用于外用抗老化制剂的皮肤活化组合物的制作方法

专利名称：用于外用抗老化制剂的皮肤活化组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种皮肤基膜护理产品、一种皮肤基膜结构的形成和修复促进制剂，以及皮肤外用制剂。本发明还涉及一种人造皮肤结构的形成促进制剂和一种生产人造皮肤的方法。
此类变化的起因已越来越受到关注，其包括真皮中的胶原以及由胶原、弹性蛋白和葡糖胺聚糖组成的弹性纤维的机能减退。迄今为止，已提出了使用羟基羧酸化合物(例如日本专利公开号253339)以及使用溶血磷脂(例如日本未审专利公开号8-67621)来预防和修复这样的皮肤改变。
前一专利中公开的内容提出，通过预防胶原纤维的损失可以抑制角质化或皱纹的形成。另一方面，后一专利公开提出溶血磷脂通过促进人成纤维细胞中葡糖胺聚糖(尤其是透明质酸)的生成在真皮中具有保湿作用。
一般地说，皮肤由角质层、表皮、基膜和真皮组成。IV型和VII型胶原是负责使表皮与真皮结合的表皮基膜的成分。IV型胶原是形成表皮基膜骨架的薄层致密结构的主要成分。VII型胶原是使基膜与真皮结合的固着原纤维的主要成分。
已经观察到，表皮基膜中IV型胶原的表达水平随着老化而降低(Vazquez F.等，Maturitas 1996，25209-215)，而一些报导则指出蛋白水平和mRNA水平上的VII型胶原生成在老年人的皮肤成纤维细胞中也比年轻人的有所减少(Chen等，J.Invest.Dermatol.，102205-209，1994)。另外，也有报道指出，由VII型胶原组成的固着原纤维的减少会随着生理性老化和正常皮肤的光老化而出现(Tsuji，T.，Nippi Kaishi 105963-975，1995；Tidman等，J.Invest.Dermatol.，83448-453，1984)。因此，促进构成基膜骨架的IV型胶原、使表皮与真皮结合的固着原纤维以及作为固着原纤维主要成分的VII型胶原的形成，被认为是保持皮肤健康和年轻的主要因素。
外界环境中使皮肤老化的最有力因素是阳光中所含的紫外线，已经很清楚它是加速老化的因素并且已知会引起皮肤变化，也就是所谓的光老化，其特征是深皱纹(Scharffetter-Kochanek，Advance inPharmacology，1997，58，639-655)。紫外线对皮肤具有多种作用，其中包括损害遗传DNA，诱导活性氧的产生，并且最近证明，它还会引起基质金属蛋白酶的生成(Fischer等，Nature，1996，379，335-339)。
由于紫外线的多重作用的特点，人们还无法清楚阐明紫外线引起光老化的机理。用不会引起红斑的能量剂量的紫外线照射无毛小鼠的试验证实可在小鼠背侧皮肤上形成与人光老化皮肤相当的深皱纹，并且这样的小鼠模型业已用来评估可以影响皱纹形成的物质(Moloney等，Photochem.Photobiol.，1992，56，495-504)。然而，皱纹形成的机理仍不十分清楚。
另一方面，Koivulkangas等报导，基膜分解代谢酶明胶酶的活性在紫外线照射的皮肤中有所提高(Acta Derm.Venereol.1994，74，279-282)。另外，Marschall等报道了尿激酶(纤溶酶原激活物(uPA))及其受体uPA受体的表达在受紫外线照射的表皮细胞中升高(J.Invest.Dermatol.，1999，113，69-76)，这暗示了补充血浆衍化的纤溶酶原可以激活角质细胞周围的纤溶酶原并提高紫外线暴露部位的纤溶酶活性。报告还称基膜在皮肤接触阳光的部位出现了结构变化，特别是经常会观察到多层化(Lavker，J.Invest.Dermat.，1979，73，59-66)。这表明阳光中所含的紫外线会通过增加皮肤基膜中分解代谢酶的生成来影响基膜结构。
对表皮基膜的损害不但会加速皮肤老化，而且会阻碍表皮的日常更新，进一步引起皮肤损伤。所以，受损皮肤基膜的结构的快速修复不但对于预防老化十分重要，而且是常规皮肤护理的一个组成部分。
促进基膜修复的具体方式业已用人造皮肤模型进行了研究。一种制备人造皮肤模型的示例方法包括在具有真皮样结构的含人成纤维细胞收缩I型胶原凝胶中培养正常人表皮角质细胞，以形成表皮层。在这种方法中，在仿真皮胶原凝胶和仿表皮层之间形成缺损基膜，因此可以用来评估加速受损皮肤基膜的结构修复或再生的物质。通过利用此类人造皮肤发现，通过使用基质金属蛋白酶抑制剂，或者同时使用基质金属蛋白酶抑制剂和基质蛋白生成促进剂，可以实现对皮肤基膜结构再生的促进作用(日本未审专利公开号2001-269398)。然而，问题在于再生的致密层的结构与正常皮肤相比发育不全，并且VII型胶原的沉积也不充分。
人造皮肤的重要之处在于可以作为由任何原因损害的生物皮肤的替代品，或者成为测试皮肤用药物和化妆品的效果的使用材料，或者用于药物实验，而对于所有这些用途，均希望人造皮肤具有尽可能与天然皮肤结构相似的结构。
本发明的一个目的是提供一种促进皮肤基膜结构的修复和再生的新方法和皮肤外用制剂，以及在人造皮肤结构中实现基膜充分形成的新方法。
所以，本发明提供一种含有一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂作为活性成分的用于外用抗老化制剂的皮肤活化组合物，特别是表皮基膜结构形成促进制剂和皮肤外用制剂。
本发明进一步涉及一种表皮基膜结构形成促进制剂和皮肤外用制剂，其各自配制为一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂与一种或多种可以促进细胞外基质成分(例如表皮基膜的主要成分IV型或VII胶原或层粘连蛋白5)生成的物质的混合物。
本发明进一步提供一种表皮基膜结构形成促进制剂和一种皮肤外用制剂，其各自配制为一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种可以促进细胞外基质成分(例如表皮基膜的主要成分IV型或VII胶原或层粘连蛋白5)生成的物质以及一种或多种基质金属蛋白酶抑制剂的混合物。
本发明还提供一种制备具有充分形成的基膜的人造皮肤的方法；一种形成人造皮肤的培养基，其含有单独或以混合物的形式使用的一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种可以促进细胞外基质成分(如表皮基膜的主要成分IV型或VII型胶原或层粘连蛋白5)生成的物质和/或一种或多种基质金属蛋白酶抑制剂作为活性成分；以及制备该培养基的方法。
本发明发现，通过把具有IV型和VII型胶原生成促进活性的得自山毛榉科水青冈属(Fagaceae Fagus)植物的提取物、作为层粘连蛋白5生成促进剂的1-酰基溶血磷脂，和作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的得自唇形科薄荷属(Labiatae Mentha)植物的提取物混合，可以得到具有高度基膜修复促进作用、优异粗糙皮肤改善作用和良好皮肤弹性保持作用并且可以抑制皱纹形成的皮肤外用制剂。
