专利名称：用鳖或/和龟的血清提取的糖缀合物chb和制备工艺及其在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，其产品可用于制造医药保健品类，具体说是涉及一种用生物技术将鳖或/和龟的血清中提取糖缀合物CHB的制备工艺及该糖缀合物在制备治疗和预防与免疫相关疾病、造血系统相关疾病、肝病和降低AFP及抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
中华鳖(Trionyx Sinesis)俗称甲鱼，是我国的一种传统动物中药，据众多古代医书记载，甲鱼具有“滋阴清热，软坚散结”的功效。用于“肾阴不足，肝风内动，消瘀肿，敛溃痈”等治疗。鳖血得鳖的全身精华，其味甘微咸、其性平微温。甘能补中益血入心脾，咸能滋阴填精养肝肾。所以古今文献如《本草纲目》，《中药大词典》等多有记载，经过长期实践认识到，“鳖血之性急缩走血”，在临床上除了治疗“虚劳骨蒸潮热”，还用以治疗“目瞬、唇动、口歪”等症。清代名医擅用鳖血，常用鳖血拌炒柴胡、拌炒青蒿用以治疗阴虚发放、虚劳骨蒸潮热。国内外对甲鱼血有效成分的研究报道很少，国外曾报道从海龟(turtle)血中分离到一种性甾体结合蛋白(Sexsteroid-binding protein，SBP)，其含量为人血浆的4000倍，但其生理功能尚未阐明。国内曾报道从甲鱼肉中分离到一种粗蛋白，称具有促抗体生成，抗疲劳作用，但尚未见到有甲鱼血的研究报道，而通常将甲鱼血作为废弃物处理。糖缀合物CHB是从鳖或/和龟的血清中分离、提取得到的一种多糖化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鳖或/和龟的血清中分离、提取得到的一种糖缀合物CHB。
本发明的另一目的是提供上述糖缀合物CHB的制备工艺。
本发明的还有一个目的是提供上述糖缀合物CHB在制备药物中的应用。
实际上，本发明涉及上述糖缀合物CHB在制备治疗和预防与免疫相关疾病、肝病和降低AFP及抗肿瘤药物中的应用。
还涉及上述糖缀合物CHB在制备治疗和预防与造血系统相关疾病药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下措施来达到一、材料经预处理后的鳖或/和龟的血清。
二、分离提取1.分离将经预处理的鳖和/或龟的血清用膜分离一次，或对水透析12～36小时，以除去小分子物质，离心分离得上清液(I)；2.提取在上清液(I)中加入乙醇或丙酮，直至沉淀完全；3.再分离取出沉淀，用适量水溶解、离心分离后得上清液(II)；将上清液(II)再用膜分离一次或对水透析16～32小时，离心得上清液(III)；4.后处理将上清液(III)进行减压浓缩、冷冻干燥，得糖缀合物；必要时可用乙醇或丙酮精制。
糖缀合物CHB的的理化性质一、性状本品为白色或类白色粉末状固体、无臭、易溶于水，水溶液pH为6.5～7.0。
二、化学组成1.中性糖含量为5～10％。
2.元素分析结果C在40.36～42.61％，H在6.8～7.18％，N在9.97％～13.29％。根据含N量计算，蛋白质含量在60～80％。
3.氨基酸分析结果糖缀合物CHB含18种氨基酸(色氨酸未测)，各种氨基酸的含量比例如下表
三、理化性质1.紫外光谱除了在远紫外区有-OH等强烈吸收外，在275mm附近有明显蛋白质吸收峰。
2.红外光谱3392cm-1为-OH伸缩振动吸收，1658cm-1为酰氨键羰基特征峰，1200～1010cm-1处有三个吸收峰为糖环吸收。
3.高效液相色谱(HPLC)行为色谱柱为TSK-G2000SW，流动相为水，流速为1.0ml/min。在14.0min附近有一吸收峰，含量在80～90％。
4.分子量估测用上述TSK-G2000SW柱条件，糖缀合物CHB主峰的分子量分布约为2000～5000。
图1为该糖缀合物CHB的紫外光谱。
