脂联素的糖基同工型及其用途的制作方法

专利名称：脂联素的糖基同工型及其用途的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及新陈代谢(更具体而言不仅仅是葡萄糖代谢)和脂联素(adiponectin)(更具体而言不仅仅是脂联素的糖基同工型)对新陈代谢的调控方面。
背景技术：
在本说明书中被加以编号引作参考的出版物对应于本说明书结尾所列的参考文献。
脂联素(也称为ACRP30、脂肪Q或GBP28)是一种专一地由脂肪细胞分泌的蛋白，其最初由四个研究小组采用不同的方法克隆得到。见如，Scherer，P.E.，等，生物学化学期刊(journal of biological chemistry)270(45)26746-26749(1995)；Nakano，Y.，等，生物化学期刊(journalof biochemistry)120(4)803-12(1996)；Hu，E.，等，生物学化学期刊(journal of biological chemistry)271(18)10697-10703(1996)和Maeda，K.，等，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochemical &Biophysical Research Communications)，c221(2)286-9(1996)。脂联素基因位于染色体的3q27上，3q27是2型糖尿病和其他代谢综合征的易感基因座[12-14]。一些最新研究表明脂联素可能是关键的、长期寻找的与肥胖症、胰岛素耐受和2型糖尿病相关的激素[9-11]。
本发明人已经假定一些糖基化形式的以及许多其他形式脂联素的功效。
在2002年12月18日提交的NZ专利申请523410和523411(尚未公开)和相应的US临时专利申请中，本发明人要求保护各种形式脂联素(包括人的哺乳动物的脂联素)分别在治疗哺乳动物或人的肝脏疾病和TNF-α相关疾病中的用途。
肝脏疾病(包括但不限于酒精性肝脏疾病(ALD))困扰全世界成千上万名患者，是发达国家中导致死亡的主要原因之一1。
例如，酒精性肝脏疾病发展的特征是脂肪变性(脂肪浸润)、发炎、坏死和最终纤维化和肝硬变；当发生严重的肝炎时，通常导致死亡2。
当前还没有可以预防和逆转酒精性肝脏疾病的有效药物试剂。
解释酒精诱导的肝中毒(hepatoxicity)的机理是复杂并且原因多样。
许多最近的研究表明，一些通过激活的Kupffer细胞产生的促炎细胞因子可能与酒精性肝脏疾病的发病有关4，5。例如，在由酒精诱导的肝损伤的人类患者与动物模型中，已经观察到TNF-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的循环水平升高6，7。这些细胞因子的表达水平与疾病过程密切相关。Kupffer细胞的损耗防止向胃内饲喂酒精的模型中的酒精诱导的早期肝损伤8，并且还能够抑制口服饲喂酒精的模型中的酒精诱导的微泡和大泡的脂肪变性9，这些发现进一步证实这些细胞因子在ALD发病机理中的关键性作用。酒精性肝脏损伤通过施用抗TNF-α的抗体极大地减弱10，并且可以通过TNF-α受体1击昏小鼠中消除11。而且，用抑制Kupffer细胞中TNF-α生成的化合物，即反应停处理，能彻底地预防大鼠发生酒精性肝损伤12。
与促炎细胞因子相反，一些抗炎细胞因子已经被证明具有保护肝的作用7。
人脂联素(也称作ACRP30、脂肪Q(adipoQ)和GBP28)是一种专一地由脂肪组织分泌的蛋白13。
脂联素最初由四个研究小组采用不同的方法克隆得到。见，如Scherer，P.E.，等，生物学化学期刊(Journal of Biological Chemistry)270(45)26746-26749(1995)；Nakano，Y.，等，生物化学期刊(Journalof Biochemistry)120(4)803-12(1996)；Hu，E.，等，生物学化学期刊(Journal of Biological Chemistry)271(18)10697-10703(1996)和Maeda，K.，等，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochemical &Biophysical Research Communicatuions)，c221(2)286-9(1996)。人类脂联素基因位于染色体3q27上。
人和小鼠的脂联素与这些蛋白具有模块设计(modular design)的蛋白质家族共有序列同源性，即特征性的NH2-末端胶原样区域和COOH-末端补体因子Clq样球形域的蛋白家族共有序列同源性。脂联素的三维结构与TNF-α的十分相似14。
Maeda等15已经证实在小鼠中不能生成内源性脂联素，恢复生成脂联素mRNA的能力可以降低脂肪细胞中存在的TNF-αmRNA水平的异常升高，以及降低血浆中TNF-α水平的异常升高。
但是，应当指出逐渐增多的被充分阐述的关于基因表达的转录后和翻译后控制的机制，如可选的mRNA剪接、内部核糖体进入、翻译移码和/或再编码、和氨基酸的翻译后修饰如糖基化，都过于简单地提出一种基因仅能够编码一种多肽产物的观点。因此，恢复产生特定mRNA的能力不必确定该mRNA的哪种可能多肽产物或者可能多肽产物的何种组合，将会产生任何可观察到的生物学效果。
已经证明将脂联素施用给小鼠会对脂类代谢产生有益作用，如从血浆中增强脂类的清除和增加肌肉中脂肪酸的β-氧化16，17。脂联素能够直接作用于肝组织并抑制葡萄糖生成18，19。脂联素还具有直接的抗炎作用20。
最近，脂联素被证明是治疗肥胖相关的代谢综合征的有前景的候选药物13。给小鼠补充重组的脂联素能够减少高血糖症18，反转胰岛素耐受16和引起持续的体重下降而不影响食物摄取17。
本发明人还假设脂联素可能具有保护肝脏的作用，脂联素及其激动剂可被临床应用于肝脏疾病的治疗中，包括乙醇相关的肝脏疾病。
因此，本发明人用小鼠脂联素在具有酒精诱导的肝损伤的小鼠模型中验证这种假设。
结果，本发明人根据脂联素和/或其激动剂在小鼠中的活性，确定了它们在哺乳动物(包括人类)的肝脏疾病包括酒精诱导的肝损伤中的作用。
本发明人还证明了许多肝脏症状伴随着低血液和脂肪浓度的脂联素蛋白和脂联素mRNA(与酒精摄食相关的数据，见本申请)，如酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎和酒精性肝坏死、糖尿病性脂肪变性和糖尿病、高脂肪食物±肝脂肪变性继发的胰岛素耐受。
在长期采食高脂肪的含有酒精食物后，小鼠体内小鼠脂联素的循环浓度显著降低。给这些小鼠施用重组的小鼠脂联素显著地减轻肝肿大和脂肪变性(脂肪肝)，而且还显著地降低炎症和血清丙氨酸转氨酶水平的升高。已经发现小鼠脂联素治疗降低肝脏中TNF-α生成，和脂肪酸合酶和脂肪酸转运蛋白CD36的表达。
TNF-α是具有多重生物活性的调控细胞因子。TNF-α在杀死肿瘤、调节对组织损伤的反应和保护宿主免受各种微生物感染中起总体作用。例如，TNF-α由已经被革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)激活的巨噬细胞释放，并且可能是参与细菌性脓毒病相关的内毒素休克的发生和发病机理的极其重要的内源性介质。
但是，在一些疾病状态和炎症反应如类风湿性关节炎、恶病质、和败血性休克中，其活性似乎是过度的。过量的TNF-α导致过度免疫反应，表现为过度刺激分泌白细胞介素-6和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、多形核噬中性白细胞的细胞毒性升高，和细胞粘着分子表达延长，所有这些都具有有害作用。
在动物模型中，抑制炎症反应过程中的TNF-α活性的有益效果已经用TNF-α的中和单克隆抗体证实。
TNF-α的生物活性包括抑制脂蛋白脂肪酶合成(“恶液质素”)、激活多形核白细胞、抑制细胞生长或刺激细胞生长、对一些被转化的细胞类型的细胞毒性作用、抗病毒活性、刺激骨吸收、刺激胶原酶和前列腺素E2生成，和免疫调控作用，包括激活T细胞、B细胞、单核细胞、胸腺细胞和刺激主要组织相容性复合物I类和II类分子的细胞表面表达。
TNF-α因其导致组织损伤的促炎作用而著名，如诱导血管内皮细胞的促凝血活性、提高嗜中性粒细胞和淋巴细胞的附着，和刺激血小板激活因子从巨噬细胞、嗜中性粒细胞和血管内皮细胞中释放。
TNF-α与许多感染、免疫紊乱、肿瘤病理学的发病机理相关，如在伴随着一些恶性肿瘤的恶病质中，和在自身免疫病理学和移植物抗宿主病理学中。TNF-α与癌症和感染病理学的联系往往与宿主的分解代谢状态相关。癌症患者中的一个主要问题是体重下降，通常伴随着食欲减退。过度消瘦导致所谓的“恶病质”。恶病质包括体重逐渐下降、食欲减退、和身体机能由于恶性肿瘤的生长持久地被损害。基本生理紊乱可能与生物摄取相对于能量消耗下降相关。因而恶病质状态与严重的发病率相关，构成癌症死亡率的主要部分。许多研究表明在癌症、感染病理学和其他分解代谢状况中，TNF-α是恶病质的重要介质。
在革兰氏阴性脓毒和内毒素性休克的病理生理结果中，包括发烧、不适、食欲减退和恶病质，TNF-α被认为起主要作用。内毒素是潜在的单核细胞/巨噬细胞活化剂，刺激TNF-α和其他细胞因子的产生和分泌。由于TNF-α能够模仿内毒素的许多生物学作用，TNF-α被推断是导致内毒素相关疾病的临床表现的主要介质。
TNF-α和其他单核细胞来源的细胞因子介导对内毒素的代谢和神经激素的反应。将内毒素施给人类志愿者引起的急性疾病具有类似感冒症状，包括发烧、心动过速、代谢速度和应激激素释放升高。在患有革兰氏阴性脓血症的患者中也发现TNF-α的循环水平升高。用TNF-α(由于其杀肿瘤的作用)治疗癌症患者，表明大于545微克/m2/24小时的剂量产生了与给健康的人注射内毒素(4ng/kg)类似的变化，说明了TNF-α作为败血症和内毒素反应的主要宿主介质的作用。给人或大鼠长期静脉内灌注TNF-α与食欲减退、液体保持力、急性期反应和负氮平衡相关(即典型的分解代谢作用)，说明TNF-α可能与严重疾病中出现的许多变化相关。
在此所用的“TNF-α相关疾病”或“TNF-α疾病”或“TNF-α紊乱”是由于存在TNF-α而产生或恶化的，和/或能够通过抑制和/或拮抗作用于TNF-α或TNF-α的作用位点来治疗的疾病或紊乱。这种疾病或紊乱包括，例如，炎症性疾病(如糖尿病并发症如视网膜病、肾病、神经病、主要血管和微血管紊乱、糖尿病性肾病；关节炎如慢性类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性脊髓炎和骨膜瘤形成(periosteosis)；术后/外伤后的炎症；肿胀修复；咽炎；膀胱炎；肺炎；心肌炎；心肌症；特发性皮炎；炎症性肠道疾病如克隆病和溃疡性结肠炎；脑膜炎；炎症性眼病；炎症性肺病如肺炎、硅肺、结节性肺病、炎症性骨紊乱和肺结核)、循环疾病(如慢性心力衰竭包括心律不齐、心绞痛、心肌梗死、心功能不全和充血性心力衰竭，动脉硬化包括动脉粥样硬化症、高血压、深静脉血栓、闭塞性外周循环衰竭，局部的大脑循环衰竭、弥漫性血管内凝血综合症、雷诺病、Buerger病)、门脉高压、肺动脉高压、变应性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、结膜炎、消化道过敏反应、花粉病和过敏反应、慢性闭塞性肺病、胶原形成(如红斑狼疮、皮肥厚、多发性动脉炎)、克隆病、自体免疫溶血性贫血、牛皮癣、肝脏疾病如肝炎包括慢性病和硬化、胰腺病如胰腺炎、神经变性疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、AIDS、脑病)、中枢神经衰竭(例如脑血管衰竭如脑出血和脑梗塞及其后遗症、颅创伤、脊髓损伤、脑水肿、痴呆、健忘症、失忆、多发性硬化)、毒血症(如败血症、败血性休克、内毒素休克、革兰氏阴性败血症、毒素休克综合症)、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血症、高胆固醇血症、异常葡萄糖耐受、实体瘤、肿瘤(如恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化器官(如胃、肠道)的癌症、癌症和伴随的恶病质、内分泌疾病(如Addison病、Cushing综合症、黑素细胞瘤、原发性醛固酮增多症)、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染(如巨细胞病毒、流感病毒、疱疹病毒等的感染)、经皮冠状动脉成形成形、血管肥大或闭塞、PTCA/支架/旁路手术后的血管再闭塞/再狭窄、干预后的血管肥大或闭塞、抑制植入诱导的血管衰退和排斥、器官或组织移植后的排斥和自体免疫疾病(如器官特异性疾病如甲状腺炎或非特异性器官疾病如风湿症的和骨性关节炎)、在新型(neopastic)治疗过程中TNF生成相关的负作用，还消除和改善与治疗或预防移植排斥相关的休克相关综合症、透析性低血压、青光眼、眼压高、重症肌无力、长期脱脂症(defatigation)、骨病(如骨折、骨再折、骨质疏松症、骨软化、骨Behcet病、强直性脊柱炎、慢性风湿性关节炎、膝关节炎以及在相关疾病中关节组织损坏)、神经紊乱包括对各个神经、神经根、脊髓和/或大脑的创伤、损伤压迫(如急性脊髓和大脑损伤、髓鞘脱失病、如多发性硬化症、由转移肿瘤、原发性或转移的大脑肿瘤产生的脊髓压迫、由转移肿瘤产生的慢性疼痛综合症、炎症性CNS疾病，如亚急性硬化型全脑炎(panenencephalitis)、亨廷顿病、Guillain-Barre综合症、Bell氏瘫痪、糖尿病性神经病、视神经炎、黄斑退化、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病、肌肉萎缩症，和多肌炎-皮肌炎)，TNF-α诱导的胰岛素耐受、异常凋亡(如病毒诱导的凋亡抑制)、糖尿病或应激高血糖症的并发症(如心肌梗塞、充血性心力衰竭，和心原性休克)、慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎和肺气肿。
发明概述在一个方面，本发明是脂联素多肽，其中该脂联素多肽被糖基化并且其中脂联素是重组的、分离的、纯化的或合成的。优选但不是必须，所述脂联素多肽是人脂联素。
优选糖基化的脂联素多肽为至少约50％纯度(更优选为至少约80％纯度)(更加优选为至少约90％纯度)(还更加优选为至少约95％纯度)和(最优选为至少约99％纯度)。
对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰基被羟基化或者未被羟基化。在一些实施方案中，对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰基被羟基化。在另一些实施方案中，该脯氨酰基未被羟基化。
优选地至少一个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
优选地糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种。
在一些实施方案中，对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的两个或更多个赖氨酸残被糖基化。在其他实施方案中，对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的三个或更多个赖氨酸残基被糖基化。还有在其他实施方案中，对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化。
无论被糖基化的赖氨酸残基，优选地糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种。优选脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基65的位置上具有一个或多个α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基、在对应于人脂联素的赖氨酸残基68的位置上具有一个或多个α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基、在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上具有一个或多个α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基、和/或在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上具有一个或多个α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基(即所有15种可能性)。
在本发明的一些类型中，脂联素多肽在每个赖氨酸残基65、68、77和101上具有至少一个糖部分。
优选地糖基化具有单个糖部分。在其他实施方案中，糖基化具有多种糖成分。
本发明还包括前述的脂联素多肽，其与由药学上可接受的赋形剂、共活性剂(co-active)或稀释剂中的一种或多种配制以适合于施用给哺乳动物患者。
还有另一个方面，本发明为在对应于人脂联素的脯氨酸残基91的位置上具有羟脯氨酰基残基的脂联素多肽，其中该多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。