更具体地讲，按照本发明的一个优选方式，提供了一种皮肤外用制剂，其特征在于含有得自山毛榉科水青冈属植物的提取物、下面通式(1)或(2)表示的1-酰基溶血磷脂，和得自唇形科薄荷属植物的提取物 其中R1表示具有11-24个碳原子的饱和脂肪酸基团或具有18、20、22或24个碳原子和1-4个不饱和双键的脂肪酸基团，R2表示具有13-24个碳原子的饱和脂肪酸基团或者具有18、20、22或24个碳原子和1-4个不饱和双键的脂肪酸基团，并且M表示H或碱金属原子。
图2是人造皮肤的剖视图，显示向培养基中加入10μM化合物A和10μg/ml的抑肽酶(3)、加入10μM化合物A和1ng/ml白介素-1β(4)与加入10μM化合物A、1ng/ml白介素1β和10μg/ml抑肽酶(5)时培养形成人造皮肤的比较。
图3是人造皮肤的剖视图，显示向培养基中加入10μM化合物A和lng/ml的TGF-α(6)，与加入10μM化合物A、1ng/ml的TGF-α和10μg/ml抑肽酶(7)时培养形成人造皮肤的比较。
图4是人造皮肤的剖视图，显示向培养基中加入10μM化合物A和100ng/ml的PDGF(8)与加入10μM化合物A、100ng/ml的PDGF和10μg/ml抑肽酶(9)时培养形成人造皮肤的比较。
图5是人造皮肤的透射电子显微镜照片，显示向培养基中单独加入基质金属蛋白酶抑制剂化合物A(1)和进一步加入丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(2)时培养形成人造皮肤的比较。
图6是人造皮肤的苏木精和曙红染色的剖视图，显示不加入(1)(对照)与向培养基中加入大豆溶血卵磷脂(2)、薄荷提取物(3)、山毛榉芽提取物(4)或大豆溶血卵磷脂+薄荷提取物+山毛榉芽提取物(5)时培养形成人造皮肤的比较。
图7是人造皮肤的免疫染色剖视图，显示不加入(1)(对照)与向培养基中加入大豆溶血卵磷脂(2)、薄荷提取物(3)、山毛榉芽提取物(4)或大豆溶血卵磷脂+薄荷提取物+山毛榉芽提取物(5)时培养形成人造皮肤的比较。
图8是移植到裸鼠并在移植后第7天收集的人造皮肤的剖视组织图像，其中人造皮肤在没有添加剂或在基质金属蛋白酶抑制剂化合物A(10μM)和丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(10μg/ml)的存在下培养。它表示移植之前的人造皮肤(层粘连蛋白5染色)和粘着的人造皮肤(苏木精和曙红染色，层粘连蛋白染色，以及β2-微球蛋白染色)的组织图像。
图9是移植到裸鼠中并在移植后第7和18天收集的人造皮肤外观的照片，其中人造皮肤在没有添加剂或在基质金属蛋白酶抑制剂化合物A(10μM)和丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(10μg/ml)的存在下培养。
作为丝氨酸蛋白酶抑制物的具体实例，可以提及抑酶肽、凝血酸和ε-氨基己酸等。
本发明可以使用的丝氨酸蛋白酶抑制剂的具体实例包括多种具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的植物提取物，和它们的纯化产物。作为此类植物可以提及巴西胡桐、杨梅属sphaerocarpa DC、山香属crenata Pohl exBenth、C.rotundus L、E.sylvestris var.ellipticus和E.decipiens Helmsl.；蔷薇科的植物，并且特别是蔷薇属、悬钩子属、蚊子草属和蔷薇科的山楂属的植物；芍药科芍药属的植物；桑科葎草属的植物；菊科阿尼菊属的植物和菊科春黄菊属的植物；鹿蹄草科的植物；金丝桃科的植物，例如小连翘和贯叶金丝桃；唇形科薄荷属的植物，例如辣薄荷和留兰香；菊科红花属、牻牛儿苗科童氏老鹳草和葡萄科葡萄属的植物；桦木科的植物，例如垂枝桦属、桦木Lutea L.属和垂枝桦属；蔷薇科李属的植物，其是杏树(杏属、野杏属、光叶东北杏属、山杏属)；和生长在干草地或草原上的植物，例如漆树(zapote)、que shar、sano-sano、扇衣属decavallo等。
此类植物提取物可以得自草本植物的根、叶、茎、花等或得自木本植物的根、芽、树皮、果、叶、花等。
这些植物的提取物可以通过如下方式获得干燥植物原料，如果需要的话，进而切碎或粉碎，如果需要的话，此后用冷水、温水或沸/热水制备水提物，而且可以在常温或加热下使用有机溶剂如甲醇、乙醇、1，3-丁二醇和乙醚。细胞外基质蛋白生成促进剂本发明可以使用的细胞外基质蛋白生成促进剂是可以促进此类蛋白生成的物质。
作为本发明的基质蛋白，可以提及基膜的成分层粘连蛋白、VII型胶原、基底膜聚糖、巢蛋白等，尤其是层粘连蛋白5、IV型胶原和VII型胶原，它们是皮肤基膜的特有成分。
作为层粘连蛋白5生成促进剂的具体实例，可以提及转化生长因子-α、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、转化生长因子-β3、表皮生长因子等。
还可以使用多种植物提取物及其纯化形式。作为此类植物，可以提及甘草属、百合黑果莓、糖胶树、波叶青牛胆、胡芦巴、罂粟属Bocconia palo amarillo、豆科四棱豆、豆科决明属retama、龙胆科Erythraea chilensis(canchalagua)、大豆、葛根、cammock、草木犀、抽芽、红豆等。这些植物提取物可以得自草本植物的根、叶、茎、花等或得自木本植物的根、芽、树皮、果、叶、花等。
这些植物的提取物可以通过如下方式获得干燥植物原料，如果需要的话，进而切碎或粉碎，如果需要的话，此后用冷水、温水或沸/热水制备水提物，而且可以在常温或加热下使用有机溶剂如甲醇、乙醇、1，3-丁二醇和乙醚。这些植物的纯化提取物包括大豆溶血卵磷脂、大豆皂甙片段、大豆卵磷脂片段等。
作为IV型胶原生成促进剂的具体实例，可以提及肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、表皮生长因子、白介素-1α(IL-1α)、白介素-β(IL-1β)、血小板衍生的生长因子等。
也可以使用多种来自动物的原料。例如，可以提及从奶酪蛋白制备的bromois奶、通过水解鸡蛋壳膜制备的EM蛋白L等。
也可以采用许多植物提取物及其纯化形式。作为此类植物，可以提及夹竹桃科的植物，例如pule(糖胶树)；山毛榉科的树木，例如欧洲水青冈；豆科植物，例如野葛；五加科的植物，例如洋常春藤；和例如兰科等的植物。这些植物提取物可以得自草本植物的根、叶、茎、花等或得自木本植物的根、芽、树皮、果、叶、花等。
这些植物的提取物可以通过如下方式获得干燥植物原料，如果需要的话，进而切碎或粉碎，如果需要的话，此后用冷水、温水或沸/热水制备水提物，而且可以在常温或加热下使用有机溶剂如甲醇、乙醇、1，3-丁二醇和乙醚。
作为VII型胶原生成促进剂的具体实例，可以提及肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、转化生长因子-β3，表皮生长因子、白介素-1α(IL-1α)、白介素-β(IL-1β)、血小板衍生的生长因子等。
也可以使用多种来自动物的原料。例如，可以提及从奶酪蛋白的bromois奶、通过水解鸡蛋壳膜制备的EM蛋白L等。
也可以使用多种植物提取物及其纯化产物。作为此类植物可以提及属于夹竹桃科的植物，例如pule(糖胶树)；属于山毛榉科的树木，例如欧洲水青冈；豆科植物，例如野葛；五加科的植物，例如洋常春藤；和例如兰科等的植物。这些植物提取物可以得自草本植物的根、叶、茎、花等或得自木本植物的根、芽、树皮、果、叶、花等。