图2为该糖缀合物CHB的红外光谱。
图3为该糖缀合物CHB的高效液相色谱。
具体实施例方式
下面通过实施例、活性实验例进一步阐明本发明所述的糖缀合物CHB的制备工艺、生理活性及其在制备治疗与免疫相关疾病、造血液系统疾病、肝病及抗肿瘤药物中的应用。
取经预处理后的鳖或/和龟的血清血500毫升，用截留分子量为500～1000道尔顿的钠滤膜分离后，加入5倍体积的无水乙醇提取得沉淀，静置过夜，取出沉淀，先用适量的水溶解，再用截留分子量500～1000道尔顿钠滤膜分离。母液经离心后将上清液减压浓缩、冷冻干燥得糖缀合物CHB980mg，得率1.97mg/mL。该糖缀合物中含性糖5.1％，含氮量为9.97％，含18种氨基酸(色氨酸未测)。
取经预处理后的鳖或/和龟的血清500毫升，用截留分子量为500～1000道尔顿的透析膜对水透析48小时后，减压浓缩，加入5倍体积的丙酮提取得沉淀。静置过夜，取出沉淀，先用适用量的水溶解，再用上述透析膜对水透析48小时后，离心分离，将上清液减压浓缩、冷冻干燥，得糖缀合物CHB1050mg，得率为2.1mg/mL。该糖缀合物中含中性糖5.2％，含氮量为13.29％，含18种氨基酸(色氨酸未测)。
生物之光口服液及糖缀合物CHB对小鼠免疫功能影响的比较性研究实验材料1、生物之光口服液及糖缀合物CHB由常州宁康生物工程公司提供2、Balb/c小鼠购自上海第二医科大学动物房3、羊红细胞4、ConA购自Sigma公司；印度墨汁补体取自新鲜豚鼠血清实验方法1、将按以下方案分组，每组7只(1)生理盐水组5ml/kg(2)生物之光口服液组5ml/kg(3)糖缀合物CHBa1组51mg/kg(4)糖缀合物CHBa3组4.5mg/kg
(5)糖缀合物CHBb1组415mg/kg(6)糖缀合物CHBb3组10mg/kg(7)糖缀合物CHB1组4.2mg/kg(8)糖缀合物CHB3组1.5mg/kg注生物之光口服液为鳖或/和龟的血液用中性蛋白酶生物酶解以后加动物鞭的酒精浸出液配制成的口服液；CHBa1为鳖或/和龟的血液用中性蛋白酶生物酶解以后的CHB粗提取物；CHBa3为鳖或/和龟的血液用中性蛋白酶生物酶解以后的CHB精提取物；CHBb1为鳖或/和龟的血液用中性蛋白酶生物酶解以后加动物鞭的酒精浸出液的CHB粗提取物；CHBb3为鳖或/和龟的血液用中性蛋白酶生物酶解以后加动物鞭的酒精浸出液的CHB精提取物；CHB1为鳖或/和龟的血清的CHB粗提取物；CHB3为鳖或/和龟的血清的CHB精提取物；连续15天胃饲小鼠，生物之光口服液及糖缀合物CHB的用量按小鼠重量计，由常州宁康生物工程公司提供。
2、小鼠脾脏细胞制备将小鼠处死，75％酒精浸泡，无菌获取脾脏。将脾脏置100目网上轻轻碾碎，滤过入试管。1000r/min，5min洗涤细胞，弃上清。用1640培养液还原细胞至4ml，轻轻铺于3ml小鼠淋巴细胞分离液(比重1.088)上，离心2000r/min，20min。吸取单个核淋巴细胞(PBL)，1000r/min，5min洗涤2遍。计数细胞，用10％FCS的1640调整PBL浓度为5×106/ml待用。
3、小鼠T淋巴细胞增殖实验(3H-TdR掺入试验)采用常规3H-TdR掺入试验。小鼠脾细胞悬液(5×106/ml)，加入96孔圆底细胞培养板内，100μl/孔，5×105/ml细胞/孔。分别加入ConA10μg/孔，对照组以1640营养液补足体积至200μl。置37℃5％CO2培养箱培养72小时。终止试验前16小时加入3H-TdRluCi/孔。用细胞收集仪将细胞吸附在玻璃纤维滤纸上，β闪烁仪测得cpm值并计算刺激指数SI。
4、小鼠碳粒廓清试验小鼠称重，按每20g体重尾静脉注射1∶2稀释的印度墨汁0.1ml，注入后立即计时。分别于第5和第10分钟用抗凝过的平口毛细管从小鼠眼眶内侧静脉丛取血0.025ml，0.1％碳酸钠溶液2ml中，于650nm波长处测吸光度(OD)值。用碳酸钠溶液校正零点。用颈椎移位法杀死小鼠，取肝、脾称重。