该多肽可以与由药学上可接受的赋形剂、共活性剂或稀释剂的一种或多种一起配制以适合于施用给哺乳动物患者。
在还有一方面，本发明是药物组合物、其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的每个残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸的脂联素多肽。
在另一个方面，本发明是药物剂量单位，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的每个残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸的脂联素多肽。
在另一个方面，本发明是包含脂联素多肽的组合物，其中脂联素多肽被糖基化和其中该脂联素多肽(优选人的)是重组的、分离的、纯化的、或合成的。
优选组合物与其他药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等配制以适合于施用给哺乳动物患者。
优选对应于人脂联素的残基91的脂联素多肽的残基是羟基脯氨酸。
优选至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化。
优选糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
在一些类型中，对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的两个或更多个赖氨酸残基被糖基化，对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的三个或更多个赖氨酸残基被糖基化，或者对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化。
优选糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
优选对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的每个残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸。对应于人脂联素的残基91的人脂联素多肽的残基不必是羟基脯氨酸，但是优选被羟基化。
糖基化可以具有单一糖部分或者具有多种糖部分。
优选脂联素多肽在每个赖氨酸残基65、68、77和101上具有至少一个葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。
优选脂联素多肽具有天然哺乳动物脂联素多肽的序列。
优选脂联素多肽基本上不含至少一个未被糖基化的脂联素多肽的同工型(isoform)。
优选地组合物基本上不含同工型1。
优选地组合物基本上不含同工型2。
优选地组合物基本上不含任何未被糖基化的脂联素多肽同工型。
优选主要脂联素多肽种类完全被糖基化。
优选Lys-65、68、77和101全部被糖基化。
组合物可能含有一种以上脂联素多肽同工型。
优选同工型3是组合物中主要的脂联素多肽，或同工型4是组合物中主要的脂联素多肽，或同工型5是组合物中主要的脂联素多肽，或同工型6是组合物中主要的脂联素多肽。
将组合物施用给哺乳动物提高胰岛素的作用。组合物有效地使亚生理血液胰岛素浓度产生正常生理血液胰岛素浓度的生物学作用。
在另一个方面，本发明是还包含胰岛素的组合物。
优选胰岛素以足以产生在约50pM到约400pM之间的血液胰岛素浓度的含量或浓度存在。
优选胰岛素以足以产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度的含量或浓度存在。
优选胰岛素以足以产生约200pM的血液胰岛素浓度的含量或浓度存在。
优选当被施用给个体时，组合物抑制糖原异生。
优选组合物有效地产生在1microg/mL到20microg/mL之间的血浆脂联素多肽浓度(更优选地产生在1.9microg/mL到17microg/mL之间的血浆脂联素多肽浓度)。
在另一个方面，本发明是在个体中诊断存在或易于产生疾病状态的方法，包括在该个体中确定特定脂联素多肽同工型的水平或者至少两种糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式，比较该表达模式与未患有该疾病状态的个体的表达模式特征，其中表达模式的不同指示存在或易于产生该疾病。
优选所用的脂联素多肽同工型是先前定义的和/或下文参照附图定义的糖基化的脂联素多肽。
优选个体是人。
疾病状态可以是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症(如包括体重增加、降低或控制或防止体重增加)、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成(artherosclerosis)、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
这些疾病可以是任何别处提及疾病，包括与肝脏和TNF-α相关的疾病。
脂联素多肽可以从生物样本中获得。
水平或表达模式通过量化或评价糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式来获得。评价方法优选采用电泳、HLPC、或质谱分析。可选地或优选采用特异性抗糖基化的脂联素多肽同工型的抗体来量化和评价水平和表达模式。
在另一个方面，本发明是在个体中诊断存在或易于产生疾病状态的方法，包括在该个体中确定特定脂联素多肽同工型的水平或者至少两种糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式，比较该表达模式与患有该疾病状态的个体的表达模式特征，其中表达模式相似表示存在或倾向于产生该疾病。
所用的脂联素多肽同工型优选为前述的糖基化的脂联素多肽。
优选任何一种或多种所用的脂联素多肽同工型是人脂联素。
优选个体为人。
疾病状态可以是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
脂联素多肽可以从生物样本中获得。
水平或表达模式优选通过量化或评价糖基化的脂联素同工型的表达模式来获得。评价方法可以采用电泳、HLPC、或质谱分析。水平和表达模式采用特异性抗糖基化的脂联素多肽同工型的抗体来量化或评价。
在还有另一个方面，本发明是治疗与脂联素多肽调控或迷乱的胰岛素敏感性相关的疾病状态的方法，包括施用有效量的糖基化的脂联素多肽，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活化剂、稀释剂等等。
疾病状态可以是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
优选糖基化的脂联素多肽是人脂联素。
优选脂联素多肽选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或两个以上对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
优选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
可选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
在另一个方面，本发明是治疗与脂联素多肽调控或异常胰岛素敏感性相关的疾病状态的方法，包括施用有效量的本发明的组合物，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等等。
疾病状态可以是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊性卵巢综合征。
另一方面，本发明提供通过以下方法生产的产品，该方法包括在合适的表达载体上插入编码脂联素多肽的多核苷酸序列，将含有编码脂联素的多核苷酸序列的表达载体导入能够表达、和/或加工、和/或糖基化所述脂联素多肽的适当真核宿主细胞中来生产生物活性产品。
在一个实施方案中，多核苷酸序列(polynucleartide)编码全长脂联素，该全长脂联素是含有信号序列的前体形式(prepro form)的脂联素。
在另一方面，本发明提供探查(visit)哺乳动物患者中的体重下降的方法，包括施用有效量的糖基化的脂联素多肽，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等等。
在另一方面，本发明提供在哺乳动物患者中减少体重增加的方法，包括施用有效量的糖基化的脂联素多肽，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等等。
在另一方面，本发明提供在哺乳动物患者中预防肥胖症的方法，包括施用有效量的糖基化的脂联素多肽，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等等。
还有一方面，本发明提供在哺乳动物患者中预防体重增加的方法，包括施用有效量的糖基化的脂联素多肽，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等等。
还有一方面，本发明提供治疗缺乏脂联素的哺乳动物患者或者将从这种治疗中获益的哺乳动物患者的方法，包括施用有效量的糖基化的脂联素多肽，伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等等。
另一个方面，本发明是糖基化的脂联素多肽(可任选与药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂和包装容器(containment vessels))在制备药物组合物或药剂或剂量单位的用途，药物组合物或药剂或剂量单位在哺乳动物患者中用于i)在治疗与脂联素多肽调控相关的疾病状态中；或ii)增强胰岛素作用；或iii)抑制糖原异生。
该用途是采用还包括胰岛素的所述药物组合物或药剂或剂量单位。胰岛素的浓度可以是足以有效地产生在约50pM到约400pM之间的血液胰岛素浓度。胰岛素的浓度可以是足以有效地产生在约100pM到约300pM的血液胰岛素浓度。胰岛素浓度优选为足以有效地产生200pM的血液胰岛素浓度(即或压强)。
糖基化的脂联素多肽优选为人脂联素。
优选脂联素多肽选自下面的一种或多种
i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
优选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
可选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
另一个方面，本发明是包含或包括含有至少糖基化的脂联素多肽的容器或呈递单元的制品，和其或糖基化的脂联素多肽的使用说明，其在哺乳动物患者中有效用于i)治疗与脂联素多肽调控相关的疾病状态；或ii)增强胰岛素作用；或iii)抑制糖原异生。
优选糖基化的脂联素多肽为人脂联素。
优选脂联素多肽选自下面的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
优选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
可选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
在另一个方面，本发明是一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够递送有效量的糖基化脂联素多肽，足以有效地用于治疗哺乳动物患者中的与脂联素多肽调控相关的疾病状态。
优选该配方或剂量形式还含有胰岛素。胰岛素的浓度足以产生在约50pM到约400pM之间的血液胰岛素浓度。胰岛素的浓度优选足以产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度。
更优选胰岛素的浓度足以产生约200pM的血液胰岛素浓度(即存在量)。
优选糖基化的脂联素多肽为人脂联素。
优选脂联素多肽选自下面的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，
v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
在一些制品类型中，每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
在其他制品类型中，每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
在另一个方面，本发明是一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够递送有效量的糖基化脂联素多肽，足以提高胰岛素的作用。
优选脂联素多肽为人脂联素。
优选在配方或剂量形式中，脂联素多肽选自下面的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
在另一个方面，本发明是一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够递送有效量的糖基化脂联素多肽，足以提高胰岛素的作用，其中脂联素多肽优选如前述定义。
优选配方或剂量形式还含有胰岛素(优选如前述定义存在)。
在另一个方面，本发明是一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够递送有效量的糖基化脂联素多肽，足以抑制糖原异生。
优选脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的、或合成的。
优选脂联素多肽是人脂联素。
优选至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化。
在另一个方面，本发明在于一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够呈递有效量的糖基化脂联素多肽，足以提高胰岛素的作用，其中脂联素多肽如上文定义。
优选该配方或剂量形式还含有胰岛素(如达到先前公开的水平)。
还有另一个方面，本发明在于监控对哺乳动物个体的治疗的方法，该个体易感或患有一种症状a.与脂联素多肽调控相关；b.需要增强胰岛素，或c.需要抑制糖原异生，所述方法包含或包括监控个体中糖基化脂联素多肽存在量提高的步骤，其中糖基化的脂联素多肽具有如下之一(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰基残基被羟基化。
(C)(A)和(B)。
优选所用的脂联素多肽同工型是如先前公开的糖基化脂联素多肽。
症状可以是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征中的一种或多种。
在另一个方面，本发明在于制备含有糖基化的脂联素多肽的组合物的方法，其包括步骤；(a)获得包含至少两种糖基化程度或类型不同的脂联素多肽的第一组合物；和(b)区分脂联素多肽的形式至少到一定程度，这种区分基于糖基化程度或类型，从而产生在脂联素多肽模式上区别于第一组合物的第二组合物。
优选该方法在第二组合物中富含或至少基本分离出本文所描述的任何一种脂联素多肽。
优选所述脂联素多肽是通过在哺乳动物细胞中表达编码脂联素多肽的重组多核苷酸来获得。
优选重组多核苷酸编码具有在图5中描述的序列的多肽或其生物活性片段或其变体。
可选脂联素多肽从动物组织中纯化，如人的、小鼠的、大鼠的、狗的、牛的、或非人的灵长类的组织。
优选该组织是血清或脂肪细胞。
分离中可包括或不包括电泳的步骤。
分离中可包括或不包括层析的步骤。
优选第二组合物是本发明的组合物或多肽。
在另一个方面，本发明涉及特异性抗选自以下的脂联素多肽的糖基同工型的抗体(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰基残基被羟基化。
(C)(A)和(B)。
优选抗体是单克隆抗体。
抗体可能能够双位点捕获。
在另一个方面，本发明涉及任何这种抗体的组合物。
在另一个方面，本发明涉及对特异性抗选自以下的脂联素多肽糖基同工型(glycoisoform)的抗体特异性的杂交瘤(hydridoma)(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。
(C)(A)和(B)。
在另一个方面，本发明涉及筛选一种试剂或用于在哺乳动物中提高如下之一的糖基化脂联素多肽的水平的试剂的方法(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。
(C)(A)和(B)。
该方法包含给予哺乳动物或其组织或通过这些哺乳动物或哺乳动物组织改进哺乳动物这种糖基化的脂联素多肽的生成。
在另一个方面，本发明涉及用于提高具有如下之一的糖基化脂联素多肽的水平的试剂(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。
(C)(A)和(B)。
通过筛选的方法来确定，该方法包含给予哺乳动物或其组织或通过这些哺乳动物或哺乳动物组织改进哺乳动物这种糖基化的脂联素多肽产品的生成。