这些植物的提取物可以通过如下方式获得干燥植物原料，如果需要的话，进而切碎或粉碎，如果需要的话，此后用冷水、温水或沸/热水制备水提物，而且可以在常温或加热下使用有机溶剂如甲醇、乙醇、1，3-丁二醇和乙醚。基质金属蛋白酶如制剂对于本发明可以使用的基质金属蛋白酶抑制剂没有具体限制，只要它们是具有这种抑制活性的物质即可。基质金属蛋白酶的实例包括明胶酶、胶原酶、溶基质素、matrilysin等。所以，基质金属蛋白酶抑制剂可以选自能够抑制明胶酶、胶原酶、溶基质素、matrilysin等的物质。
作为基质金属蛋白酶抑制剂的具体实例，可以提及N-羟基-2-[[4-甲氧基苯基]磺酰基]-3-吡啶甲基]氨基]-3-甲基丁酰胺盐酸盐(此后称作“化合物A”)(J.Med.Chem.1997，40，p2525-2532)，MMP抑制剂(p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH)(FN-437)(BBRC，1994，199，1442-1446)等。
本发明的基质金属蛋白酶抑制剂的具体实例包括多种植物提取物及其纯化形式。作为此类植物，可以提及百里香，阔叶缬草和败酱科的其他植物，柿属Thunberg(柿树科)，紫云英(豆科)，野山楂(蔷薇科)，牡丹(Poeonia montan Sims)(芍药科)，大叶荼属var.assamica Pierre(山荼科)，蓝桉和桃金娘科的其他植物，洋委陵菜(蔷薇科)，欧洲小叶椴，阔叶椴，欧洲椴(椴树科)，垂枝桦(桦木科)，欧牛至，儿茶钩腾(茜草科)，胡桃或核桃科的其他植物，苦参(豆科)，地榆(蔷薇科)，贯叶金丝桃或小连翘(山竹子科)，大叶荼(山茶科)，姜黄(姜科)，姜黄粉纯化的提取姜黄，珠仔树，香附子、干膜莎草、芳香白珠树，金合欢属fornensia，诃子(Terminalia chebula)，孟加拉榕(榕树科)，腊肠树，南烛，海棠果，菩提树等。
此类植物提取物可以得自草本植物的根、叶、茎、花等或得自木本植物的根、芽、树皮、果、叶、花等。
这些植物的提取物可以通过如下方式获得干燥植物原料，如果需要的话，进而切碎或粉碎，如果需要的话，此后用冷水、温水或沸/热水制备水提物，而且可以在常温或加热下使用有机溶剂如甲醇、乙醇、1，3-丁二醇和乙醚。人造皮肤用于生成本发明的人造皮肤的基础培养基可以是任何用于生成人造皮肤常用的培养基，并且此类培养基包括含10％胎牛血清的Dulbecoo改进的Eagle培养基(DMEM)；含10％胎牛血清、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、2nM三碘甲腺原氨酸、0.1nM霍乱毒素和0.4μg/ml氢化可的松的DMEM-Ham氏F12(3∶1)；和角质细胞生长培养基(KGM)与含有10％胎牛血清的DMEM的1∶1混合物。加入该基础培养基中的丝氨酸蛋白酶抑制剂的量根据种类而不同，但一般应是约1ng/L至1g/L。加入到该基础培养基中的基质蛋白生成促进剂的量是约1ng/L至1g/L，并且基质金属蛋白酶抑制剂的加入量是约1纳摩尔/L至10-2摩尔/L。
为了生成本发明的人造皮肤，首先将含有人成纤维细胞的收缩I型胶原凝胶置于丝网上。该含人成纤维细胞的收缩I型胶原凝胶可以例如按照下述方式制备。制备悬浮有成纤维细胞的胶原溶液并在冰上冷却，随后令该胶原在培养皿上胶凝。此后，从培养皿壁剥离下凝胶并将该胶原凝胶在CO2培养箱中收缩。
随后在胶原凝胶上培养表皮细胞，例如正常人表皮角质细胞，以形成表皮。通过以下述方式培养皮肤细胞可以形成表皮层。将收缩的胶原凝胶置于丝网上并且将一个玻璃环置于该凝胶上。取人包皮衍生的表皮角质细胞混悬液加载到该玻璃环中并同时避免泄漏。令角质细胞在CO2培养箱中粘着，然后取走环。填充培养基至表皮层的边缘，然后继续培养并同时使表皮层暴露在空气中，以形成角质层。
按照这种方法可以得到天然皮肤样的人造皮肤，其在由含成纤维细胞的收缩I型胶原凝胶组成的真皮层与表皮层之间沉积有一层足够的基膜成分。表皮基膜结构的形成促进剂或修复促进制剂根据研究美容学的主要靶点--面部皮肤的基膜的结构变化的结果，基于所报道的特征在于基膜随年龄的增长而加厚和破裂的老化结构变化(Lavker，J.Invest.Dermatol.，1979，73，59-66)，发现基膜中的这种结构变化出现在近三十岁时并随着年龄的增加累积(Amano，S.等，IFSCCMagzine，4(4)，15-23，2000)。这种基膜的结构变化就是随老化出现的皮肤变化，例如皱纹形成、变硬和失去弹性。因此，可以相信基础角质细胞与基膜紧密结合是正常皮肤机能表达所必需的，并且对于促进基膜的修复也很重要。利用与日剂量紫外线接触的紫外照射光老化小鼠模型可以发现抑制皱纹形成的活性。所以皮肤基膜再生和修复促进剂是防止皮肤老化的有效试剂。
因此，按照本发明，新提供了一种用于皮肤活化的组合物或促进基膜形成的人造皮肤培养液，其中含有足以表现出促进表皮基膜再生、修复或形成作用的浓度的一种或多种上述丝氨酸蛋白酶抑制剂的混合物；与一种或多种上述细胞外基质蛋白生成促进剂的混合物相组合的一种或多种丝氨酸抑制剂的混合物；或与一种或多种细胞外基质蛋白生成促进剂的混合物以及一种或多种上述基质金属蛋白酶抑制剂的混合物相组合的一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂的混合物。在此，“皮肤活化”是指预防或缓解例如伴随着老化所致基膜中结构变化的皮肤机能的丧失，特别是皮肤弹性的丧失、形成皱纹、变硬等。
“足以表现出促进表皮基膜再生、修复或形成作用的浓度”应根据该组合物所用化合物和其它组分的种类，以及制剂的形式和使用的持续时间而变化。
如上所述，作为上述皮肤基膜结构形成促进制剂的一个优选方式，本发明提供一种皮肤外用制剂，其特征在于含有得自山毛榉科水青冈属植物的提取物、上述通式(1)或(2)所示的1-酰基溶血磷脂和得自唇形科薄荷属植物的提取物。该皮肤外用制剂适宜用作用于保护基膜的皮肤外用制剂制剂、用于改善粗糙皮肤的皮肤外用制剂或作为预防老化的皮肤外用制剂。
属于山毛榉科水青冈属的植物包括例如水青冈属crenate Blume、日本水青冈、美国水青冈、欧洲水青冈、Fagus sylvatica L.var.pendula、紫叶欧洲水青冈或东方水青冈的植物。可以使用此类植物的芽、花、茎、叶、果、种子、根和整体。对提取方法没有特别限制，例如，可以单独使用或以混合物的形式使用制备化妆品常用的溶剂，例如水或亲水性有机溶剂如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇或1，3-丁二醇，。
作为适于本发明的市售水青冈属植物提取物的实例，可以提及GATULINETMRC和GATULINETMR，两者皆由Gattfosse S.A.(法国)制造销售。
可以按照上述方式选择得自这些水青冈属植物的任何一种或多种提取物用于皮肤外用制剂。其含量优选是皮肤外用制剂总量的0.001-5.0重量％，更优选0.01-1.0重量％。如果水青冈属植物提取物的含量少于0.001重量％，就无法获得足够的改善粗糙皮肤的效果，而当加入量大于5.0重量％时是不经济的，因为不能获得与之相应的更强的作用。