以公式K=logOD1-logOD2T2-T1]]>求出K值。
按α=K3WWL.S]]>校正K值，求出α值。
5、血清溶血素含量的测定胃饲10天后，每只小鼠腹腔内注射2％绵羊红细胞0.2ml，并继续胃饲至15天；取小鼠眼眶血，离心后收集血清。取血清稀释64倍后，加入96孔圆底板中，并依次加入2％SRBC，1∶10稀释的新鲜豚鼠补体，并设不加血清和不加补体的空白对照管，37℃水浴45min后，测定541nm的光密度值；SRBC半数溶血时的光密度值为1ml2％SRBC溶于7ml蒸馏水后的光密度值。
实验结果1、小鼠T淋巴细胞增殖实验(3H-TdR掺入试验)表1淋巴细胞增殖转化试验
注P值均为实验组生理盐水组结论淋巴细胞增殖实验是检测淋巴细胞功能的方法之一。本实验采用ConA(刀豆蛋白A)作为小鼠T淋巴细胞的有丝分裂剂。结果显示，小鼠T细胞在服用糖缀合物CHB后，大部分被激活，表明糖缀合物CHB对于小鼠的T细胞功能具有上调作用。
2、小鼠碳粒廓清试验表2小鼠体重、肝、脾重量
表3各组α值结果
注P值均为实验组生理盐水组结论吞噬细胞的功能之一是对外源性物质具有吞噬和清除能力。本实验采用经典的炭粒廓清实验，分析比较了生物之光口服液及糖缀合物CHB对正常小鼠吞噬细胞的功能的影响。结果表明，所有实验组的α值均大于正常对照组，经团体T检验后，只有CHB3组具有统计学的差异，表明CHB3组小鼠的吞噬细胞的吞噬能力和正常组之间有统计学上的差异。
3、血清溶血素含量的测定表4
注P值均为实验组生理盐水组结论血清溶血素部分代表了小鼠的体液免疫功能，本实验结果显示，各实验组的溶血素均大于正常对照组，且在统计学上均有意义，表明口服这些制剂后，小鼠的体液免疫功能具有明显提高，其中又以糖缀合物CHB系列组的作用更为明显。
上述三项试验结果表明生物之光口服液组及糖缀合物CHB组对上述三种小鼠免疫功能均有上调作用，表明该制剂对正常小鼠具有正向调节作用，其中CHB1和CHB3对小鼠的吞噬功能和体液免疫功能上调作用很明显。表明糖缀合物CHB可用于制备治疗和预防免疫性疾病的药物。
生物之光口服液及糖缀合物CHB对小鼠细胞诱生主要细胞因子影响的比较性研究实验材料1、生物之光口服液及糖缀合物CHB由常州宁康生物工程公司提供2、Balb/c小鼠购自上海第二医科大学动物房3、小鼠T细胞表面标志单克隆抗体购自北京医科大学免疫室4、ConA购自Sigma公司；5、小鼠细胞因子检测试剂盒购自上海森雄公司进口分装。
实验方法1、将Balb/c小鼠按以下方案分组，每组10只(1)生理盐水组(2)环磷酰胺组(3)环磷酰胺组+生物之光口服液低、高剂量组(4)环磷酰胺组+糖缀合物CHB低、中、高剂量组连续15天胃饲小鼠，生物之光口服液及糖缀合物CHB的用量按小鼠重量计，由常州宁康生物工程公司提供。
2、小鼠脾脏细胞制备将小鼠处死，75％酒精浸泡，无菌获取脾脏。将脾脏置100目网上轻轻碾碎，滤过入试管。1000r/min，5min洗涤细胞，弃上清。用1640培养液还原细胞至4ml，轻轻铺于3ml小鼠淋巴细胞分离液(比重1.088)上，离心2000r/min，20min。吸取单个核淋巴细胞(PBL)，1000r/min，5min洗涤2遍。计数细胞，用10％FCS的1640调整PBL浓度为5×106/ml待用。
3、小鼠T淋巴细胞增殖实验(3H-TdR掺入试验)采用常规3H-TdR掺入试验。小鼠脾细胞悬液(5×106/ml)，加入96孔圆底细胞培养板内，100μl/孔，5×105/ml细胞/孔。分别加入ConA10μg/孔，对照组以1640营养液补足体积至200μl。置37℃5％CO2培养箱培养72小时。终止试验前16小时加入3H-TdRluCi/孔。用细胞收集仪将细胞吸附在玻璃纤维滤纸上，β闪烁仪测得cpm值并计算刺激指数SI。