在另一个方面，本发明涉及脂联素多肽同工型的混合物，通过去除、转化或合成，基本含有或富含同工型，其中至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基被糖基化和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。
在另一个方面，本发明涉及脂联素多肽同工型的混合物，通过去除、转化或合成，其基本含有或富含同工型，其中至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基未被羟基化。
通过去除、转化或合成，脂联素多肽的同工型基本含有或富含至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化的同工型。
本发明还涉及脂联素多肽的同工型，其基本含有或富含(通过去除、转化或合成)至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和在对应于人脂联素的脯氨酸残基91的位置上具有羟基脯氨酰基残基的同工型，或者脂联素多肽的同工型，其基本含有或富含(通过去除、转化或合成)至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和在对应于人脂联素的脯氨酸残基91的位置上没有羟基脯氨酰基残基的同工型。
在另一个方面，本发明是筛选一种或多种能够表达糖基化脂联素多肽的细胞的方法，包含鉴定和/或确定特异性脂联素多肽同工型的水平或至少两种由所述细胞或细胞群表达的糖基化脂联素多肽同工型的表达模式和/或纯化和/或分离所述细胞或细胞群。
优选地，糖基化的脂联素多肽为人脂联素。
优选脂联素多肽选自下面的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，
ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
优选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
优选每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
优选采用特异性抗选自以下脂联素多肽的糖基同工型的抗体来鉴定和/或确定任何一种或脂联素多聚体(adiponectinpoly)(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。
(C)(A)和(B)。
优选该抗体是单克隆抗体。
优选该抗体特异性抗其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸的脂联素多肽。
优选该抗体特异性抗其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸的脂联素多肽。
本发明还是任何一种或多种通过按照权利要求231的方法鉴定和/或分离和/或纯化的细胞。
因此，在另一个方面，本发明涉及治疗遭受或患有肝脏疾病和/或具有任何肝脏疾病特征的哺乳动物患者的方法，包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
肝脏疾病可以是急性肝脏疾病、慢性肝脏疾病、肝脏炎症、肝功能紊乱、脂肪肝(肝脏脂肪变性)、肝脏纤维化、肝脏硬化、肝脏坏死、肝细胞坏死、酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎、酒精性肝坏死、酒精性肝硬化、肝坏死、肝脂肪变性、与糖尿病相关的肝脂肪变性、与富含脂类的食物相关的肝脂肪变性、与脂类代谢异常相关的肝脂肪变性、由任何情况引起的肝炎、由任何情况导致的肝坏死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自发性(active)肝炎、肝脏的病毒感染或发炎继发的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何药物或毒素作用继发的肝炎、胆汁郁积随之发生的肝炎或肝功能紊乱、原发性胆汁性肝硬化、肝脏肉芽肿病，和/或其中肿瘤坏死因子的组织或血液浓度提高起致病作用的情况中的任何一种或多种。
优选哺乳动物是人并且脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。可以预期，当指非人类物种的脂联素时，是不同于人脂联素的脂联素变体或平截的(truncated)脂联素，脂联素残基参照采用对应于人序列残基的编号，通过两个序列的最佳排列来确定。
脂联素制剂可以适合于施用给人的方式配制，优选以肠胃外施用的方式，通过如皮下的(s.c.)、真皮内的(i.d.)、静脉内的(i.v.)、腹膜内的(i.p.)或经真皮(transdermal)的路径。其他的制剂也可以，其中所述脂联素通过口腔、直肠、阴道、膀胱内、鞘内、心室内、脑内或其他本领域技术人员知晓的路径被施用。
优选的施用路径是肠胃外。适合于肠胃外施用的脂联素被配制在含有稳定用缓冲剂的水溶液中，优选在或接近等渗强度，和具有适当的防腐剂、防沫剂、抗沉淀剂和其他本领域技术人员已知的稳定剂来适合于施用给哺乳动物特别是人的蛋白质的药物配制剂，特别是适合于在溶液中稳定施用给哺乳动物优选是人的治疗性蛋白质的那些。
在另一个方面，本发明涉及治疗遭受或患有酒精性肝脏疾病和/或具有任何酒精性肝脏疾病特征的哺乳动物患者的方法，包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
在另一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物患者来预防和/或反转酒精性肝脏疾病和/或任何肝脏疾病特征的方法，包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
在另一个方面，本发明涉及治疗遭受肝脏疾病或具有任何肝脏疾病特征的人的方法，包含或包括给该患者施用有效量的脂联素和/或其激动剂。
在另一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物患者来预防和/或反转酒精性肝脏疾病和/或任何酒精性肝脏疾病特征的方法，包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
还在另一个方面中，本发明涉及治疗遭受酒精性肝脏疾病和/或具有任何酒精性肝脏疾病特征的人的方法，包含给该患者施用有效量的脂联素和/或其激动剂。
还在另一个方面中，本发明涉及治疗遭受肝脏脂肪变性(脂肪浸润)、肝脏炎症、肝坏死、肝纤维化、肝硬化、和/或肝功能紊乱的任何一种或多种的哺乳动物患者的方法，包含给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
在还有一个方面中，本发明涉及一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的容器；脂联素或脂联素激动剂(如含在容器中的)用于治疗、预防或反转肝脏疾病和/或肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
在还有一个方面中，本发明涉及一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的容器；脂联素和/或脂联素激动剂(如含在容器中的)用于治疗、预防或反转酒精性肝脏疾病和/或酒精性肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
在还有一个方面中，本发明涉及一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的包装材料；脂联素和/或脂联素激动剂(如含在包装材料中的)用于治疗、预防或反转肝脏疾病和/或肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
在还有一个方面中，本发明涉及一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的包装材料；脂联素和/或脂联素激动剂(如，含在包装材料中的)用于治疗、预防或反转酒精性肝脏疾病和/或酒精性肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
在还有一个方面，本发明涉及(优选有效量的)脂联素，和/或脂联素激动剂与其他一种或多种材料(无论受体、共活性剂、稀释剂等和/或无论剂量单位限定的容器)在加工有效用于在哺乳动物(人或其他动物)中治疗、预防或反转疾病和/或肝脏疾病的任何特征的剂量单位或药物组合物中的用途。
在还有一个方面，本发明涉及(优选有效量的)脂联素，和/或脂联素激动剂与其他一种或多种材料(无论受体、共活性剂、稀释剂或其他和/或无论剂量单位限定的容器)在加工有效用于在哺乳动物(人或其他动物)中治疗、预防或反转酒精性疾病和/或酒精性肝脏疾病的任何特征的剂量单位或药物组合物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包含或包括，监测哺乳动物患者中的脂联素，和或给该哺乳动物施用脂联素和或其激动剂，这种治疗的目的在于治疗、反转或预防肝脏疾病和或肝脏疾病(可包括酒精性肝脏疾病)的任何特征。优选哺乳动物是人。
在另一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包含或包括，监测哺乳动物患者中的脂联素mRNA，和或给该哺乳动物施用脂联素和或其激动剂，这种治疗的目的在于治疗、反转或预防肝脏疾病和/或肝脏疾病(可包括酒精性肝脏疾病)的任何特征。优选哺乳动物是人。
在另一个方面，本发明涉及测定哺乳动物患者中脂联素的方法，其包含或包括分析血液或组织中的脂联素浓度。
脂联素的浓度可以通过本领域技术人员熟知的任何方法测定，包括但不限于免疫学方法如放射免疫检测(RIA)、BLISA等，这些方法在本申请人的在先公开的US申请60/349,885中被描述，该申请还描述了活性形式的脂联素及其组合物。
优选组织是脂肪组织。
在另一个方面，本发明涉及测定哺乳动物患者中的脂联素的方法，其包含或包括分析血液或组织中的脂联素mRNA的浓度。
脂联素mRNA的浓度可以通过本领域技术人员熟知的任何方法测定，包括但不限于RT-PCR、Northern分析、原位杂交(situ hybridisation)和放射免疫检测(RIA)。
优选组织是脂肪组织。
在另一个方面，本发明涉及能够测定哺乳动物患者的脂联素的分析方法，包含或包括从哺乳动物患者中分离血液或组织样本，制备样本，通过本领域技术人员熟知的任何方法分析血液或组织中的脂联素浓度，包括但不限于免疫学方法如放射免疫检测(RIA)、BLISA等。测定脂联素的方法在先前提及的US专利申请No.60/349,885中被描述，其中还描述了活性形式的脂联素及其组合物。
在还有一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物患者的方法，该患者遭受或患有选自以下的任何疾病急性肝脏疾病、慢性肝脏疾病、肝脏炎症、肝脏功能紊乱、脂肪肝(肝脂肪变性)、肝脏纤维化、肝脏硬化、肝脏坏死、肝细胞坏死、酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎、酒精性肝坏死、酒精性肝硬化、肝坏死、肝脂肪变性、与糖尿病相关的肝脂肪变性、与富含脂类的饮食相关肝脂肪变性、与脂类代谢异常相关的肝脂肪变性、由任何情况引起的肝炎、由任何情况导致的肝坏死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自发性肝炎、肝脏的病毒感染或发炎继发的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何药物或毒素作用继发的肝炎、胆汁郁积随之发生的肝炎或肝功能紊乱、原发性胆汁性肝硬化、肝脏肉芽肿病，和/或其中肿瘤坏死因子的组织或血液浓度升高起致病作用的情况，包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
优选患者是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
在人类治疗中，脂联素优选包括与人脂联素相关的脂联素和/或其激动剂，例如通过传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学方法获得，它们属于本领域的技术。脂联素可以通过将编码蛋白的多核苷酸(通常为DNA)序列插入到表达载体中并在适当的宿主中表达多肽来重组生产。编码所需多肽的多核苷酸，无论是被融合的或成熟形式，和无论是否含有用于分泌的信号序列，被连接到适合于任何适当宿主的表达载体上。虽然由于真核细胞能够进行翻译后的修饰如糖基化而推荐采用真核表达系统，但是可以使用任何本领域技术人员知晓的各种表达载体。可以在任何适当的用含有编码重组多肽的DNA的表达载体转化或转染的宿主细胞中实现表达。真核宿主细胞的例子是本领域已知的，包括酵母、鸟类、昆虫、植物和动物细胞如COS7、Hela、CHO及其它的哺乳动物细胞。从脂肪细胞中衍生得到的细胞特别适合于本文定义的脂联素多肽的表达。可以预期，真核宿主细胞可能有差别地糖基化表达的蛋白，以至于适当的宿主细胞可以通过确定表达蛋白被糖基化的方式来鉴定。因此，可以选择表达期望的脂联素多肽的糖基化同工型的宿主细胞。重组生产的标准技术被描述如在上文的Sambrook中。可以通过在哺乳动物细胞中表达编码脂联素或其生物活性片段或其变体或其同工型的重组多核苷酸来获得脂联素。
在另一个实施方案中，脂联素(包括同工型和糖基化同工型的混合物)还可以从动物组织如但不限于血清或脂肪细胞中纯化。从脂肪细胞中纯化脂联素的方法在本领域是熟知的，还在先前提及的US专利申请No.60/349,885中进一步被描述。可以获得糖基化脂联素组合物的动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、狗、牛和非人的灵长类。
按照本发明，“有效量”的含义是任何足以实现包括临床效果的有益的或期望效果的含量。
应当指出，本发明人已经证明许多肝脏疾病，如酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎和酒精性肝坏死、糖尿病性脂肪变性和糖尿病、继发高脂肪饮食±肝脂肪变性的胰岛素耐受，都伴随着脂联素蛋白和脂联素mRNA的血液和脂肪浓度下降(与酒精摄食相关的数据，见本申请)。
因此，治疗的重要原则是当出现脂联素缺乏时，理想地在治疗条件下将足量的活性形式的脂联素优选施给哺乳动物或人，来恢复循环的、血液的或组织的脂联素到正常水平，或在正常水平的±5％内，或在正常水平的±10％内，或在正常水平的±25％内，或在正常水平的±50％内。但是，当明显地存在正常循环浓度的脂联素时，脂联素治疗也可能是有效的，以至存在正常脂联素水平不是脂联素治疗的禁忌征。
这种有效量可以通过各种给药路径一次或多次地被施用。
本文的“哺乳动物”的含义除了人和小鼠之外还包括任何适当的哺乳动物，但不限于家畜、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物。
这种酒精性肝脏疾病的状况特征可以通过脂肪变性(脂肪浸润)、炎症、坏死、纤维化、硬化和/或功能紊乱中任何一种或多种来预测。
按照本发明，适合用于人的治疗的优选剂量单位是能够将脂联素施用给人而不会导致在存储中丧失其稳定性或在体内产生有益效果之前的不必要地失活的任何形式。
这将会在下文中以其更加简单的形式被描述，而不依赖于任何的容器(无论是胶囊或其他形式)，脂联素可以借助手术植入递送装置如渗透泵被施用，这是本领域熟知的，适合于治疗性蛋白施用的可替代剂量形式也可以被使用。
因此，在本发明的另一个方面是治疗其本身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，包含给患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来抑制TNF-□水平低于将没有这种施用时存在或可能存在的水平。
优选这种施用是治疗、改善、预防和/或反转TNF-□疾病或紊乱和/或TNF-□疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的残基的一个或多个被糖基化的人脂联素。
优选所述TNF-□疾病或紊乱是如下的任何一种或多种炎症性疾病、循环疾病、门脉高压、肺动脉高血压、变应性疾病、克隆病、自体免疫溶血性贫血、牛皮癣、肝脏疾病、胰腺病、神经变性疾病、中枢神经衰竭、毒血症、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血症、高胆固醇血症、异常葡萄糖耐受、实体瘤、肿瘤和伴随的恶病质、内分泌疾病、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染、经皮冠状动脉成形、血管肥大或闭塞、PTCA/支架/旁路手术后的血管再闭塞/再狭窄、干预后的血管肥大或闭塞、抑制植入诱导的血管衰退和排斥、器官或组织移植后的排斥和自体免疫疾病、在新型治疗过程中TNF生成相关的负作用，还消除和改善与治疗或预防移植排斥相关的休克相关综合症、透析性低血压、青光眼、眼压高、重症肌无力、长期脱脂症、骨病、神经紊乱、TNF-□诱导的胰岛素耐受、异常凋亡、糖尿病或应激高血糖症的并发症、慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎和肺气肿。