1-酰基溶血磷脂可以是市售产品，或者可以通过用磷脂酶A2处理市售的磷脂来获得。或者，可将合成的1，2-二酰基磷脂用磷脂酶A2处理得到具有恒定碳数的1-酰基溶血磷脂。还可以通过将至多1摩尔脂肪酸酐或脂肪酸卤化物与1摩尔甘油磷酸胆碱在催化剂的存在下反应得到溶血磷脂酰胆碱来达到获得恒定碳数(日本未审专利公开号63-225388)。大豆衍生的磷脂或其类似物也可以用磷脂酶A2处理。
在1-酰基溶血磷脂中，当R1是一个酰基时，优选该酰基衍生自不饱和脂肪酸，当R2是一个酰基时，优选该酰基衍生自不饱和脂肪酸，并且当R2包含两个或多个不同的天然的酰基时，它们优选是大豆衍生的脂肪酸残基。
这些可以单独使用或者是两种或多种组合使用。特别优选的1-酰基溶血磷脂是其中R2是具有18个碳原子和3个不饱和双键的脂肪酸残基的通式(2)的那些，和其中R2是具有18个碳原子和1-2个不饱和双键的脂肪酸残基的通式(2)的那些。
作为市售1-酰基溶血磷脂的实例，可以提及Lipidure(NOF Corp.的产品，主要是通式(2)，其中R2是具有18个碳原子和2个不饱和双键的脂肪酸残基)、San Lysolecithin(Taiyo Kagaku Co.，Ltd.的产品，主要是通式(2)，其中R2是具有18个碳原子和2个不饱和双键的脂肪酸残基)和Lysolecithin Kyowa(Iwase Cosfa Co.，Ltd.，的产品，主要是通式(2)，其中R2是具有18个碳原子和2个不饱和双键的脂肪酸残基)。
1-酰基溶血磷脂的含量优选是皮肤外用制剂总量的0.001-1.0重量％，并且更优选0.001-0.1重量％。当小于0.001重量％时，会减弱改善粗糙皮肤的效果，而当在大于1.0重量％时，随时间可能会出现变色，这在稳定性方面是所不希望的。
得自唇形科薄荷属植物的上述提取物可以通过将该植物的叶、茎、花或根或其混合物用提取溶液浸泡或加热回流，随后过滤和浓缩得到。本发明所用的提取溶剂可以是任何提取常用的溶剂，并且通常是有机溶剂，例如，醇如甲醇、乙醇或1，3-丁二醇，或含水的醇、丙酮、乙酸乙酯等，它们可以单独使用或以各种联合形式使用。根据本发明，属于唇形科薄荷属植物的提取物可以是市售产品，例如薄荷提取物(MaruzenPharmaceuticals Co.，Ltd.的产品)。
唇形科薄荷属植物的提取物的含量优选是皮肤外用制剂总量的0.001-5.0重量％，更优选0.001-0.1重量％。当少于0.001重量％时，会减弱改善粗糙皮肤的效果，而当大于5.0重量％时，可能会随时间出现变色，这在稳定性方面是所不期望的。
本发明的制剂可以是水溶液、油溶液或其它类型溶液的形式，例如乳液、霜剂、凝胶、混悬液、微囊、散剂、颗粒剂、胶囊、固体等。这些制剂可以以其原始形式通过已知方法制备，或者制备成洗剂、乳液、霜剂、软膏剂、硬膏剂、泥敷剂、气溶胶、注射剂、口服形式(片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、锭剂等)、栓剂等，并且通过涂抹、粘着、喷雾、注射、饮用或插入来施用给机体。在这些剂型中，皮肤外用制剂例如洗剂、乳液、霜剂、软膏剂、硬膏剂、泥敷剂和气溶胶被认为是最适合于本发明的制剂。在此所用的术语“皮肤外用制剂”也包括药物、准药物和化妆品。
本发明的制剂也可以含有适当的常用赋形剂和香料，以及脂肪和油、表面活性剂、防腐剂、金属离子螯合剂、水溶性聚合物、增稠剂、粉末组分、紫外线防护剂、保湿剂、药物、抗氧剂、pH调节剂、洗涤剂、干燥剂、乳化剂等。当此类组分加入到本发明的制剂中时，这种加入必需是在不损害本发明原效果的范围内。
脂肪和油包括液体脂肪和油、固体脂肪和油、蜡、烃油、高级脂肪酸、高级醇、合成酯油、聚硅氧烷等。
作为液体油，具体可以提及，鳄梨油、山茶油、樱草油、海龟油、澳州坚果油、玉米油、貂油、橄榄油、菜油、蛋黄油、芝麻油、桃仁油、麦胚油、茶梅油、蓖麻油、亚麻子油、红花油、棉油、紫苏子油、豆油、花生油、茶籽油、肉豆蔻油、米糠油、泡桐油、紫花泡桐油、霍霍巴油、胚芽油、三甘油、甘油三辛酸酯和甘油三异棕榈酸酯；作为固体油，可以提及可可脂、椰子油、马脂、氢化椰油、棕榈油、牛油、羊脂、氢化牛油、棕榈仁油、猪油、牛骨脂、野漆树蜡仁油、氢化油、牛脚油、野漆树蜡和氢化蓖麻油；作为蜡，可以提及蜂蜡、小烛树蜡、棉蜡、巴西棕榈蜡、月桂子蜡、中国蜡、鲸蜡、褐煤蜡、麸糠油、羊毛脂、木棉蜡、羊毛脂乙酸酯、液体羊毛脂、甘蔗蜡、异丙基羊毛脂脂肪酸、月桂酸己酯、还原羊毛脂、霍霍巴蜡、硬羊毛脂、紫胶蜡、POE羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇乙酸酯、POE胆固醇醚、羊毛脂脂肪酸聚乙二醇和POE氢化羊毛脂醇醚；作为烃油，可以提及液体石蜡、地蜡、角鲨烷、姥鲛烷、石蜡、纯地蜡、凡士林和微晶蜡。
作为高级脂肪酸，可以提及月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、二十二烷酸、油酸、12-羟基硬脂酸、十一碳烯酸、异硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。
作为高级醇，可以提及直链醇，例如月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、二十二烷醇、肉豆蔻醇、油醇和鲸蜡硬脂醇，或支链醇，例如一硬脂基甘油醚(鲨肝醇)、2-癸基十四烷醇、羊毛脂醇、胆甾醇、植物甾醇、己基十二烷醇、异硬脂醇和辛基十二烷醇。
作为合成酯油，可以提及肉豆蔻酸异丙酯、辛酸鲸蜡酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、二甲基辛酸己基癸基酯、乳酸鲸蜡酯、乳酸肉豆蔻酯、羊毛脂乙酸酯、硬脂酸异鲸蜡酯、异硬脂酸异鲸蜡酯、12-羟基硬脂酸胆甾醇酯、乙二醇二-2-乙基己酸酯、二季戊四醇脂肪酸酯、N-烷基二醇一异硬脂酸酯、新戊二醇二癸酸酯、苹果酸二异硬脂基酯、甘油二-2-庚基十一烷酸酯、三羟甲基丙烷三-2-乙基己酸酯、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯、季戊四醇四-2-乙基己酸酯、甘油三-2-乙基己酸酯、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯、2-乙基己酸鲸蜡酯、棕榈酸2-乙基己酯、甘油三肉豆蔻酸酯、三-2-庚基十一烷酸甘油酯、蓖麻油脂肪酸甲酯、油酸油、鲸蜡硬脂醇、乙酰甘油酯、棕榈酸2-庚基十一烷基酯、己二酸二异丁基酯、N-月桂酰基-L-谷氨酰基-2-辛基十二烷基酯、己二酸二-2-庚基十一烷基酯、月桂酸乙酯、癸二酸二-2-乙基己酯、肉豆蔻酸2-己基癸酯、棕榈酸2-己基癸酯、己二酸2-己基癸酯、癸二酸二异丙酯、琥珀酸2-乙基己酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯和柠檬酸三乙酯。
作为聚硅氧烷，可以提及直链聚硅氧烷，例如二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷和甲基氢聚硅氧烷；环状聚硅氧烷，例如十甲基聚硅氧烷、十二甲基聚硅氧烷和四甲基四氢聚硅氧烷，以及聚硅氧烷树脂和形成四级网状结构的聚硅氧烷橡胶。