4、小鼠T细胞表面标志检测采用常规间接免疫荧光方法及流式细胞仪分析。用抗小鼠L3T4(CD4)和Lyt2(CD8)检测小鼠T细胞的表面标志。
5、小鼠NK杀伤功能检测(LDH释放法)小鼠脾细胞悬液(5×106/ml)加入96孔细胞培养板内，100μl/孔。体外传代培养的YAC-1靶细胞离心，调整细胞浓度1×105/ml。100μl/孔，1×104/孔细胞。置37℃5％CO2培养箱培养4小时，并设自然释放和最大释放组作为实验的阴阳性对照。离心1000r/min，5min。吸取上清100μl，加入LDH底物液100μl，静置3分钟显色。随后加入1NHCL中止。490nm读取OD值。计算NK细胞的杀伤百分率。
6、小鼠细胞因子的检测小鼠眼球取血，室温放置，离心获得小鼠血清；收集脾脏细胞经过刺激后的细胞培养上清，按照细胞因子检测试剂盒操作说明分别测定不同的细胞因子。
实验结果1小鼠T细胞表面标志检测表5生物之光口服液及糖缀合物CHB对小鼠T细胞亚群的影响
结论
(1)环磷酰胺组的T细胞亚群数量明显降低，CD4和CD8阳性细胞分别为对照组的55.3％和42.1％，P值＜0.05，表明环磷酰胺已造成小鼠T细胞亚群数量减少，实验系统成立。
(2)生物之光口服液和糖缀合物CHB对免疫功能低下小鼠T细胞亚群数量均具有上调作用，而且不同剂量的提取物的作用呈现一定的剂量关系，其中高剂量与环磷酰胺组经过统计学分析，P值＜0.05。
2淋巴细胞增殖转化实验表6生物之光口服液及糖缀合物CHB对小鼠淋巴细胞转化功能的影响
结论环磷酰胺组和正常对照组相比，P值＜0.01；生物之光口服液及糖缀合物CHB作用后的小鼠淋巴细胞转化功能较环磷酰胺组的小鼠功能有明显上升，特别是糖缀合物CHB的中、高剂量和生物之光口服液的高剂量组的SI指数均高于正常对照组，作用明显，有显著差异。
3小鼠NK细胞杀伤功能检测表7生物之光口服液及糖缀合物CHB对小鼠NK细胞杀伤功能的影响
结论(1)环磷酰胺组NK的杀伤活性相当于正常对照组的51.5％，表明本实验系统中已成功建立了免疫功能低下的小鼠模型，可进一步用于检测不同中药制剂对其的免疫调节作用。
(2)糖缀合物CHB不同剂量的NK杀伤活性为环磷酰胺组的1.52倍、1.54倍和2.8倍，表明糖缀合物CHB对CTX免疫抑制效应具有拮抗作用；与正常对对照组相比，低剂量和中剂量组的NK杀伤活性为78.5％和79.1％，并未达到正常值，而高剂量组则为正常对照组的1.44倍，显示糖缀合物CHB的不同剂量对免疫功能低下小鼠的正向免调节功能存在一定的剂量依赖性，与环磷酰胺组相比较，高剂量组的结果P值＜0.05，有显著差异。
(3)生物之光口服液和糖缀合物CHB对免疫功能低下小鼠的免疫调节功能的正向调节作用。
4、小鼠细胞因子的检测表8生物之光口服液和糖缀合物CHB对小鼠细胞因子产生的影响
结论(1)IL-4和INF-γ测定结果显示，生物之光口服液和糖缀合物CHB组中INF-γ的分泌量较环磷酰胺组有明显升高，经过统计学分析，其P值＜0.01，有显著差异；而IL-4的分泌量很低，在糖缀合物CHB的低剂量和中剂量组中几乎为零，表明生物之光口服液和糖缀合物CHB的免疫上调作用主要作用于CD4+Th1细胞，并增进免疫功能低下小鼠的细胞免疫功能；两者对小鼠INF-γ的分泌呈现剂量依赖性。
(2)IL-6的测定结果提示胃饲小鼠组的分泌量除糖缀合物CHB的低剂量组外，其余均升高，对环磷酰胺作用后的小鼠具有正向免疫调节作用；(3)TNF-α在血清中的含量很低，经统计学分析，无显著差异，但检测结果表明生物之光口服液和糖缀合物CHB对其分泌仍有一定的促进作用。
