)。与无效对照剂处理的动脉相比，在胶原酶处理的动脉中，该谱带显著增强，这表明在处理后24小时，在胶原酶处理的动脉中，间质胶原酶(MMP-1)增加了。
明胶酶谱按照现有技术的描述进行明胶酶谱52。仅在胶原酶处理的动脉中有92-kD明胶酶(MMP-9)的增加，在无效对照剂处理的动脉中没有发现任何明显活性(附图8)。在92和82kD存在溶解谱带，这反映了在胶原酶处理的动脉中的酶原和激活形式的MMP-9。胶原酶和无效对照剂处理的动脉还都具有72-kD明胶酶(MMP-2)的证据。
胶原降解产物在还原条件下，使用抗人II型胶原的多克隆抗体(col 23/4C，1/1000稀释，Diagnostic Imaging)通过Western印迹分析评价降解的胶原。在无效对照剂处理和胶原酶处理的动脉中都鉴定出了胶原降解产物，在胶原酶处理的动脉中显著增加(附图9)。
通过胶原酶或无效对照剂处理的慢性闭塞动脉的病理特征在用胶原酶处理的3个动脉当中，有两个动脉存在明显的闭塞性斑的广泛降解，而在任一无效对照剂处理的动脉中都不存在这样的降解(附图10)。无效对照剂处理的动脉与上面在慢性完全闭塞模型中描述的动脉具有相同的病理特征。
已经发明了用于研究慢性动脉闭塞和可促进导线通过的含有胶原酶的制剂的组成和量的实验模型。通过如下方法在兔子股动脉中发展出了慢性动脉闭塞模型施加暂时的闭塞结扎，注射凝血酶，然后等待平均16周的时间以让急性血栓形成性闭塞发展成类似于慢性人动脉闭塞的慢性纤维变性闭塞。在60分钟的时间内经由线型血管成形术气囊式的线口局部递送含有450μg胶原酶的制剂，同时将气囊充气，与无效对照剂处理的动脉相比，在第24小时可引起胶原降解，提高MMP-1和MMP-9活性，以及可证实的斑组分降解。在胶原酶给药后72小时但不是1小时，这种局部递送胶原酶可提高导线通过的成功率。因此，在让导线通过之前，需要24-72小时的等待期来让胶原酶降解斑。胶原酶对闭塞性斑的这些作用可在不损害血管壁外层(中层和外膜)并且不形成动脉瘤的情况下实现。
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1.发展慢性动脉闭塞体内动物模型的方法，所述方法包括下列步骤分离出动物动脉节段；用闭塞结扎线停止所分离的动物动脉的动脉节段的血流；将凝血酶局部注射到所述动脉节段内以形成急性血栓形成性闭塞；等待以让所述急性血栓形成性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。
2.权利要求1的方法，其中所述分离动脉节段的步骤还包括以下步骤将动物麻醉；制作切口以进入动脉；放置间隔至少约5mm的结扎线，以分离出动脉节段。
3.权利要求1的方法，其中所述局部注射凝血酶以形成急性血栓形成性闭塞的步骤包括以下步骤使用针头将牛凝血酶溶液注射到动脉节段内；等待第一个等待期；松开结扎线以确定是否形成了闭塞；确定是否仍然存在前行的血流；如果仍然存在前行的血流，再将另外的牛凝血酶溶液注射到动脉节段内；反复该操作直至产生急性闭塞；和除去结扎线。
4.权利要求3的方法，其中所述第一个等待期是至少20分钟。
5.权利要求1的方法，其中所述等待以让急性血栓形成性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞的步骤的持续时间是10-25周。
6.权利要求1的方法，其中所述动物选自兔子、猪、狗、绵羊、大鼠和非人类灵长目动物。
7.权利要求1的方法，其中所述动脉选自股动脉、髂动脉、颈动脉和冠状动脉。
8.通过下述方法形成的慢性动脉闭塞体内动物模型用闭塞结扎线停止所分离的动物动脉的动脉节段的血流；将凝血酶局部注射到所述动脉节段内以形成急性血栓形成性闭塞；和等待以让所述急性血栓形成性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。
9.治疗慢性闭塞的动物管和腔的方法，所述方法包括下列步骤将治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂施用到闭塞性动脉粥样硬化斑的邻近处；等待血管成形术前等待期；和让血管成形术导线通过闭塞性斑。
10.权利要求9的方法，其中所述血管成形术前等待期的持续时间为约1小时-约108小时。
11.权利要求10的方法，其中所述血管成形术前等待期的持续时间为约12小时-约86小时。
12.权利要求11的方法，其中所述血管成形术前等待期的持续时间为约72小时。