本发明的制剂可以含有单用或组合使用的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂。
作为阴离子表面活性剂的实例，可以提及脂肪酸皂，例如皂碱、月桂酸钠和棕榈酸钠；高级烷基硫酸酯，例如十二烷基硫酸钠和十二烷基硫酸钾；烷基醚硫酸酯，例如POE三乙醇胺十二烷基硫酸酯和POE十二烷基硫酸钠；N-酰基肌氨酸盐，例如月桂酰基肌氨酸钠，和N-肉豆蔻酰基-N-甲基牛磺酸钠，椰油脂肪酸甲基牛磺酸盐等；高级脂肪酸酰胺磺酸盐，例如月桂酰基甲基牛磺酸钠；磷酸酯，例如POE油基醚磷酸钠和POE硬脂基醚磷酸酯；磺基琥珀酸盐，例如二-2-乙基己基磺基琥珀酸钠、一月桂酰基一乙醇酰胺聚氧乙烯磺基琥珀酸钠和月桂基聚丙二醇磺基琥珀酸钠；烷基苯磺酸盐，例如直链十二烷基苯磺酸钠、三乙醇胺直链十二烷基苯磺酸盐和直链十二烷基苯磺酸；N-酰基谷氨酸盐，例如N-月桂酰基谷氨酸一钠、N-硬脂酰基谷氨酸二钠和N-肉豆蔻酰基-L-谷氨酸一钠；高级脂肪酸酯硫酸盐，例如氢化椰油甘油脂肪酸酯硫酸钠；硫酸化油，例如土耳其红油，和POE烷基醚羧酸酯，POE烷基烯丙基醚羧酸酯，α-烯烃磺酸酯，高级脂肪酸酯磺酸酯，仲醇硫酸酯，高级脂肪酸链烷醇胺硫酸酯，月桂酰基一乙醇酰胺琥珀酸钠，N-棕榈酰天门冬氨酸二-三乙醇胺和酪蛋白钠。
作为阳离子表面活性剂，可以提及烷基三甲基铵盐，例如硬脂基三甲基氯化铵和月桂基三甲基氯化铵；烷基吡啶鎓盐，例如二硬脂基二甲基铵二烷基二甲基氯化铵、聚(N，N’-二甲基-3，5-亚甲基哌啶鎓)氯化物和鲸蜡基氯化吡啶鎓盐；以及烷基季铵盐，烷基二甲基苄基铵盐，烷基异喹啉鎓盐，二烷基吗啉鎓盐，POE烷基胺，烷基胺盐，聚胺脂肪酸衍生物，戊醇脂肪酸衍生物，苯扎氯铵，苯索氯铵等。
作为两性表面活性剂，可以提及基于咪唑啉的两性表面活性剂，例如2-十一烷基-N，N，N-(羟乙基羧甲基)-2-咪唑啉钠和1-羧乙氧基二钠2-椰油基-2-咪唑啉鎓氢氧化物，和甜菜碱基表面活性剂，例如2-十七烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉鎓甜菜碱、甜菜碱月桂基二甲基氨基乙酸盐、烷基甜菜碱、酰氨基甜菜碱和磺基甜菜碱。
作为亲脂性非离子表面活性剂，可以提及脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇一油酸酯、脱水山梨糖醇一异硬脂酸酯、脱水山梨糖醇一月桂酸酯、脱水山梨糖醇一棕榈酸酯、脱水山梨糖醇一硬脂酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯、二甘油脱水山梨糖醇五-2-乙基己酸酯和二甘油脱水山梨糖醇四-2-乙基己酸酯；甘油聚甘油脂肪酸，例如一棉油脂肪酸甘油、甘油一芥酸酯、甘油倍半油酸酯、甘油一硬脂酸酯、甘油α，α’-油酸酯焦谷氨酸酯，或苹果酸等；丙二醇脂肪酸酯，例如丙二醇一硬脂酸酯，和氢化蓖麻油衍生物、甘油烷基醚、聚氧乙烯甲基聚硅氧烷共聚物等。
作为亲水性非离子表面活性剂，可以提及POE脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如POE脱水山梨糖醇一油酸酯、POE-脱水山梨糖醇一硬脂酸酯、POE-脱水山梨糖醇一油酸酯和POE-脱水山梨糖醇四油酸酯；POE山梨糖醇脂肪酸酯，例如POE-山梨糖醇一月桂酸酯、POE-山梨糖醇一油酸酯、POE-山梨糖醇五油酸酯和POE-山梨糖醇一硬脂酸酯；POE甘油脂肪酸酯，例如POE-甘油一硬脂酸酯、POE-甘油一异硬脂酸酯和POE-甘油三异硬脂酸酯；POE脂肪酸酯，例如POE一油酸酯、POE二硬脂酸酯、POE二油酸酯和乙二醇二硬脂酸酯；POE烷基醚，例如POE月桂醚，POE油醚、POE硬脂醚、POE二十二烷醚、POE 2-辛基十二烷基醚和POE胆甾烷醇醚；POE烷基苯基醚，例如POE辛基苯基醚、POE壬基苯基醚和POE二壬基苯基醚；普卢诺尼克类，例如普卢诺尼克酸；POE·POP烷基醚，例如POE·POP鲸蜡醚、POE·POP 2-癸基十四烷基醚、POE·POP一丁基醚、POE·POP氢化羊毛脂和POE·POP甘油醚；四POE·四POP乙二胺缩合物，例如tetronics；蓖麻油和氢化蓖麻油衍生物，例如POE蓖麻油、POE氢化蓖麻油、POE氢化蓖麻油一异硬脂酸酯、POE氢化蓖麻油三异硬脂酸酯、POE氢化蓖麻油一焦谷氨酸一异硬脂酸二酯和POE氢化蓖麻油马来酸、POE蜂蜡/羊毛脂衍生物，例如POE山梨糖醇蜂蜡；链烷醇酰胺，例如椰油脂肪酸二乙醇酰胺、月桂酰基一乙醇酰胺和脂肪酸异丙醇酰胺；以及POE丙二醇脂肪酸酯、POE烷基胺、POE脂肪酸酰胺、蔗糖脂肪酸酯、POE壬基苯基甲醛缩合物、烷基乙氧基二甲基胺氧化物和三油基磷酸。
作为上述防腐剂，可以提及对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等。
作为上述金属离子螯合剂，可以提及乙二胺四乙酸钠、EDTA等。
作为上述水溶性聚合物，可以提及天然聚合物、半合成聚合物、合成聚合物和无机聚合物。
作为天然水溶性聚合物，可以提及阿拉伯胶、黄蓍胶、半乳聚糖、瓜尔胶、角豆树胶、刺梧桐胶、角叉菜胶、罗望子胶、汉生胶、果胶、琼脂、槲栌籽、胶体藻类(海藻提取物)、淀粉(稻、玉米、土豆、小麦)、植物聚合物例如甘草酸，微生物聚合物如汉生胶、葡聚糖、琥珀酸聚糖和支链淀粉，以及动物聚合物例如胶原、酪蛋白、白蛋白和明胶。
作为半合成水溶性聚合物，可以提及基于淀粉的聚合物，例如糊精、羧甲基淀粉和甲基羟丙基淀粉，基于纤维素的聚合物，例如甲基纤维素、硝基纤维素、乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、二甲基二烷基(12-20)硫酸纤维素铵、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)、结晶纤维素和纤维素粉，以及含藻酸的大分子，例如藻酸钠和藻酸丙二醇酯。
作为合成水溶性聚合物，可以提及乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物和烷基改性的聚乙烯基聚合物；聚氧乙烯聚合物，例如聚乙二醇2000、4000和6000，基于聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物的聚合物；丙烯酸聚合物，例如聚丙烯酸钠、聚丙烯酸乙烯酯和聚丙烯酰胺，以及聚乙烯亚胺，阳离子聚合物等。
作为无机水溶性聚合物，可以提及膨润土、硅酸镁铝、合成锂皂石、锂蒙脱石、硅酸酐等。