优选所述炎症反应是如下的任何一种糖尿病并发症如视网膜病、肾病、神经病、主要血管和微血管紊乱、糖尿病性肾病；关节炎如慢性类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性脊髓炎和骨膜瘤形成；术后/外伤后的炎症；肿胀修复；咽炎；膀胱炎；肺炎；心肌炎；心肌症；特发性皮炎；炎症性肠道疾病如克隆病和溃疡性结肠炎；脑膜炎；炎症性眼病；炎症性肺病如肺炎、硅肺、结节性肺病、炎症性骨紊乱和肺结核。
优选所述循环疾病包括如下的任何一种慢性心力衰竭包括心律不齐、心绞痛、心肌梗死、心功能不全和充血性心力衰竭，动脉硬化包括动脉粥样硬化症、高血压、深静脉血栓、闭塞性外周循环衰竭、局部的大脑循环衰竭、弥漫性血管内凝血综合症、雷诺病、Buerger病。
优选所述变应性疾病包括如下的任何一种哮喘、过敏性鼻炎、结膜炎、消化道过敏反应、花粉病和过敏性反应、慢性闭塞性肺病、胶原形成。
优选所述神经变性疾病包括如下的任何一种阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、AIDS、脑病。
优选所述中枢神经衰竭包括如下的任何一种脑血管衰竭如脑出血和脑梗塞及其后遗症、颅创伤、脊髓损伤、脑水肿、痴呆、健忘症、失忆、多发性硬化。
优选所述毒血症包括如下的任何一种败血症、败血性休克、内毒素休克、革兰氏阴性败血症、毒素休克综合症。
优选所述癌症肿瘤包括如下的任何一种恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化器官的癌症。
优选所述内分泌疾病包括如下的任何一种Addison病、Cushing综合症、黑素细胞瘤、原发性醛固酮增多症。
优选所述自体免疫疾病包括如下的任何一种器官特异性疾病如甲状腺炎或非特异性器官疾病如风湿症的和骨性关节炎。
优选所述骨病包括如下的任何一种如骨折、骨再折、骨质疏松症、骨软化、骨Behcet病、强直性脊柱炎、慢性风湿性关节炎、膝关节炎以及在相关疾病中关节组织损坏。
优选所述神经紊乱包括对各个神经、神经根、脊髓和/或大脑的创伤、损伤压迫，如急性脊髓和大脑损伤、髓鞘脱失病、如多发性硬化症、由转移肿瘤、原发性或转移的大脑肿瘤产生的脊髓压迫、由转移肿瘤产生的慢性疼痛综合症、炎症性CNS疾病，如亚急性硬化型全脑炎、亨廷顿病、Guillain-Barre综合症、Bell氏瘫痪、糖尿病性神经病、视神经炎、黄斑退化、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病、肌肉萎缩症，和多肌炎-皮肌炎。
优选所述异常凋亡包括任何病毒诱导的凋亡抑制。
优选所述糖尿病或应激高血糖症的并发症包括如下的任何一种或多种心肌梗塞、充血性心力衰竭，和心原性休克。
优选脂联素是人脂联素。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。可以预期，当指非人类物种的脂联素时，是不同于人脂联素的脂联素变体或平截的脂联素，脂联素残基参照采用对应于人序列残基的编号，通过这两条序列的最佳排列来确定。
脂联素制剂可以适合于施用给人的方式配制，优选以肠胃外施用的方式，通过如皮下的(s.c.)、真皮内的(i.d.)、静脉内的(i.v.)、腹膜内的(i.p.)或经皮的路径。其他的制剂也是可以，其中所述脂联素通过口腔、直肠、阴道、膀胱内、鞘内、心室内、脑内或其他本领域技术人员知晓的路径被施用。
优选的施用路径是肠胃外。适合于肠胃外施用的脂联素被配制在含有稳定用缓冲剂的水溶液中，优选在或接近等渗强度，和具有适当的防腐剂、防沫剂、抗沉淀剂和其他本领域技术人员已知的稳定剂以适合于施用给哺乳动物特别是人的蛋白质的药物配制剂，特别是适合于在溶液中稳定施用给哺乳动物优选是人的治疗性蛋白质的那些。
在第二个方面，本发明涉及治疗其自身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，包含或包括给该患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来将TNF-α水平抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平，从而对于如下的任何一种或多种的症状产生有利反应炎症疾病、循环疾病、门脉高压、肺动脉高血压、变应性疾病、克隆病、自体免疫溶血性贫血、牛皮癣、肝脏疾病、胰腺病、神经变性疾病、中枢神经衰竭、毒血症、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血、高胆固醇血症、异常葡萄糖耐受、实体瘤、肿瘤和伴随的恶病质、内分泌疾病、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染、经皮冠状动脉成形、血管肥大或闭塞、PTCA/支架/旁路手术后的血管再闭塞/再狭窄、干预后的血管肥大或闭塞、抑制植入诱导的血管衰退和排斥、器官或组织移植后的排斥和自体免疫疾病、在新型治疗过程中TNF生成相关的负作用，还消除和改善与治疗或预防移植排斥相关的休克相关综合症，透析性低血压、青光眼、眼压高、重症肌无力、长期脱脂症、骨病、神经紊乱、TNF-α诱导的胰岛素耐受、异常凋亡、糖尿病或应激高血糖症的并发症、慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎和肺气肿。
优选所述炎症反应是如下的任何一种糖尿病并发症如视网膜病、肾病、神经病、主要血管和微血管紊乱、糖尿病性肾病；关节炎如慢性类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性脊髓炎和骨膜瘤形成；术后/外伤后的炎症；肿胀修复；咽炎；膀胱炎；肺炎；心肌炎；心肌症；特发性皮炎；炎症性肠道疾病如克隆病和溃疡性结肠炎；脑膜炎；炎症性眼病；炎症性肺病如肺炎、硅肺、结节性肺病、炎症性骨紊乱和肺结核。
优选所述循环疾病包括如下的任何一种慢性心力衰竭包括心律不齐、心绞痛、心肌梗死、心功能不全和充血性心力衰竭，动脉硬化包括动脉粥样硬化症、高血压、深静脉血栓、闭塞性外周循环衰竭、局部的大脑循环衰竭、弥漫性血管内凝血综合症、雷诺病、Buerger病。
优选所述变应性疾病包括如下的任何一种哮喘、过敏性鼻炎、结膜炎、消化道过敏反应、花粉病和过敏反应、慢性闭塞性肺病、胶原形成。
优选所述神经变性疾病包括如下的任何一种阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、AIDS、脑病。
优选所述中枢神经衰竭包括如下的任何一种脑血管衰竭如脑出血和脑梗塞及其后遗症、颅创伤、脊髓损伤、脑水肿、痴呆、健忘症、失忆、多发性硬化。
优选所述毒血症包括如下的任何一种败血症、败血性休克、内毒素休克、革兰氏阴性败血症、毒素休克综合症。
优选所述癌症肿瘤包括如下的任何一种恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化器官的癌症。
优选所述内分泌疾病包括如下的任何一种Addison病、Cushing综合症、黑素细胞瘤、原发性醛固酮增多症。
优选所述自体免疫疾病包括如下的任何一种器官特异性疾病如甲状腺炎或非特异性器官疾病如风湿症的和骨性关节炎。
优选所述骨病包括如下的任何一种如骨折、骨再折、骨质疏松症、骨软化、骨Behcet病、强直性脊柱炎、慢性风湿性关节炎、膝关节炎以及在相关疾病中关节组织损坏。
优选所述神经紊乱包括对各个神经、神经根、脊髓和/或大脑的创伤、损伤压迫，如急性脊髓和大脑损伤、髓鞘脱失病、如多发性硬化症、由转移肿瘤、原发性或转移的大脑肿瘤产生的脊髓压迫、由转移肿瘤产生的慢性疼痛综合症、炎症性CNS疾病，如亚急性硬化型全脑炎、亨廷顿病、Guillain-Barre综合症、Bell氏瘫痪、糖尿病性神经病、视神经炎、黄斑退化、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病、肌肉萎缩症，和多肌炎-皮肌炎。
优选所述异常凋亡包括任何病毒诱导的凋亡抑制。
优选所述糖尿病或应激高血糖症的并发症包括如下的任何一种或多种心肌梗塞、充血性心力衰竭，和心原性休克。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。可以预期，当指非人类物种的脂联素时，是不同于人脂联素的脂联素变体或平截的脂联素，脂联素残基参照采用对应于人序列残基的编号，通过这两条序列的最佳排列来确定。
脂联素制剂可以适合于施用给人的方式配制，优选以肠胃外施用的方式，通过如皮下的(s.c.)、真皮内的(i.d.)、静脉内的(i.v.)、腹膜内的(i.p.)或经皮的路径。其他的制剂也是可以，其中所述脂联素通过口腔、直肠、阴道、膀胱内、鞘内、心室内、脑内或其他本领域技术人员知晓的路径被施用。
优选的施用路径是肠胃外。适合于肠胃外施用的脂联素被配制在含有稳定用缓冲剂的水溶液中，优选在或接近等渗强度，和具有适当的防腐剂、防沫剂、抗沉淀剂和其他本领域技术人员已知的稳定剂来适合于施用给哺乳动物特别是人的蛋白质的药物配制剂，特别是适合于在溶液中起稳定施用给哺乳动物优选是人的治疗性蛋白质的作用的那些。
在本发明的另一个方面中，提供一种治疗自身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，包括给该患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来将TNF-αmRNA水平抑制为低于将没有这种施用时存在或可能存在的水平。
优选这种施用将治疗、改善、预防和/或反转TNF-α疾病或紊乱或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在本发明的另一个方面中，提供一种治疗自身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，包括给该患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来治疗、改善、预防和/或反转TNF-α疾病和/或紊乱或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
在本发明的另一个方面中，提供一种改善哺乳动物患者中的TNF-α的有害作用的方法，包含给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在本发明的另一个方面中，提供一种治疗遭受或可能具有与不期望的高水平TNF-α相关的疾病或紊乱的哺乳动物患者的方法，该方法包含给患者施用有效量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在本发明的另一个方面中，提供一种抑制和拮抗TNF-α活性来治疗哺乳动物患者中与TNF-α相关的疾病或紊乱的方法，该方法包含给患者施用有效量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在另一个方面中，本发明涉及一种治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包括或包含，(直接地或间接地)监测哺乳动物患者中的脂联素，和/或给哺乳动物患者施用脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂，这样的治疗将TNF-α水平抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平。
优选这种施用是来治疗、改善、预防和/或反转TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在另一个方面中，本发明涉及一种治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包括或包含，(直接地或间接地)监测哺乳动物患者中的脂联素mRNA，和/或给哺乳动物患者施用脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂，这样的治疗将TNF-α抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平。
优选这种施用是来治疗、改善、预防和/或反转TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的残基的一个或多个被糖基化的人脂联素。
在另一个方面中，本发明涉及一种治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包括或包含，(直接地或间接地)监测哺乳动物患者中的脂联素，和/或给哺乳动物患者施用脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂，这种治疗的目的在于治疗、反转或预防TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在另一个方面中，本发明涉及一种治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包括或包含，(直接地或间接地)监测哺乳动物患者中的脂联素mRNA，和/或给哺乳动物患者施用脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂，这种治疗的目的在于治疗、反转或预防TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的残基的一个或多个被糖基化的人脂联素。
还有一方面，本发明涉及(优选有效量的)脂联素和/或脂联素作用位点激动剂与其他一种或多种材料(无论是受体、共活性剂、稀释剂等等和/或剂量单位限定的容器)在加工有效用于抑制TNF-α低于没有这种施用时存在或可能存在的水平的剂量单位或药物组合物中的用途。
优选这种剂量形式或药物组合物是用来治疗、改善、预防和/或反转TNF-α疾病或紊乱或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
还有一方面，本发明涉及(优选有效量的)脂联素和/或脂联素作用位点激动剂与其他一种或多种材料(无论是受体、共活性剂、稀释剂或等等和/或剂量单位限定的容器)在加工有效用于治疗、预防和/或反转TNF-α疾病和/或紊乱或TNF-α疾病或紊乱的任何特征的剂量单位或药物组合物中的用途。
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
还有一个方面，本发明涉及一种制品，其包含或包括含有脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的容器；脂联素和/或脂联素作用位点激动剂(如，含有在容器中的)用于有效抑制TNF-α低于没有这种施用时会存在或可能存在的水平的使用说明书。
在还有一个方面中，本发明在于一种制品，其包含或包括含有脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的容器；脂联素或脂联素作用位点激动剂(如含在容器中的)用于治疗、预防或反转TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征的使用说明书。
还有一个方面，本发明在于一种制品，其包含或包括含有脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的包装材料；脂联素或脂联素作用位点激动剂(如，含在包装材料中的)用于有效抑制TNF-α低于没有这种施用时会存在或可能存在的水平的使用说明书。
在还有一个方面中，本发明涉及一种制品，其包含或包括含有脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的包装材料；脂联素或脂联素作用位点激动剂(如含在包装材料中的)用于治疗、预防或反转TNF-α疾病和/或紊乱或TNF-α疾病或紊乱的任何特征的使用说明书。
在另一个方面，本发明涉及治疗遭受或患有肝脏疾病和/或具有肝脏疾病的任何特征的哺乳动物患者的方法，其包含或包括给该患者使用脂联素和/或脂联素作用位点激动剂。
肝脏疾病是急性肝脏疾病、慢性肝脏疾病、肝脏炎症、肝脏功能紊乱、脂肪肝(肝脂肪变性)、肝脏纤维化、肝脏硬化、肝脏坏死、肝细胞坏死、酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎、酒精性肝坏死、酒精性肝硬化、肝坏死、肝脂肪变性、与糖尿病相关的肝脂肪变性、与富含脂类的饮食相关肝脂肪变性、与脂类代谢异常相关的肝脂肪变性、由任何情况引起的肝炎、由任何情况导致的肝坏死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自发性肝炎、肝脏的病毒感染或发炎继发的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何药物或毒素作用继发的肝炎、胆汁郁积随之发生的肝炎或肝功能紊乱、原发性胆汁性肝硬化、肝脏肉芽肿病，和/或其中肿瘤坏死因子的组织或血液浓度升高起致病作用的情况中的任何一种或多种.