13.权利要求9的方法，其中所述施用治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂的步骤包括以下步骤使用荧光镜指导，将在导线上的线型血管成形术气囊式导管引入到闭塞的管或腔内；将气囊在低压下充气；取出导管；将含有蛋白水解酶的制剂输注到管或腔内；等待制剂暴露的等待期；和取出血管成形术装置。
14.权利要求13的方法，其中将所述含有蛋白水解酶的制剂输注到邻近闭塞处的管或腔内。
15.权利要求13的方法，其中将所述含有蛋白水解酶的制剂直接施用到闭塞的邻近部分内。
16.权利要求13的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂是经由血管成形术导管的线口输注的。
17.权利要求13的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂是经由输注针头输注的。
18.权利要求13的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂是经由导管输注的。
19.权利要求13的方法，其中在约1-5大气压的压力下将气囊充气。
20.权利要求20的方法，其中在约4大气压的压力下将气囊充气。
21.权利要求13的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂是在低压下输注的。
22.权利要求21的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂是在约0.5大气压-3.5大气压的压力下输注的。
23.权利要求22的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂是在约1大气压-2大气压的压力下输注的。
24.权利要求13的方法，其中所述制剂暴露等待期是至少约10分钟。
25.权利要求24的方法，其中所述制剂暴露等待期是约20分钟-约100分钟。
26.权利要求25的方法，其中所述制剂暴露等待期是约50分钟-约80分钟。
27.权利要求26的方法，其中所述制剂暴露等待期是约60分钟。
28.权利要求9的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂包含选自下列的蛋白水解酶基质金属蛋白酶、丝氨酸弹性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、天冬氨酸酶、半胱氨酸酶和梭菌蛋白酶以及人纯化的基质降解酶。
29.权利要求28的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂包含选自下列的基质金属蛋白酶胶原酶、1A型胶原酶、明胶酶和溶基质素以及人纯化的基质降解酶。
30.权利要求28的方法，其中所述含有蛋白水解酶的制剂包括含有胶原酶的制剂。
31.权利要求9的方法，其中所述治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂包含50-2000μg IA型胶原酶。
32.发展慢性闭塞体内动物模型的方法，所述方法包括下列步骤分离出动物管的节段；用闭塞结扎线停止所分离的动物管的节段中经由该管的血流；将致硬化剂局部注射到所分离的节段内以形成急性闭塞；等待以让所述急性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。
全文摘要
本发明涉及使用局部输注胶原酶或包括胶原酶的酶组合来经皮干预动脉闭塞的领域。本方法提供了治疗慢性闭塞的动物管和腔的方法，包括将治疗有效量的含有蛋白水解酶的制剂施用到闭塞性动脉粥样硬化斑的邻近处，等待血管成形术前等待期；然后让血管成形术导线通过闭塞性斑。本发明还提供了发展慢性动脉闭塞体内动物模型的方法，所述方法包括下列步骤分离出动物动脉节段；用闭塞结扎线停止所分离的动物动脉的动脉节段的血流；将凝血酶局部注射到所述动脉节段内以形成急性血栓形成性闭塞；等待以让所述急性血栓形成性闭塞转化成慢性纤维变性闭塞。
文档编号A61K38/51GK1599621SQ02824102
公开日2005年3月23日 申请日期2002年10月1日 优先权日2001年10月1日
发明者H·斯特劳斯 布雷德利 申请人:H·斯特劳斯 布雷德利