作为上述粉末组分，可以提及无机粉末，例如滑石、高岭土、云母、绢云母、白云母、青铜云母、合成云母、鳞云母、黑云母、锂云母、蛭石、碳酸镁、碳酸钙、硅酸铝、硅酸钡、硅酸钙、硅酸镁、硅酸锶、金属钨酸盐、镁、硅石、沸石、硫酸钡、煅烧硫酸钙(烧石膏)、磷酸钙、氟磷灰石、羟基磷灰石、陶瓷粉、金属皂(肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙、硬脂酸铝)和氮化硼；有机粉末，例如聚酰胺树脂粉(尼龙粉)、聚乙烯粉、聚甲基丙烯酸甲酯粉、聚苯乙烯粉、苯乙烯/丙烯酸共聚物树脂粉、苯鸟粪胺树脂粉、聚四氟乙烯粉和纤维素粉；无机白色颜料，例如二氧化钛和氧化锌；无机红色颜料，例如氧化铁(三氧化二铁)和钛酸铁；无机棕色颜料，例如γ-氧化铁；无机黄色颜料，例如黄色氧化铁和黄土；无机黑色颜料，例如黑色氧化铁、碳黑和低级氧化钛；无机紫色颜料，例如芒果紫和钴紫；无机绿色颜料，例如氯化铬、氢氧化铬和钛酸钴；无机蓝色颜料，例如群青和普鲁士蓝；珠光颜料，例如氧化钛涂层的云母、氧化钛涂层的氯氧化铋、氧化钛涂层的滑石、有色氧化钛涂层的云母、氯氧化铋和珠光剂；金属粉末颜料，例如铝粉和铜粉；锆、钡和铝色淀的有机颜料，例如201号红、202号红、204号红、205号红、220号红、226号红、228号红、405号红，203号橙、204号橙、205号黄、401号黄、404号黄、3号红、104号红、106号红、227号红、230号红、401号红、505号红、205号橙、4号黄、5号黄、202号黄、203号黄、3号绿和1号蓝；天然颜料，例如叶绿素和β-胡萝卜素，或钛黄、红花素、红花红色素等。
上述紫外线防护剂包括化学吸收紫外线的物质(即“紫外吸收剂”)和通过物理作用散射或反射紫外线的物质(即“紫外遮蔽剂”)。
作为长波长紫外线(UVA)吸收剂，可以提及含邻氨基苯甲酸的紫外吸收剂，例如邻氨基苯甲酸甲酯和N-乙酰基-邻氨基苯甲酸高酯；含二苯酮的紫外吸收剂，2，4-二羟基二苯酮、2，2-二羟基-4-甲氧基二苯酮、2，2’-二羟基-4，4’-二甲氧基二苯酮、2，2’，4，4’-四羟基二苯酮、2-羟基-4-甲氧基二苯酮和2-羟基-4-甲基-4’-甲基二苯酮、2-羟基-4-甲氧基二苯酮-5-砜盐酸盐、4-苯基二苯酮、4’-苯基二苯酮-2-甲酸2-乙基己酯、2-羟基-4-正辛氧基二苯酮和4-羟基-3-羧基二苯酮；含苯并三唑的紫外吸收剂，例如2，2’-羟基-5-甲基苯基苯并三唑、2-(2’-羟基-5’-叔辛基苯基)苯并三唑和2-(2’-羟基-5’-甲基苯基)苯并三唑，以及二茴香酰基甲烷、4-甲氧基-4’-叔丁基二苯甲酰基甲烷等。
在这些长波长紫外线吸收剂中，因其非常安全和有效而优选4-甲氧基-4’-叔丁基二苯甲酰基甲烷、2-羟基-4-甲氧基二苯酮和2-羟基-4-甲氧基二苯酮-5-砜盐酸盐。
作为中波长紫外线(UVB)吸收剂，可提及含苯甲酸的紫外吸收剂，例如对氨基苯甲酸(此后称作PABA)、PABA一甘油酯、N，N-二丙氧基PABA乙酯、N，N-二乙氧基PABA乙酯、N，N-二甲基PABA乙酯、N，N-二甲基PABA丁酯和N，N-二甲基PABA戊酯；含水杨酸的紫外吸收剂，例如一缩二丙二醇水杨酸酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酸肉豆蔻酯、水杨酸甲酯、水杨酸戊酯、水杨酸酯、水杨酸高酯、水杨酸辛酯、水杨酸苯酯、水杨酸苄酯和水杨酸对异丙基苯酯；含肉桂酸的紫外吸收剂，例如肉桂酸辛酯、4-异丙基肉桂酸乙酯、2，5-二异丙基肉桂酸甲酯、2，4-二异丙基肉桂酸乙酯、2，4-二异丙基肉桂酸甲酯、对甲氧基肉桂酸丙酯、对甲氧基肉桂酸异丙酯、对甲氧基肉桂酸异戊酯、对甲氧基肉桂酸辛酯(对甲氧基肉桂酸2-乙基己酯)、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基乙酯、对甲氧基肉桂酸环己酯、α-氰基-β-苯基肉桂酸乙酯、α-氰基-β-苯基肉桂酸2-乙基己酯和甘油基一2-乙基己酰基-二对甲氧基肉桂酸酯、甲氧基肉桂酸辛酯、3，4，5-三甲氧基肉桂酸3-甲基-4-[甲基二(三甲基硅氧烷基)甲硅烷基]丁酯和对二甲氧基肉桂酸一乙酯；樟脑衍生物，例如3-(4’-甲基亚苄基)-d，l-樟脑、3-亚苄基-d，l-樟脑和5-(3，3-二甲基-2-亚降冰片基)-3-戊炔-2-酮；以及尿刊酸、尿刊酸乙酯、2-苯基-5-甲基苯并噁唑、二异苄基吖嗪等。
作为紫外阻断剂，可以提及氧化钛(TiO2)、滑石(MgSiO2)、洋红(FeO2)、膨润土、高岭土、氧化锌(ZnO)等。
作为保湿剂的实例可以提及聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、1，3-丁二醇、己二醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸粘液素、charonin acid、atelo胶原、胆甾醇-12-羟基硬脂酸、乳酸钠、胆汁盐、d，l-吡咯烷酮甲酸、短链可溶性胶原、一缩二甘油(EO)PO加合产物、栗提取物、欧蓍草提取物、熏草黄提取物等。
作为药物，可以提及熊果苷、维生素C及其衍生物、曲酸、胎盘提取物、谷胱甘肽、增白剂，例如老鹳草提取物、甘草酸衍生物、甘草次酸衍生物、水杨酸衍生物、日扁柏酚、氧化锌、消炎剂，例如尿囊素、王浆、光敏元素、胆甾醇衍生物、活化剂，例如小牛溶血提取物、壬酸香兰基酰胺、烟酸苄酯、烟酸β-丁氧基乙酯、辣椒碱、姜酮、斑蝥酊、鱼石脂、咖啡因、鞣酸、α-冰片、烟酸生育酚酯、肌醇六烟酸酯、环扁桃酯、桂利嗪、妥拉唑林、乙酰胆碱、血循环促进剂，例如维拉帕米、千金藤碱和γ-orizanol；或抗皮脂溢药，例如硫和二甲硫蒽；以及出于多种目的，黄檗树皮提取物成分、黄连提取物成分、紫草提取物组分、牡丹提取物成分、獐牙菜提取物成分、桦树提取物成分、洋苏草提取物成分、枇杷提取物成分、胡萝卜提取物成分、芦荟提取物成分、锦葵提取物成分、鸢尾提取物成分、葡萄提取物成分、薏苡子提取物成分、丝瓜络提取物成分、百合提取物成分、藏红花提取物成分、蛇床根提取物成分、姜提取物成分、St.John’s麦芽汁提取物成分、cammock提取物成分、迷迭香提取物成分、大蒜提取物成分、辣椒提取成分、柑橘皮、当归根等，维生素A类例如视黄醇和乙酸视黄醇，维生素B2类例如核黄素、核黄素丁酸酯和黄素腺嘌呤核苷酸，维生素B6类例如盐酸吡哆醇和吡哆醇二辛酸酯，维生素C类例如L-抗坏血酸、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸2-硫酸酯钠、L-抗坏血酸磷酸酯和DL-α-生育酚-L-抗坏血酸磷酸二酯二钾，泛酸衍生物例如泛酸钙、D-泛醇、泛基乙基醚和乙酰基泛基乙基醚，维生素D类例如麦角骨化醇和胆钙化甾醇，烟酸衍生物例如烟酸、烟酰胺和烟酸苄酯，维生素E类例如α-生育酚、生育酚乙酸酯、DL-α-生育酚烟酸酯和DL-α-生育酚琥珀酸酯，以及其它维生素例如维生素P、生物素等。
这些药物可以以宽范围加入，只要它们的加入不损害本发明的预期效果即可。
以这种方式制备的本发明制剂可以预防伴随有结构改变的基膜机能的丧失，并能促进皮肤的活化。
自接种表皮细胞的第4天，将培养基用(1)不含化合物(-化合物A)，(2)含10μM的化合物A(+化合物A)、(3)含10μM化合物A和10μg/ml抑肽酶(+化合物A+抑肽酶)、(4)含10μM的化合物A和1ng/ml白介素-1β(+化合物A+IL-1)、(5)含10μM的化合物A、1ng/ml白介素-1β和10μg/ml抑肽酶(+化合物A+IL-1+抑肽酶)、(6)含10μM化合物A和1ng/ml TFG-α(+化合物A+TGFα)、(7)含10μM化合物A、1ng/ml的TGF-α和10μg/ml抑肽酶(+化合物A、+TGFα+抑肽酶)、(8)含10μM化合物A和100ng/mlPDGF(+化合物A+PDGF)和(9)含10μM的化合物A、100ng/ml PDGF和10μg/ml抑肽酶(+化合物A+PDGF+抑肽酶)的培养基更换，并且此后每2-3天用含有相同类型和相同浓度的基质金属蛋白酶、细胞外基质生成促进剂(细胞因子)和丝氨酸蛋白酶抑制剂的培养基更换，此后进行2周的培养。