优选哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
优选脂联素是全长的。
优选脂联素被糖基化。
更加优选脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
在人类治疗中，脂联素优选包括与人脂联素相关的脂联素，和/或其激动剂例如通过传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学方法获得，它们属于本领域的技术。脂联素可以通过将编码蛋白的多核苷酸(通常为DNA)序列插入到表达载体中并在适当的宿主中表达多肽来重组生产。编码所需多肽的多核苷酸，无论是被融合的或成熟形式，和无论是否含有用于分泌的信号序列，被连接到适合于任何适当宿主的表达载体上。虽然由于真核细胞能够进行翻译后的修饰如糖基化而推荐采用真核表达系统，但是可以采用任何本领域技术人员知晓的各种表达载体。可以在任何适当的用含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的宿主细胞中实现表达。真核宿主细胞的例子是本领域已知的，包括酵母、鸟类、昆虫、植物和动物细胞如COS7、Hela、CHO及其它的哺乳动物细胞。重组生产的标准技术被描述如在上文的Sambrook中。可以通过在哺乳动物细胞中表达编码脂联素或其生物活性片段或其变体或其同工型的重组多核苷酸来获得脂联素。
在另一个实施方案中，脂联素(包括同工型和糖基化同工型的混合物)还可以从动物组织中纯化，例如但不限于血清或脂肪细胞。从脂肪细胞中纯化脂联素的方法在本领域是熟知的，还在先前提及的US专利申请No.60/349,885中进一步被描述。可以获得糖基化脂联素组合物的动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、狗、牛和非人的灵长类。
按照本发明，“有效量”的含义是任何其单独或与其他的这些量合作时足以实现包括临床效果的有益的或期望效果的含量。
应当指出，本发明人已经证明许多肝脏疾病，如酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎和酒精性肝坏死、糖尿病性脂肪变性和糖尿病、高脂肪饮食±肝脂肪变性继发的胰岛素耐受，都伴随着脂联素蛋白和脂联素mRNA的血液和脂肪浓度下降(与酒精摄食相关的数据，见本申请)。
因此，治疗的重要原则是当出现脂联素缺乏时，理想地在治疗条件下将足量的活性形式的脂联素优选施给哺乳动物或人，恢复循环的、血液的或组织的脂联素到正常水平，或在正常水平的±5％内，或在正常水平的±10％内，或在正常水平的±25％内，或在正常水平的±50％内。但是，当明显地存在正常循环浓度的脂联素时，脂联素治疗也可能是有效的，使得存在正常脂联素水平不是脂联素治疗的禁忌征。
这种有效量可以通过各种给药路径一次或多次地被施用。
本文的“哺乳动物”的含义包括，除了人和小鼠之外，还包括任何适当的哺乳动物但不限于家畜、运动动物、宠物、灵长类动物。
这种酒精性肝脏疾病的状况特征可以通过脂肪变性(脂肪浸润)、炎症、坏死、纤维化、硬化和/或功能紊乱中任何一种或多种来预测。
按照本发明，适合用于人的治疗的优选剂量单位是能够将脂联素施用给人而不导致在存储中丧失其稳定性或在体内在产生有益效果之前不必要地失活的任何形式。
这将会在下文中以其更加简单的形式被描述，而不依赖于任何的容器(无论是胶囊或其他形式)，脂联素可以借助手术植入递送装置如渗透泵被施用，这是本领域熟知的，适合于治疗性蛋白施用的可替代剂量形式也可以被使用。
本发明提供糖基化的脂联素和糖基化脂联素的组合物。优选这种脂联素用于治疗或制药用途(如本文公开的任何作用)。在一个方面，本发明提供被糖基化的和被重组、分离、纯化或合成的脂联素多肽。优选脂联素多肽是人脂联素。优选至少对应于人脂联素赖氨酸残基65、68，77和101(残基按照人多肽被编号)的赖氨酸残基之一被糖基化。在一个实施方案中，脂联素完全被糖基化。在本发明的另一个方面，被加到赖氨酸残基上的糖部分是葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一个方面，脂联素多肽在赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)的每个上至少具有一个葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一个实施方案中，脂联素多肽在至少赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)之一上或全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有结构X1，其中每个X1单独选自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一种或多种。在一个实施方案中，脂联素多肽中的所有赖氨酸都被充分糖基化。
在另一个方面，本发明提供含有被糖基化的脂联素多肽的组合物。在一个实施方案中，组合物中的脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。在另一个实施方案中，组合物中的脂联素多肽是人脂联素。优选至少对应于脂联素赖氨酸残基65、68，77和101(残基按照人的多肽被编号)的赖氨酸残基之一被糖基化。在另一个实施方案中，组合物含有重组、分离、纯化或合成的脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素赖氨酸残基65、68，77和101(或其他物种或脂联素变体的相应残基)的赖氨酸残基之一被糖基化。在一个实施方案中，组合物含有所有赖氨酸残基(Lys-65、68、77和101)都被糖基化的脂联素多肽。在另一个实施方案中，组合物含有在每个赖氨酸残基65、68、77和101上具有至少一个糖部分的脂联素多肽。在另一个实施方案中，组合物含有被单个糖部分糖基化的脂联素。单个糖部分可以是如唾液酸、葡糖基、半乳糖基、N-乙酰半乳糖基、N-乙酰葡糖基、唾液酸基Lewis X(sialylLewis X)、和岩藻糖基。在另一个实施方案中，组合物含有用多个糖部分糖基化的脂联素。在另一个实施方案中，组合物含有在每个赖氨酸残基65、68、77和101上具有至少一个葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分的脂联素多肽。在另一个实施方案中，脂联素多肽在至少赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)之一或全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有结构X1，其中每个X1单独选自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一种或多种。在一个实施方案中，组合物含有在所有赖氨酸残基65、68、77和101上具有结构X1的脂联素多肽。在另一个实施方案中，组合物含有具有天然哺乳动物脂联素的序列的脂联素多肽。
在另一个方面，本发明提供含有脂联素多肽的组合物，其基本上不含有至少一种非糖基化的脂联素同工型。在一个实施方案中，组合物基本上不含有同工型1。在另一个实施方案中，组合物基本上不含同工型2。在另一个实施方案中，组合物基本上不含任何非糖基化的脂联素同工型。
在另一个方面，本发明提供含有脂联素多肽的组合物，其中主要的脂联素种类被完全糖基化。在一个实施方案中，组合物含有Lys-68、71、80和104全部被糖基化的脂联素。在另一个实施方案中，组合物含有一种以上的脂联素同工型。在另一个实施方案中，同工型3是组合物中的主要脂联素。在另一个实施方案中，同工型4是组合物中主要的脂联素。在另一个实施方案中，同工型5是组合物中主要的脂联素。在另一个实施方案中，同工型6是组合物中主要的脂联素。
在另一个方面，发明提供一种组合物，当将组合物施用给哺乳动物时增强胰岛素的作用。在一个实施方案中，胰岛素存在的含量或浓度足以产生在约50pM到约400pM之间的血液胰岛素浓度。在另一个实施方案中，胰岛素存在的含量或浓度足以产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度。在另一个实施方案中，胰岛素存在的含量或浓度足以产生约200pM的血液胰岛素浓度。
在另一个方面，本发明提供糖基化脂联素的组合物，其中当该组合物被施用给个体时抑制糖原异生作用。
在另一个方面，发明提供制备含有糖基化脂联素的组合物的方法，其通过获得含有糖基化程度或类型不同的至少两种形式脂联素的第一组合物，然后根据糖基化程度或类型分离脂联素，从而制备在脂联素模式上区别于第一组合物的第二组合物。在一个实施方案中，脂联素是通过在哺乳动物细胞中表达编码脂联素的重组多核苷酸来获得。在一个实施方案中，重组多核苷酸编码具有在图5中描述的序列的多肽或其生物活性片段或其变体。在另一个实施方案中，脂联素从动物组织中纯化。在另一个实施方案中，动物是人、小鼠、大鼠、狗、牛、或非人的灵长类。在另一个实施方案中，组织是血清或脂肪细胞。在另一个实施方案中，分离中包括电泳的步骤。在另一个实施方案中，分离中不包括电泳的步骤。在另一个实施方案中，分离中包括层析的步骤。在另一个实施方案中，分离中不包括层析的步骤。在另一个实施方案中，第二组合物是上述所列的要求保护的任何组合物之一。
在另一个方面，发明提供通过任何上述方法制备的组合物。
在另一个方面，发明提供通过监测特定脂联素同工型的水平或至少两种糖基化的脂联素同工型的表达模式，来诊断个体中患有或易感与脂联素调控相关的疾病状态的方法。在一个实施方案中，疾病状态是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、代谢综合征包括特发性高血压性动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、多囊卵巢综合征或其他与脂联素缺乏或肥胖相关的状态。在另一个实施方案中，脂联素得自生物样本。在另一个实施方案中，至少一种同工型是完全糖基化的同工型。在另一个实施方案中，通过确定糖基化脂联素同工型的水平和表达模式来获得水平和表达模式。在另一个实施方案中，评价的方法是电泳、HPLC或质谱分析。
在另一个方面，发明提供诊断个体中患有或易于产生疾病状态的方法，其通过在个体中测定特定脂联素同工型的水平或至少两种糖基化的脂联素同工型的表达模式，并将该表达模式与没有遭受这种疾病状态的个体的表达模式特征比较，其中表达模式的差异指示患有或者可能产生该疾病。
在另一个方面，发明提供诊断个体中患有或易于产生疾病状态的方法，其通过测定个体中特定的脂联素同工型的水平或至少两种糖基化的脂联素同工型的表达模式，并将该表达模式与患有这种疾病状态的个体的表达模式特征比较，其中表达模式相似指示患有或可能产生该疾病。
在另一个方面，本发明提供通过给个体施用有效量的任何上述的组合物来治疗个体中与脂联素调控相关的疾病状态的方法。在一个实施方案中，疾病状态是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、多囊卵巢综合征或其他与脂联素缺乏或肥胖相关的状态。
在另一个方面，本发明提供糖基化的脂联素多肽在制备用于在哺乳动物患者中i)治疗与脂联素调控相关的疾病状态；或ii)提高胰岛素作用；或iii)抑制糖原异生的剂量单位或药物组合物或药剂中的用途。优选所述脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。优选所述脂联素是人脂联素。优选所述剂量单位或药物组合物或药剂还包含胰岛素。优选胰岛素的浓度足以有效地产生在约50pM到约400pM的血液胰岛素浓度。优选胰岛素的浓度足以有效地产生在约100pM到约300pM的血液胰岛素浓度。优选胰岛素浓度足以有效地产生约200pM的血液胰岛素浓度。
附图简要说明

图1表示通过双向电泳(2-DE)分离的脂肪细胞分泌的蛋白，显示多种脂联素同工型。分汇合的3T3-L1前脂肪细胞(A)或分化诱导8天后的脂肪细胞(B)用PBS洗涤3次，然后用无血清的DMEM培养4hr。收集培养物、浓缩，通过2-DE从各个样本中分离出50μg蛋白，用试验方法(实施例1)中描述的银染色可视化。脂肪细胞中优先分泌的蛋白用编号的箭头标注。在(C)中，来自脂肪细胞的分泌蛋白如上通过2-DE分离，转移到硝化纤维膜上，用以1∶1000稀释的兔抗脂联素抗体检测。表明所有8个箭头标记的蛋白与抗脂联素抗体发生免疫反应。
图2表示在2-DE分离后，脂肪细胞分泌产物的糖蛋白检测。200μg从脂肪细胞的培养物中收获的蛋白质通过如图1的2-DE分离，转移到硝化纤维膜上，并用检测糖蛋白的免疫印迹(immu-bolt)试剂盒进行检测。8种不同的脂联素同工型如图1用编号的箭头标注。
图3表示衍生自不同脂联素同工型的胰蛋白酶肽(tryptic peptide)混合物MALDI-TOF质谱分析图。细菌产生的脂联素(A)，从脂肪细胞中分泌的脂联素同工型1(B)和同工型3(C)，和在COS-7细胞中被表达的脂联素同工型3(D)在凝胶中用胰蛋白酶消化，胰蛋白酶混合物通过MALDI-TOF MS分析。表明用箭头标注的三种肽(分子量(mass)为1679、4260和4276Da)在脂肪细胞和COS-7细胞生成的所有糖基化同工型(3到8)中被重复地观察到，而不是在两种未糖基化同工型(1和2)或细菌生产的脂联素中。
图4表示通过RP-HLPC、MALDI-TOF MS以及氨基酸测序分部分离和表征脂联素的胰蛋白酶肽。通过2-DE分离的脂联素的所有糖基化同工型从凝胶中被切除，汇集，用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶肽混合物通过RP-HLPC分离。收集每个部分，用MALDI-TOF MS分析。含有分子量为1679、4260和4276Da的肽的三个部分分别用A、B和C表示。下表给出氨基酸序列、试验观察的分子量、理论分子量和这三种肽的分子量差别。
图5给出脂联素的胶原域的四个被修饰的赖氨酸(按照鼠的编号体系被编号为68、71、80和104)在所有种类中是保守的。小鼠、人、牛、猴和狗的脂联素的序列分别参照登录号BAB22597、NP_004788、AAK58902、AAK92202和AAL09702。四个被修饰的赖氨酸和其周边序列(surrounding motif)以高亮显示。
图6表示图4中分离的三种胰蛋白酶肽的氨基酸分析。肽A(具有1679Da的分子量)、肽B(具有4260Da的分子量)、肽C(具有4276Da的分子量)在110℃下用6N HCl消化24hr(表明这种处理破坏糖残基但是可以检测和量化羟基赖氨酸和羟基脯氨酸[26])，游离氨基酸残基通过PITC衍生，通过421氨基酸分析仪分析。a氨基酸标准物的光谱。b羟基脯氨酸标准物的光谱。c羟基赖氨酸标准物的光谱。d肽A的光谱。e肽C的光谱。f肽B的光谱。
图7表示来自Asp-N消化的肽B和C的肽混合物的MALDI-TOFMS光谱。在图4中分离的肽C(I)和B(II)进一步用Asp-N消化，然后用如图3中的MALDI-TOF MS分析。肽序列和对各个物质的可能的修饰显示在各个峰上方。表明Pro94排布为羟基化的脯氨酸也被氨基酸序列确定。