糖缀合物CHB对化疗药致小鼠骨髓抑制的保护作用实验观察骨髓抑制是化疗常见副作用之一。本实验通过腹腔注射环磷酰胺制成的小鼠骨髓抑制模型，观察了糖缀合物CHB对化疗药致小鼠骨髓抑制的保护作用。24只雄性昆明小鼠，体重25～30克，随机分为四组，每组6只。A组每日腹腔注射生理盐水1ml，B组每日服用糖缀合物CHB，C组每日腹腔注射环磷酰胺0.15mg/g，D组腹腔注射环磷酰胺同时服用糖缀合物CHB。三天后所有小鼠均处死，处死前取尾静脉血涂片，观察粒细胞与淋巴细胞的比例(G/L)，处死后取股骨和肝脏作病理检查，观察骨髓象中粒系比例G/E。结果C组G/E(0.18±0.03)和D组G/E(0.28±0.02)与A组G/E(0.41±0.03)相比差异显著(p＜0.05)，B组与A组G/E相比无显著差异。对各组G/L值的统计分析结果与G/E相同。各组动物的肝脏病理检查均无明显异常。
结论糖缀合物CHB对环磷酰胺造成的小鼠骨髓抑制有显著的保护作用，但不影响正常骨髓的造血功能，服用此品未引起肝脏组织形态发生病理变化。表明糖缀合物CHB可用于制备治疗和预防血液系统疾病的药物和支持肿瘤放化疗的药物。
权利要求
1.一种从鳖和/或龟的血清中提取的糖缀合物，其特征是含有重量比为5～10％的中性多糖，60～80％的蛋白质，其余为糖脂。
2.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于该糖缀合物a.为白色或类白色粉末状固体，无臭、易溶于水，水溶液pH为6.5～7.0；b.元素分析结果为C在40.36％～42.61％，H在6.8％～7.18％，N在9.97％～13.29％；c.紫外光谱除了在远紫外区有-OH强烈吸收外，在275mm附近有明显蛋白质吸收峰；d.红外光谱3392cm-1为-OH伸缩振动吸收，1658cm-1为酰氨键羰基特征峰，1200～1010cm-1处有三个吸收峰为糖环吸收；e.用色谱柱为TSK-G2000SW，流动相为水，流速为1.0ml/min的高效液相色谱测定在14.0min附近有一吸收峰，含量在80～90％；f.在上述TSK-G2000SW柱条件下该糖缀合物主峰的分子量分布约为2000～5000。
3.一种从鳖和/或龟的血清中提取糖缀合物的制备工艺，其特征在于依次包括下列步骤a.分离将经预处理的鳖和/或龟的血清用膜分离一次，或对水透析12～36小时，以除去小分子物质，离心分离得上清液(I)；b.提取在上清液(I)中加入乙醇或丙酮，直至沉淀完全；c.再分离取出沉淀，用适量水溶解、离心分离后得上清液(II)；将上清液(II)再用膜分离一次或对水透析16～32小时，离心得上清液(III)；d.后处理将上清液(III)进行减压浓缩、冷冻干燥，得糖缀合物；必要时可用乙醇或丙酮精制。
4.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于分离所用的膜其截留分子量为500～1000的钠滤膜。
5.一种从鳖和/或龟的血清中提取的糖缀合物在制备治疗或预防与免疫相关疾病的药物中的应用。
6.一种从鳖和/或龟的血清中提取的糖缀合物在制备治疗或预防与造血系统相关疾病的药物中的应用。
7.一种从鳖和/或龟的血清中提取的糖缀合物在制备治疗肝病和降低AFP药物中的应用。
8.一种从鳖和/或龟的血清中提取的糖缀合物在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从鳖或/和龟血清中提取的糖缀合物(CHB)、制备工艺及该糖缀合物在制备治疗或预防免疫性疾病、造血系统疾病、肝病及抗肿瘤的药物中的应用，该缀合物中蛋白质含量为60％～80％，制备工艺包括分离、沉淀、再分离、提取等步骤，本发明提供的糖缀合物具有较强的免疫活性作用和调节造血功能，可用于制备治疗或预防与免疫相关疾病、与造血系统相关疾病和肝病及抗肿瘤的药物，本发明提供的制备工艺简单易操作。
文档编号A61P1/00GK1566151SQ0313181
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月9日 优先权日2003年6月9日
发明者吴志大 申请人:吴志大