形成的人造皮肤用苏木精和曙红(H&E)和免疫染色法(用抗IV型胶原抗体和抗VII型胶原抗体)进行染色。结果如

图1-4所示。
虽然事实上在对照(1)中观察不到直接位于基础角质细胞下的VII型胶原的染色，但当加入基质金属蛋白酶抑制剂化合物A(2)时则可以观察到微弱但明确的VII型胶原染色。当除了基质金属蛋白酶抑制剂化合物A以外还加入丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(3)时VII型胶原的染色进一步增强。当化合物A与基质蛋白生成促进化合物白介素1(IL-1)(4)、转化生长因子-α(TGF-α)(6)和血小板衍生的生长因子(PDGF)(8)组合时，VII型胶原的染色特别强。当基质蛋白生成促进化合物白介素1(IL-1)(5)、转化生长因子-α(TGF-α)(7)和血小板衍生的生长因子(PDGF)(9)与抑肽酶和化合物A组合时，IV型和VII型胶原的染色直接在基础角质细胞下清晰地加浓，得到明显染色的图象，因此暗示各分子可能构成了适当的三维结构。
利用下列植物提取物代替上述基质金属蛋白酶抑制剂化合物A进行与上述相同的培养过程。
百里香，阔叶缬草和败酱科的其他植物，柿属Thunberg(柿树科)，紫云英(豆科)，野山楂(蔷薇科)，牡丹(Poeonia montan Sims)(芍药科)，大叶荼属var.assamiea Pierre(山茶科)，蓝桉和桃金娘科的其他植物，洋委陵菜(蔷薇科)，欧洲小叶椴，阔叶椴、欧洲椴(椴树科)，垂枝桦(桦木科)，欧牛至，儿荼钩腾(茜草科)，胡桃或核桃科的其他植物，苦参(豆科)，地榆(蔷薇科)，贯叶金丝桃或小连翘(山竹子科)，大叶荼(山茶科)，姜黄(姜科)，姜黄粉纯化的提取姜黄，珠仔树，香附子、干膜莎草、芳香白珠树，金合欢属fornensia，诃子(Terminalia chebula)，孟加拉榕(榕树科)，腊肠树，南烛，海棠果，菩提树等。
得到与用化合物A作为基质金属蛋白酶时相似的结果。
用下列植物提取物代替上述丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶进行与上述相同的培养过程。
巴西胡桐、杨梅属sphaerocarpa DC、山香属crenata Pohl exBenth、C.rotundus L、E.sylvestris var.ellipticus和E.decipiens Helmsl.；和蔷薇属、悬钩子属、蚊子草属和蔷薇科的山楂属的植物；芍药科芍药属的植物；桑科律草属的植物；菊科阿尼菊属的植物和菊科春黄菊属的植物；鹿蹄草科的植物；金丝桃科的植物；辣薄荷属和留兰香属的植物；菊科红花属、牦牛儿草科童氏老鹳草和葡萄科葡萄属的植物；桦木科的植物，例如垂枝桦属、桦木Lutea L.属和垂枝桦属；蔷薇科李属的植物，其是杏(杏属、野杏属、光叶东北杏属、山杏属)；和漆树(zapote)、que shar、sano-sano、扇衣属de cavallo等。
得到与用抑肽酶作为丝氨酸蛋白酶抑制剂时相似的结果。
用下列层粘连蛋白5生成促进剂代替基质蛋白生成促进剂IL-1、TGF-α和PDGF进行与上述相同的培养过程甘草属、百合黑果莓、jitanoki、波叶青牛胆、胡芦巴、罂粟属Bocconia palo amarillo、豆科四棱豆、豆科决明属retama、龙胆科Erythraea chilensis(canchalagua)、大豆、葛根、cammock、草木犀、抽芽、红豆等。用pule(糖胶树)、山毛榉(欧洲水青冈属)、野葛藤(野葛属)和英国常春藤(洋常春藤)提取物作为IV型胶原或VII型胶原生成促进剂，并且用兰花提取物作为VII型胶原生成促进剂进行相同的培养。得到在使用IL-1、TGF-α和PDGF时相似的结果。
在加入基质金属蛋白酶抑制剂化合物A之后(2)或加入丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(3)和基质金属蛋白酶抑制剂化合物A之后用透射电子显微镜观察直接位于表皮下的基膜结构，并且如图5所示，化合物A可诱导基膜的形成，而进一步加入抑肽酶可增强电子密度并提高基膜的连续性。实施例2使用细胞外基质生成促进剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂制备人造皮肤重复实施例1的方法，但用下列试验物质完成培养过程。
(1)不加入(对照)；(2)30μg/ml的层粘连蛋白5生成促进剂“大豆溶血卵磷脂”单用(大豆LPC)；(3)0.5％丝氨酸蛋白酶抑制剂“薄荷提取物”单用；(4)0.3％IV型和VII型胶原生成促进剂“山毛榉芽提取物”单用；(5)30μg/ml的层粘连蛋白5生成促进剂“大豆溶血卵磷脂”、0.5％丝氨酸蛋白酶抑制剂“薄荷提取物”和0.3％IV型和VII型胶原生成促进剂“山毛榉芽提取物”(混合物)。
形成的人造皮肤用苏木精和曙红(H&E)染色并进行免疫染色(用抗IV型胶原抗体和抗VII型胶原抗体)。结果如图6和7所示。
在对照(1)中，IV型胶原染色微弱，而事实上观察不到VII型胶原的染色。相反，IV型胶原的染色在层粘连蛋白5生成促进剂大豆溶血卵磷脂(2)的作用下增强。VII型胶原的染色在薄荷提取物(3)的作用下增强。IV型和VII型胶原的生成在山毛榉提取物(4)的作用下增强。通过将它们组合(5)，致密VII型胶原的染色明显增强。
苯氧基乙醇 适量珍珠提取物 适量山毛榉芽提取物 1.0大豆溶血卵磷脂(Lipidure) 0.1薄荷提取物 1.0(制备方法)分别将A相和B相在70℃加热至完全溶解。将A相加入到B相中并用乳化剂乳化。用热交换器冷却该乳液得到霜剂。粗糙皮肤预防和粗糙皮肤改善作用试验将具有上述实施例3的配方的霜剂用于对28-65岁的女性受试者进行粗糙皮肤预防和粗糙皮肤改善作用的试验。具体而言，将实施例3的霜剂每天涂抹在健康妇女的面部共4周。通过下列方法观察皮肤的状况。用Tewameter TM210(Courage and Khazaka Electric GmbH)按照制造商提供的说明测定透表皮失水，并且用Cornemeter CM 825C(Courage andKhazaka Electric GmbH)按照制造商提供的说明测定角质层水分。通过用涂有氰基丙烯酸酯胶(Cyanolit，Eleco的产品)的玻片取皮肤表面复制品并且用光学显微镜(OLYMPUS SZ 4045 TR)目测观察皮肤表面形成沟脊的情况来进行皮肤表面复制品分析。表2涂抹4周对透表皮失水的改善(减轻)改善率对照部位*霜剂涂抹部位15％27％(p＜0.002)*对照部位没有涂抹霜剂表3涂抹4周对角质层水分的改善(增高)改善率对照部位*霜剂涂抹部位-1％22％(p＜0.001)*对照部位没有涂抹该霜剂表4涂抹4周对皮肤表面复制品的改善霜剂涂抹的改善率 43％(p＜0.002)显示透表皮失水改善作用的表2中的结果表明，连续涂抹4周该霜剂可以改善皮肤，恢复屏障作用并且减少表皮的排汗。
显示角质层水分改善作用的表3中的结果表明，连续涂抹4周该霜剂可以改善皮肤，增加角质层水分并改进皮肤状况。