图8表示在四个羟基赖氨酸上的糖苷含有葡糖基和半乳糖基基团。COS-7细胞用pcDNA-Ad-F转染，然后在含有2mM葡萄糖的DMEM中用100μCi/ml 3H-1-半乳糖放射标记48hr，或者在含有2mM半乳糖的DMEM中用100μCi/ml 3H-1-葡萄糖放射标记48hr。从细胞培养物中纯化FLAG标记的脂联素，来自未被标记或放射标记的脂联素的胰蛋白酶肽混合物用如图4中的RP-HPLC分离来获得肽A、B和C。为了比较放射性，各种肽的等分试样进行液体闪烁计数。
图9表示FLAG标记的脂联素变体(K→R)的表达和碳水化合物检测。COS-7细胞用pcDNA-Ad-F或pcDNA-Ad(K→R)-F转染。(注pcDNA-Ad-F是表达FLAG标记的野生型鼠脂联素的pcDNA载体，pcDNA-Ad(K→R)-F是表达鼠脂联素变体的等价载体，该变体中四个在野生型分子中通常被羟基化和糖基化的赖氨酸残基被突变为精氨酸残基)。48hr后，FLAG标记的脂联素或脂联素变体(K→R)从细胞培养物中被纯化。500ng来自各个样本的蛋白用15％SDS-PAGE分离，用考马斯亮兰(CBB)染色(组A)或用免疫印迹糖蛋白检测试剂盒检测(组B)。表明绝大部分糖基化在脂联素变体(K→R)中被去除。
图10表示脂联素和脂联素变体对初级大鼠肝脏细胞中由胰岛素引起的对葡萄糖生成的抑制的影响。上边组(组A)表示缺少或存在20μ/ml由COS-7细胞生成的脂联素或脂联素变体(K→R)或者20μ/ml细菌生成的脂联素时，用逐步加量的胰岛素处理后对肝脏葡萄糖生成的抑制。下边组(组B)表示在用50pM胰岛素加上逐步加量的由COS-7细胞生成的脂联素或脂联素变体(K→R)，或者细菌生产的脂联素处理后，肝脏葡萄糖生成的抑制。结果被描述为葡萄糖生产相对于未被处理的细胞中的产量的百分比例下降，表示为平均值±标准方差(n＝4)。Ad来自COS-7细胞的脂联素；Ad变体来自COS-7细胞的脂联素变体(K→R)。pAd来自大肠杆菌(E.Coli)的脂联素。
图11表示长期摄食酒精降低血浆脂联素，升高TNF-α并导致肝脏损伤。在小鼠被饲喂高脂肪液体对照食物(虚线)或者高脂肪含酒精食物(实线)后，在不同阶段采集血浆样本，然后按照本文描述量化血浆脂联素(A)、ALT(B)和TNF-α(C)的水平。*P＜0.05酒精食物对对照食物(n＝6)。
图12表示脂联素处理消除了小鼠中酒精诱导的肝中体重比(A)和血浆ALT浓度(B)的升高。在摄食液体对照食物(LC)、液体酒精食物(LE)或在最后2周用脂联素处理的液体酒精食物(LE+Ad)的5周后收集血浆样本，尸体解剖时测定肝脏与体重比(A)和血清ALT水平(B)(n＝5)。*P＜0.05是与仅食用LE食物的小鼠比较。
图13表示脂联素对酒精诱导的脂肪变性和炎症的影响。在摄食液体对照食物肝样本(LC)、液体乙醇食物(LE)或在最后2周用脂联素处理的液体酒精食物(LE+Ad)5周后，从小鼠肝脏中取出肝脏样本，用油红O(上边组)或苏木精和曙红(下边组)进行染色。结果是来自六个独立试验的代表性显微照片。
图14表示脂联素降低脂肪酸合酶(FAS)和CD36的mRNA表达，和抑制肝脏中TNF-α生成(A)。从饲喂液体对照食物、液体酒精食物或用脂联素处理的液体酒精食物的小鼠肝脏中提取总RNA，并分别用33P标记的TNF-α、FAS或CD36进行RNA印迹分析(B)。来自组A的结果通过磷光成像(phosphorimaging)仪量化(n＝5)。在对16S RNA的丰度归一化后，相对于未处理的HF/LC配对饲喂的对照物，所有RNA水平被表达(C)。TNF-α的血浆浓度用来自Chemico的ELISA试剂盒量化(n＝5)。**P＜0.01HF/LE食物与HF/LE食物加上脂联素处理比较。FAS，脂肪酸合酶；TNF-α，肿瘤坏死因子α。
图15表示脂联素的肝脏保护作用的可能机制的图示。FA游离脂肪酸；ACC乙酰辅酶A羧化酶；AMPK5’-AMP活性激酶；FAS脂肪酸合酶；TNF-α肿瘤坏死因子α。
图16在具有周边序列GXKGE(D)的脂联素的胶原域内的一些保守赖氨酸残基(小鼠脂联素的Lys68、71、80和104或者其他种类或脂联素变体中的相应残基)上发生脂联素的糖基化和羟基化。
发明祥述I.一般技术除非特别说明，在本发明的实施中采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、和免疫学的传统技术，它们属于本领域的技术。这些技术在文献中被充分说明，如分子克隆实验室手册，第二版(Molecular CloningA LaboratoryManual，second edition)(Sambrook等，1989)和分子克隆“实验室手册，第三版(Molecular CloningA Laboratory Manual，third edition)(Sambrook和Russel，2001)(在此均称为“Sambrook”)；分子生物学中的现有方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等编辑，1987，包括2001附录)；PCR聚合酶联反应(PCRThePolymerase Chain Reaction)，(Mullis等编辑，1994)；Harlow和Lane(1988)抗体，实验室手册，冷泉巷出版社，纽约(Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，NewYork)，和Harlow和Lane(1999)利用抗体，实验室手册，冷泉巷出版社，冷泉巷，纽约(Harlow and Lane(1999)Using AntibodiesALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)(在此均称为“Harlow和Lane”)，Beaucage等编辑，核酸化学中的现有方法(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)，JohnWiley & Sons，Inc，纽约，2000)。
II.定义“抗体”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体具有与特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和不具有抗原特异性的其他抗体样的分子。后者种类的多肽为，例如，少量由淋巴系统生成而大部分由骨髓瘤生成。术语“抗体”广义上被使用，特别地包括不限于完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多重特异性抗体(如双特异性抗体)和具有期望的生物活性的抗体片段。
“抗体片段”包括完整抗体的一个部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体(Zapata等，蛋白质工程(ProteinEng.)，8101057-1062 )；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多重特异性抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本同源的抗体(homogeneous antibodies)群中获得的抗体，即除了可能以极少量存在的可能天然突变体，构成该组的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接对抗单个抗原位点。而且，与通常包括直接对抗不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相反，每个单克隆抗体直接对抗抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优点在于其可以通过杂交瘤(hybridoma)培养合成，不会被其他的免疫球蛋白污染。修饰基因“单克隆”表明了从基本上同源的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不能如所需抗体的生产通过任何特定方法构建。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler等，自然(Nature)，256495 描述的杂交瘤方法制备，或者通过重组DNA方法制备(见如，美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以用Clackson等，自然(Nature)，352624-628 和Mark等，分子生物学期刊(J.Mol.Biol.，)，222581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到。
单克隆抗体在此特别地包括“嵌合的”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与从特定物种得到抗体的相应序列相同或同源，或者属于特定的抗体类型或亚类型，而链的剩余部分与衍生自其他物种的抗体的相应序列相同或同源，或者属于其他的抗体类型或亚类，以及具有期望的生物活性的这种抗体的片段。
可以预期，本文描述的每一个脂联素糖基化同工型的单克隆特异性抗体可以被用于治疗和诊断在此描述的脂联素疾病和紊乱。
“多克隆抗体”制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的。例如可以通过一次或多次注射免疫试剂以及如果需要和佐剂，在哺乳动物中产生多克隆抗体。
一般地，可以通过多次皮下或腹膜内注射，将免疫试剂和/或佐剂注射到哺乳动物中。免疫试剂可以包括本发明的脂联素多肽或其融合蛋白。
将免疫试剂与已知在被免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白结合是有用的。这种免疫原性蛋白的例子包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、和大豆胰蛋白酶抑制剂。可被使用的佐剂的例子包括Freumd完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂类A、合成的海藻糖二棒分枝菌酸盐(dicorynomycolate))。本领域技术人员不需要过度试验就可以选择免疫方法。
“单克隆抗体”此外，脂联素多肽抗体可选可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以采用杂交瘤的方法，如由Kohler和Milstein，自然(nature)，256495(1975)描述的方法制备。在一种杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物通常用免疫试剂免疫来产生淋巴细胞，淋巴细胞产生或能够产生会特异地与免疫试剂结合的抗体。
此外，可以在体外免疫淋巴细胞。
免疫试剂通常包括脂联素多肽，包括片段，或这种蛋白的融合蛋白或其片段。一般地，如果需要人源的细胞，即采用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，或者如果要求非人的哺乳动物来源的细胞，则采用脾脏细胞或淋巴结细胞。然后用合适的融合试剂如聚乙二醇将淋巴细胞与无限增殖的细胞系融合来形成杂交瘤细胞[Goding，单克隆抗体原理与操作，学院出版社，(1986)59-103(Goding，Monoclonal AntibodiesPrincipales and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103)]。无限增殖的细胞系通常是被转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。一般采用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在适合的培养物中培养，培养物中优选含有一种或多种抑制未融合的无限增殖细胞的生长和存活的物质。
优选无限增殖细胞系有效融合，通过被选择的产生抗体的细胞支持抗体稳定高水平的表达，并且对培养物如HAT培养物敏感。更加优选无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，它可以从如沙克学院细胞分类中心，圣地亚哥，加利福尼亚(Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego，California)和美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚(the American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，Virginia)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系也被描述用于人单克隆抗体的制备[Kozbor，免疫学期刊(J.Immunol.)，1333001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体生产技术和应用(MonoclonalAntibodv Production Techniques and Applications)，Marcel Dekker，Inc.，纽约(1987)pp.5163]。
然后可以分析培养杂交瘤细胞的培养物是否存在单克隆抗体。优选通过杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性用免疫沉淀法或用体外结合分析如放射免疫检测测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。这些技术和分析方法在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和性可以如通过Munson和Pollard，分析生物化学(Anal.Biochem.)，107220(1980)的斯卡查德分析来确定。
在鉴定了期望的杂交瘤细胞后，通过限制性稀释程序亚克隆该克隆(clones)并用标准的方法培养。用于该目的的合适培养物包括如Dulbecco′s Modifie Eagle′s Medium和RPMI-1640培养物。此外，杂交瘤细胞也可以作为腹水体内生长在哺乳动物中。
从培养物或腹水液中分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体可以用传统的免疫球蛋白纯化程序，如蛋白A琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
单克隆抗体还可以通过重组DNA方法制备。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以用传统方法(如采用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。本发明的杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦被分离，该DNA被放入到表达载体上，然后将载体转染给宿主细胞，在重组的宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。DNA也可以被修饰。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法在本领域是公知的。
体外方法也适合于制备单价抗体。可以采用本领域已知的常规技术完成抗体来制备其片段，特别是Fab片段。
“人和人源化抗体”人源化形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合序列)，其含有衍生自非人的免疫球蛋白的最短序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种如小鼠、大鼠或兔的具有期望的特异性、亲和性和容量(capacity)的CDR(供体抗体)的残基取代。
在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人的残基取代。人源化抗体还可以包含即不存在于受体抗体、也不在输入的CDR或构架序列中的残基。总之，人源化抗体基本包含至少一个，典型两个可变域(variable domain)的全部，其中对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的CDR区和全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗体最好还至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人的免疫球蛋白。
人源化非人的抗体的方法在本领域是公知的。一般地，人源化抗体具有一个或多个导入的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常称作为“输入”残基(import residue)，其通常从“输入”的可变域得到。人源化基本上可以按照下面的Winter和co-worker方法[Jones等，自然(nature)，321522-525(1986)；Riechmann等，自然(nature)，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科学(science)，2391534-1536(1988)]进行，用啮齿类CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。
因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上小于完整的人可变域已经被来自非人的物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿类抗体中的同功位点(analogous site)的残基取代。
人抗体还可以采用本领域已知的各种技术制备，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)，227381(1991)；Marks等，分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)，222581(1991)]。
Cole等和Berner等的技术也可以用来制备人的单克隆抗体[Cole等，单克隆抗体与癌症治疗(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，Alan R.Liss，77(1985)，和Berner等，免疫学期刊(J.Immunol.，)147(1)86-95(1991)]。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座(loci)导入转基因动物来制备，如内源性免疫球蛋白基因已经部分地或完全地被灭活的小鼠。在攻击中观察到人抗体的生产，其在所有方面，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分中，与在人中所观察到的相似。
“双特异性抗体”双特异性抗体是对于至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选为人的或人源化抗体。
制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。通常地，重组制备双特异性抗体是基于共表达两个免疫球蛋白的重链/轻链对，其中两个重链具有不同特异性(Milstein和Cuello，自然(nature)，305537-539 )。由于免疫球蛋白的重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四分瘤(quadromas))生产10种不同抗体分子的可能混合物，这些抗体中只有一种具有正确(correct)双特异性结构。纯化正确的分子通常通过亲和层析步骤完成。
具有期望的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)可以被融合到免疫球蛋白恒定域(domain)序列上。对于生产双特异性抗体的更加详细的描述见如Suresh等，酶学中的方法(Methods inEnzymology)，121210(1986)。
按照WO96/27011中描述的其他方法，一对抗体分子之间的接触面(interface)可以被设计来最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。优选的接触面至少包含抗体恒定域的CH3区的一部分。
在这种方法中，一个或多个来自第一个抗体分子的接触面的小的氨基酸侧链被大的侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。
通过用较小的侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链，在第二个抗体分子的接触面上形成与大侧链相同或相似大小的补偿“空腔”。这提供了一种机制来使异源二聚体的产量超过其他不期望的终产物如同源二聚体。
双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab’)2双特异性抗体)。由抗体片段生产双特异性抗体的方法已经在文献中被描述。如，双特异性抗体可以采用化学连接的方法制备。Brennan等，科学(Science)，22981(1985)描述了一种蛋白酶剪切(proteolyticallycleaved)水解完整抗体来生成F(ab’)2片段的方法。在存在连二硫络合剂亚砷酸钠下的情况下，这些片段被还原以稳定邻位二硫基，并防止分子间二硫化物形成。然后生成的Fab’片段被转化成硫硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原，将Fab’-TNB衍生物之一复原成Fab’-巯基，并与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合来形成双特异性抗体。生成的双特异性抗体可以用作酶的选择性固定的试剂。
Fab’片段可以直接地从大肠杆菌中回收，并被化学偶联来形成双特异性抗体。Shalaby等，试验方法期刊(J.Exp.Med.)，175217-225(1992)描述完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的制备。每一个Fab’片段分别由大肠杆菌分泌，并体外直接化学偶联产生双特异性抗体。
直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已经被描述，例如，已经用亮氨酸拉链制备了双特异性抗体。
Kostelny等，免疫学期刊(J.Immunol)，148(5)1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接到两种不同抗体的Fab’部分。在铰链区还原抗体同源二聚体以形成单体，然后再氧化形成抗体异源二聚体。这种方法还可以用于制备抗体同源二聚体。
在Hollinger等，美国国家科学院汇编90(Proc.Natal.Acad.Sci.USA 90)6444-8448(1993)中描述的“双抗体(diabody)”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的机制。该片段包含通过接头连接到轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)，该接头很短以至同一条链上的两个域之间不能配对。
因而，迫使一个片段上的区域VH和V与互补的其他片段上的VL和VH域配对，从而形成了两个抗原结合位点。另一种采用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的方案也已经被报道。见Gruber等，免疫学期刊(J.Immunol.)1525368(1994)。
高于二价的抗体也是可预期的。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学期刊(J.Immunol.)14760(1991)。
示例的双特异性抗体可以与本文给出的多肽上的两个不同表位结合。
另外，抗多肽的臂可以与结合到白细胞上的触发分子的臂联合来研究对细胞表达特定多肽的细胞防御机制，触发分子如T细胞受体分子(如CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受体(FcyR)，如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcFyRIII(CD16)。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性物质定位在表达特定多肽的细胞上。这些抗体具有多肽结合臂和结合细胞毒性试剂或放射性核素螯合剂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。另一种目标双特异性抗体结合多肽，还进一步结合组织因子(TF)。
“复共轭抗体(Heteroconiugate Antibodies)”复共轭抗体由二个共价结合的抗体组成。可以预料该抗体可以采用合成蛋白化学中的已知方法体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可以采用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的适合试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4巯基丁酰胺(methyl-4mercaptobutyrimidate)和那些在例如美国专利US专利No.4,676,980中公开的试剂。
“筛选检测”可被设计成寻找模拟天然PRO或PRO受体的生物活性的前导化合物(lead compounds)。这些筛选检测包括能够进行化学文库的高通量筛选的检测，使其特别适合于确定小分子药物候选物。可能的小分子包括合成的有机或无机的化合物。该检测可以以各种方式进行，包括蛋白质-蛋白质结合检测、生物化学筛选检测、免疫检测和基于细胞的检测。这些方法在本领域被充分表述。这些分析可以以各种方式进行，包括蛋白质-蛋白质结合检测、生物化学筛选检测、免疫检测和基于细胞的检测。这些方法在本领域被充分表述。
“免疫测定”包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹。适合的抗体检测标记在本领域是已知的，包括酶标签，如葡糖氧化酶，和放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99MTc)，和荧光标签，如荧光素和罗丹明和生物素，荧光放射性同位素、荧光邻近标记和其他本领域技术人员已知的标记。
“基本同源”或“基本相同”是指序列同源性，当采用如下的序列比较算法之一或通过视察(Visual inspection)测定，进行最大对应的比较和排列时，其中至少50％的序列是相同的，优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、更加优选至少90％的核苷酸或氨基酸残基同一性。两条序列(氨基酸或核苷酸)可以在它们的全长进行比较(如果他们长度基本不同，两者中较短的那条的长度)。对于序列比较，通常一条序列作为参比序列，被检测的序列与之比较。当采用序列比较算法时，检测和参比序列都被输入到计算机中，如果需要，指定亚序列坐标(subsequence coordinate)等同物，指定序列算法程序参数。然后序列比较算法根据设定的程序参数计算检测序列相对于参比序列的百分比序列同一性。可以通过Smith & Waterman先进应用数学(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源性算法(the local homologyalgorithm)、Needleman & Wunsch，分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)48443(1970)同源性序列对比排列算法(the homology alignmentalgorithm)、Pearson & Lipman，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444(1988)的检索相似性方法(the search for similaritymethod)、这些算法(威斯康星州麦迪逊的遗传计算小组，575科学Dr.的威斯康星遗传软件包中(the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化工具，或者通过观察(参见Ausubel等，分子生物学中的现有方法(Current Protocols In MolecularBiology)，Greene Publishing和Wiley-Interscience，纽约，同上)来引入用于比较的序列的最佳序列对比。当采用任何上述算法时，使用视窗(Window)长度的缺少参数(default parameters)、间隙罚分(gappenalty)等。两种核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是第一种多肽(如由第一种核酸编码的多肽)与第二种多肽(如由第二种核酸编码的多肽)发生免疫交叉反应。因此，例如当两种肽仅区别于保守置换时，一种多肽与第二种多肽基本相同。
当术语“基本上纯”或“分离的”涉及蛋白质和多肽时，表示这些多肽从与之天然相关的蛋白质或其他污染物中分离出来。当一种蛋白质超过含有该蛋白的组合物的总蛋白含量的约50％，典型地超过总蛋白含量的约60％时，该蛋白质或多肽被认为是基本上纯的。更典型地，基本上纯或分离的蛋白质或多肽将构成总蛋白的至少约75％，更优选至少约90％。优选该蛋白质将构成组合物中的总蛋白的超过约90％，更优选超过约95％。
“有效量”是足以有效地产生有益的或期望的效果包括临床效果的含量。有益效果包括但不限于改进个体对胰岛素敏感的能力、降低胰岛素耐受、减轻高血糖症、改善个体的肥胖症。有效量可以通过各种施用途径一次或多次施用。
本文所用“治疗”是用于获得有益的或期望的效果包括和优选临床效果的方法。有益的或临床的效果包括但不限于改进个体对胰岛素敏感的能力、降低胰岛素耐受、减轻高血糖症、改善个体的肥胖症。在一段时间内实施治疗计划，包括多种剂量、多次施用和/或不同的施用途径。总之，有效量的包含糖基化脂联素的组合物被施用来治疗。当显然存在正常循环浓度的脂联素时，脂联素治疗也是有效的，因此，存在正常脂联素水平不是脂联素治疗的禁忌征。