另外，显示皮肤表面纹理改善作用的表4中的结果表明，连续涂抹4周该霜剂可以改善皮肤，改善由沟脊组成的皮肤表面纹理，并且全面改善皮肤状况。
现在说明本发明的皮肤外用制剂在不同剂型下的配方实例。
乙酰化透明质酸 2.0氢氧化钾 0.5磷酸抗坏血酸酯镁 0.5凝血酸 0.1乙二胺四乙酸三钠 适量山毛榉芽提取物 1.0大豆溶血卵磷脂(Lipidure) 0.1薄荷提取物 1.0纯净水 适量(制备方法)分别将油相A和水相B在70℃下加热至完全溶解。将A相加入到B相中并用乳化剂乳化。用热交换器冷却该乳液得到霜剂。
山毛榉芽提取物 1.0大豆溶血卵磷脂(Lipidure) 0.1薄荷提取物 1.0乙二胺四乙酸二钠 适量纯净水 余量(制备方法)该霜剂按照与实施例4相同的方式制备。
(4)乙醇(95％) 8.0(5)山毛榉芽提取物 1.0(6)大豆溶血卵磷脂(Lipidure)0.1(7)薄荷提取物 1.0(8)防腐剂 适量(9)芳香剂 适量(10)纯净水 余量(制备方法)将组分(4)、(8)和(9)混合，并在80℃下将该混合物加入到(1)、(2)、(3)和(5)、(6)、(7)和(10)的混合溶液中同时搅拌，此后使该混合物冷却至室温得到面膜。
如上所述，本发明的皮肤外用制剂具有优良的基膜改善作用以及优良的改善和预防多种皮肤疾病和粗糙皮肤的作用，同时还可以通过改善皮肤来提供防止皮肤老化的作用。
参见图8，通过比较对照组中的移植人造皮肤，可以看出，表皮下的一些层粘连蛋白5区域仍然未被染色，而在基质金属蛋白酶抑制剂化合物A和抑肽酶存在下培养的组中，得到了更好和几乎均匀的层粘连蛋白5染色。在移植7天后进行的组织学分析证实，在对照组中，观察到了人造皮肤中真皮表皮接合处的缝隙，还发现染色的层粘连蛋白5的区域加宽，这暗示存在基膜损伤的可能性，而且，表皮的厚度和结构较差。相反，在添加剂组中，真皮-表皮接合处的结构良好，并且还表现出层粘连蛋白5的连续染色。此外，表皮的状态较好。
此外，当对人造皮肤和真皮之间的边界部分进行观察时可以清楚发现这种差异。具体地讲，当移植具有良好基膜的人造皮肤时，与对照组相比，可以看出移植的人造皮肤具有良好的粘附性，并且观察到来自于人的层粘连蛋白5的染色和β-微球蛋白的染色(其可特异性地识别人细胞)非常接近边界，并且这种令人满意的皮肤可以防止来自小鼠的表皮的渗透作用。另外，还可促进源自该边界部分的血管生成。因此，如果移植由于掺入了基质金属蛋白酶抑制剂和抑肽酶而具有良好基膜的人造皮肤，可以看出移植后状态得到显著改善。
比较有关移植18天后的状态的外部照片(图9)，与无添加剂的对照相比，在由于掺入了基质金属蛋白酶抑制剂和抑肽酶而具有良好基膜的人造皮肤组中，抑制了小鼠四周皮肤引起的收缩，并且还明显改善了表面角质层的形成。
由此证实，移植具有良好基膜的皮肤模型可以得到优良粘附性的移植皮肤，以及由于表皮和真皮状况更加令人满意而使移植位置更加容易保持。
丝氨酸蛋白酶抑制剂与IV型和/或VII型胶原和层粘连蛋白5(它们是表皮基膜的主要成分)的生成促进剂可以显著提高基质金属蛋白酶抑制剂的基膜形成促进作用。
所属领域技术人员应该理解，本发明在上文中结合具体实施方式
和实施例进行了描述，但本发明并不由此受到限定，并且从这些实施方式、实施例和用途得到的许多其它实施方式、实施例、用途、改进和变化并不脱离本申请的发明范围。
权利要求
1.一种皮肤基膜结构形成促进制剂，其含有一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂作为活性成分。
2.权利要求1所述的皮肤基膜结构形成促进制剂，其进一步含有一种或多种细胞外基质蛋白生成促进剂作为活性成分。
3.按照权利要求2的皮肤基膜结构形成促进制剂，其中所述的细胞外基质蛋白是选自IV型胶原、VII型胶原和层粘连蛋白5的一种或多种。
4.权利要求1-3任一项所述的皮肤基膜结构形成促进制剂，其进一步含有一种或多种基质金属蛋白酶抑制剂作为活性成分。
5.权利要求1-4任一项所述的皮肤基膜结构形成促进制剂，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂是抑肽酶。
6.权利要求1-5任一项所述的皮肤基膜结构形成促进制剂，其中所述的细胞外基质蛋白生成促进剂是白介素-1、转化生长因子-α或血小板衍生的生长因子。
7.权利要求1-6任一项所述的皮肤基膜结构形成促进制剂，其是皮肤外用制剂。
8.一种制备人造皮肤的方法，其包括培养人造皮肤形成培养基的步骤，其特征在于向所述人造皮肤形成培养基中加入一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于向所述人造皮肤形成培养基中进一步加入一种或多种细胞外基质蛋白生成促进剂。
10.权利要求9所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白是选自IV型胶原、VII型胶原和层粘连蛋白5的一种或多种。
11.权利要求8-10任一项所述的方法，其中进一步加入一种或多种基质金属蛋白酶抑制剂。
12.权利要求8-11任一项所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是抑肽酶。
13.权利要求8-12任一项所述的方法，其中所述的细胞外基质蛋白生成促进剂是白介素-1、转化生长因子-α或血小板衍生的生长因子。
14.一种皮肤外用制剂，其特征在于含有山毛榉科水青冈属植物的提取物、下列通式(1)或(2)所示的1-酰基溶血磷脂和唇形科薄荷属植物的提取物 其中R1表示具有11-24个碳原子的饱和脂肪酸基团或具有18、20、22或24个碳原子和1-4个不饱和双键的脂肪酸基团，R2表示具有13-24个碳原子的饱和脂肪酸基团或者具有18、20、22或24个碳原子和1-4个不饱和双键的脂肪酸基团，并且M表示H或碱金属原子。
15.权利要求14所述的皮肤外用制剂，其是用于改善粗糙皮肤的皮肤外用制剂。
16.权利要求14所述的皮肤外用制剂，其是用于抗老化的皮肤外用制剂。
17.权利要求14-16任一项所述的皮肤外用制剂，其含有0.001-5.0重量％的山毛榉科水青冈属植物的提取物、0.001-1.0重量％的1-酰基溶血磷脂和0.001-5.0重量％的唇形科薄荷属植物的提取物。
全文摘要
本发明涉及含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的表皮基膜结构形成促进制剂和皮肤外用制剂，并且其中选择性地含有表皮基膜的细胞外基质蛋白成分的生成促进剂。本发明还提供一种人造皮肤形成培养基，作为制备具有充分形成的基膜的人造皮肤的手段，该培养基含有丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且选择性地含有表皮基膜的细胞外基质蛋白成分的生成促进剂和基质金属蛋白酶抑制剂，以及一种制备它的方法。
文档编号A61K38/22GK1465338SQ0310003
公开日2004年1月7日 申请日期2003年1月6日 优先权日2002年6月18日
发明者天野聡, 小仓有纪, 松永由纪子, 津田孝也, 青山由香里, 古贺信义, 义, 也, 天野 , 纪, 纪子, 香里 申请人:株式会社资生堂