“生物样本”包括从个体中获得的各种样本类型，可用于诊断或监测分析。该定义包含血液或其他生物来源的液体样本、固体组织样本如活体解剖样本或组织培养物或由其衍生的细胞，和其后代。该定义还包括在获取之后以任何方式被处理的样本，如用药剂处理，稳定化，或富集某些成分，如蛋白质或多核苷酸。术语“生物样本”包括临床样本，还包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶解产物、血清、血浆、生物液体和组织样本。
本文所用术语“统计学上显著”、“统计学上显著差异”等等具有本领域的通常意义，是指偶然发生所观察的差异的概率(或当在测定“统计学上相似”的情况下，观察到不存在差异的概率)(p值)低于某个预先确定的水平，即p值＜0.05，优选＜0.01和更优选＜0.001。各种适合的统计方法是技术人员熟知的，可以用于测定统计显著性(如标准方差方法如学生t-检验{用于两个样本比较}、ANOVA{方差分析}和置信区间分析；软件如第8版本SAS系统(SAS System Version 8)(SASInstitute Inc.，卡里，新喀里多尼亚，美国(Cary，NC，USA))可用于分析)。
“个体”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于家畜、运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。
因此，本文所用术语“剂量形式”包括本领域熟知的适合于适合施用给哺乳动物特别是人的蛋白质的药物配制剂的任何合适的剂量形式，特别是(虽然不是唯一地)那些适合于在溶液中稳定施用给哺乳动物优选为人的治疗性蛋白的。所有这些无论脂联素是否是组合物形式。
一个例子是口服形式的片剂、胶囊、锭剂等形式、或任何液体形式如糖浆、水溶液、乳剂等，能够防止治疗性蛋白在产生作用之前降解，如果是口腔剂量形式，则防止在消化道中产生作用之前被降解。
用于经肤递送的剂量形式的例子包括经皮的贴片、经皮肤的绷带等。
包括在体表(topical)剂量形式中的是任何的洗液(lotion)、棒状物、喷雾剂、软膏、糊剂、乳油等。其直接或者通过媒介如衬垫、贴片等应用于皮肤。
用于栓剂递送的剂量形式的例子包括被插入到体孔中的任何固体或其他剂量形式(特别是被插入到直肠、阴道和尿道中的那些)。
用于转化粘液质的递送的剂量单位的例子包括沉淀剂，灌肠剂、阴道栓剂、塞子、乳油、凝胶、糊剂、泡沫，喷雾溶液、散剂和类似配制剂，其除了活性成分外还含有如本领域已知的合适的载体。
用于长效施用(depot administration)的剂量单位的例子包括活性剂的药丸或小的圆柱体或其中活性剂被夹塞在可生物降解的聚合物基质、微乳剂、脂质体中或被装入微胶囊中的固体形式。
可植入的输注装置的例子包括任何固体形式，其中活性剂被包被在或分散在可生物降解聚合物或合成聚合物如硅酮(silicone)、硅氧橡胶(silicone rubber)、硅橡胶(silastic)或类似聚合物中。
输注装置的可选剂量形式可以采用脂质体递送系统。
通过大丸剂递送的剂量单位例子包括单次或多次通过静脉注射、皮下、皮内下和肌内给药或口服。
用于吸入或吹入的剂量单位的例子包括包含溶液和/或药学上可接受的、水溶的或有机溶剂或其混合物中的悬浮液和/或粉末的组合物。
蛋白质的保守置换是用具有相似大小和电荷的氨基酸取代一个氨基酸。公知为等价的氨基酸组是(a)Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)Asn，Asp，Glu和Gln；(c)His，Arg和Lys；(d)Met，Glu，Ile和Val；和(e)Phe，Tyr和Trp。
III.脂联素和脂联素组合物本发明大体上涉及脂联素和脂联素组合物。令人惊奇地发现，存在多种脂联素同工型并具有不同的生物活性。本发明的脂联素和脂联素组合物是有用的，特别用于治疗的、诊断的、和其他的用途。在一个方面，本发明提供糖基化的脂联素多肽，其是重组的、分离的、纯化的或合成的。优选脂联素多肽是人脂联素。优选至少对应于人脂联素赖氨酸残基65、68、77和101(按照人的肽编号的残基)的赖氨酸残基之一被糖基化。
在另一个方面，本发明提供含有脂联素多肽的组合物，其中该脂联素多肽被糖基化。优选组合物的脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。更优选组合物的脂联素多肽是人脂联素。优选至少对应于人脂联素赖氨酸残基65、68、77和101(按照人的肽编号的残基)的赖氨酸残基之一被糖基化。
在另一个方面，本发明提供含有重组的、分离的、纯化的或合成的脂联素多肽的组合物，其中至少对应于人脂联素赖氨酸残基65、68、77和101(按照人的肽编号的残基)的赖氨酸残基之一被糖基化。
根据赖氨酸残基65、68、77和101上的糖基化(或缺少糖基化)相互区别的脂联素多肽有时在此称作为“糖基化同工型”。
A.脂联素多肽在此所用“脂联素多肽”可以是重组的、分离的、纯化的或合成的。在一个实施方案中，脂联素具有来自天然动物脂联素的序列，如哺乳动物、如人、非人的灵长类、小鼠、大鼠、狗或牛。见如图5。在另一个实施方案中，脂联素多肽是糖基化的成熟形式，没有加工前形式(pre-pro form)的信号序列。在另一个实施方案中，脂联素多肽通过天然脂联素蛋白的平截(天然的或重组的)和/或保守置换区别于天然脂联素。在一个实施方案中，脂联素具有与天然脂联素的序列如图5的序列基本上相似(即基本上相同)的序列。在一个实施方案中，这些平截的脂联素多肽和保守置换物基本上与天然脂联素同源，仍保留本文所公开的生物活性。在各种实施方案中，用于本发明的组合物中的脂联素多肽包括图5的脂联素的等位变体、差异剪接变体、可变性剪接变体和基本上与图5的脂联素同源的其他天然脂联素变体。其他有用的脂联素变体是全长脂联素的片段，如可以通过检测全长脂联素的一个或多个氨基酸残基的缺失或全长脂联素的平截来获得。脂联素的活性片段或部分可以从N末端或C末端或脂联素肽中通过逐步缺失氨基酸残基来确定。如果氨基酸被缺失而脂联素的生物活性基本上没有下降，则该氨基酸不包含活性片段部分。
可以通过本领域熟知的方法将脂联素的这种活性片段或部分与其他多肽融合来获得嵌合多肽。任何这种保持天然脂联素的生物活性的嵌合多肽也被认为是本发明的脂联素多肽。
脂联素的功能性变体可以通过其生物学功能表征，其中脂联素的功能性变体是能够产生与脂联素相同的生物反应的脂联素作用位点的激动剂。这种功能性变体被认为是在此定义的脂联素多肽。
同时在此特别提及由糖或糖的混合物的糖基化，或更特别提及各种实例如葡糖基半乳糖基(glucosylglactosyl)部分，该术语在其范围内包括糖基化部分的任何扩展和变化，其产生与特别指出的糖基化类似的生物活性。
同时在此特别提及羟基化，该术语包括羟基化部分的任何扩展和变化，包括产生与特别指出的羟基化类似的生物活性的其他修饰。
同时在此特别提及羟基脯氨酸，该术语在其范围内包括任何氨基酸，包括产生与特别指出的氨基酸类似的生物活性的被修饰氨基酸。
脂联素制剂可以以适合于施用给人的方式配制，优选为通过如皮下的(s.c.)、真皮内的(i.d.)、静脉内的(i.v.)、腹膜内的(i.p.)或经皮的路径肠胃外施用的方式。其他的制剂也是可预期的，其中所述脂联素通过口腔、直肠、阴道、膀胱内、鞘内、心室内、脑内或其他本领域技术人员知晓的路径被施用。
优选的给药路径是肠胃外。适合于肠胃外给药的脂联素被配制在含有稳定用缓冲剂的水溶液中，优选为或接近等渗强度，和具有适当的防腐剂、防沫剂、抗沉淀剂和其他本领域技术人员已知的稳定剂以适合于施用给哺乳动物特别是人的蛋白质的药物配制剂，特别是适合于在溶液中稳定施用给哺乳动物优选是人的治疗性蛋白质的那些。
在本发明的一个实施方案中，组合物含有在体外分析如在实施例中所示测定肝细胞对胰岛素的反应能力中具有可检测生物活性的脂联素多肽。在另一个实施方案中，脂联素多肽具有至少一种以下的生物活性增强胰岛素的作用，降低个体中胰岛素耐受，抑制糖原异生，减缓高血糖症或改善肥胖个体的健康状况。在各种实施方案中，本发明组合物的脂联素多肽的生物活性为具有图5所示序列的脂联素多肽的至少约50％和通常至少约95％，如图5的人脂联素多肽。
B.脂联素同工型在一个方面，本发明涉及含有一种和多种脂联素同工型的组合物。如本文所用脂联素“同工型”是基于pI和表观分子量相互区别的脂联素多肽同工型。不同同工型可以通过标准方法如电泳鉴定。如图1所示，从脂肪细胞中分离的脂联素存在至少8种不同的同工型，可以按照如图1和2所示的等电点(pI)和电泳迁移率(表观分子量)来定义。一些同工型被糖基化(如同工型3、4、5和6)，而其他的没有(如同工型1和2)。
C.脂联素的糖基同工型(glycoisoform)如下文所述，在哺乳动物细胞中制备的脂联素能够进行翻译后的修饰如糖基化。本发明人发现小鼠脂联素赖氨酸残基68、71、80和104以及相应的人脂联素赖氨酸残基65、68、77和101是糖基化的靶点。在一个方面，本发明提供含有人脂联素、来自非人物种的脂联素和在对应于人的脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的脂联素的组合物。可以预期，当涉及非人物种的脂联素、脂联素变体或区别于图5所示的人脂联素的平截脂联素时，脂联素的残基参照采用相应的人序列残基的编号，通过两条序列的最佳排列确定。图5显示不同动物的脂联素的序列排列。例如，在天然小鼠脂联素中，相应的赖氨酸残基是68、71、80和104。可以预期，当在一种物种(如人或小鼠)中讨论编号时，还用来指其他物种的同等编号。
在一个方面，本发明提供被糖基化的脂联素多肽，其是重组的、分离的、纯化的或合成的。在另一个实施方案中，脂联素多肽是人脂联素。在另一个实施方案中，至少对应于赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)的赖氨酸残基之一被糖基化。在一个实施方案中，脂联素完全被糖基化。“完全被糖基化”是指脂联素多肽上糖基化的状况，其中脂联素多肽中的所有赖氨酸残基被至少一种糖部分糖基化(如对应于赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)的全部4个赖氨酸残基被糖基化)。
赖氨酸残基上的糖基化是O-连接的，使得一个或多个糖部分被添加到每个赖氨酸残基上。在本发明的一个方面，被添加到赖氨酸残基上的糖部分是葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一个方面，脂联素多肽在每一个赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)上具有至少一种葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一个实施方案中，脂联素多肽在至少赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)之一或者全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有结构X1，其中每个X1独立地选自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分中的一种或多种。在一个实施方案中，脂联素多肽的所有赖氨酸全部被糖基化。
糖基化的脂联素多肽还可以通过其生物学作用表征。在一个实施方案中，糖基化的脂联素多肽施用给哺乳动物可用于治疗在此描述的与脂联素调控相关的疾病状态。在另一个实施方案中，如实施例中所描述，将糖基化的脂联素多肽施用给哺乳动物增强胰岛素的作用。在另一个实施方案中，糖基化的脂联素多肽施用给动物时抑制糖原异生。
在另一个方面，本发明提供包含脂联素多肽的组合物，其中脂联素多肽被糖基化。在一个实施方案中，脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。在另一个实施方案中，脂联素多肽是人脂联素。在另一个实施方案中，组合物被配制成含有或不含有其他药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等以适合于施用给哺乳动物患者。在另一个实施方案中，组合物还含有胰岛素。优选胰岛素的浓度或含量足以产生在约50pM到400pM之间的血液胰岛素浓度。优选胰岛素的浓度或含量足以有效地产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度。更优选胰岛素优选为足以有效地产生200pM的血液胰岛素浓度的浓度含量。
在另一个方面，本发明提供脂联素多肽的组合物，其中至少对应于赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)的赖氨酸残基之一被糖基化。在另一个实施方案中，脂联素完全被糖基化。“完全被糖基化”是指脂联素多肽的糖基化状态，其中脂联素多肽中的所有赖氨酸残基被至少一个糖部分糖基化。
赖氨酸残基的糖基化是O-连接的，使得一个或多个糖部分被添加到每个赖氨酸残基上。在本发明的一个方面，被添加到赖氨酸残基上的糖部分是葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一个方面，脂联素多肽在每一个赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)上具有至少一个葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。在另一个实施方案中，脂联素多肽在至少一个赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)上或者全部Lys-68、71、80和104(小鼠)或Lys-65、68、77和101(人)上具有结构X1，其中每个X1独立地选自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分中的一种或多种。在一个实施方案中，脂联素多肽中的所有赖氨酸全部被糖基化。在还有一个实施方案中，脂联素选自脂联素同工型3、4、5或6中的任何一种。
糖基化的脂联素多肽的组合物还可以通过其生物作用表征。在一个实施方案中，如实施例中所描述将组合物施用给哺乳动物增强胰岛素的作用。在另一个实施方案中，糖基化脂联素多肽的组合物施用给动物时抑制糖原异生。
在一个方面，本发明提供脂联素的组合物，其基本上不含有至少一种非糖基化的脂联素同工型。在一个方面，组合物基本上不含有同工型1和/或同工型2。在另一个方面，组合物基本上不含有任何非糖基化的脂联素同工型。当该同工型少于组合物中脂联素蛋白重量的约20％，优选少于10％，优选少于5％，最优选少于1％或0.1％时，在此所用的组合物“基本上不含有”同工型。用于获得这种组合物的方法包括在实施例中公开的方法以及在蛋白质纯化和层析分析领域已知的方法。
在还有另一个方面，本发明提供含有脂联素的组合物，其中仅仅或主要的脂联素种类被完全糖基化。在一个实施方案中，组合物含有超过一种的脂联素同工型和/或超过一种的糖基化状态的脂联素。组合物可以是同工型3、4、5或6中的任何一种是组合物中的主要脂联素。在本文中，“主要”是指组合物中至少约50％的脂联素多肽是特定糖基化状态或特定同工型，优选至少约60％，优选至少约70％，优选至少约80％，优选至少约90％，优选至少约95％和优选至少约98％糖基化的脂联素多肽。
糖基化的脂联素多肽的组合物还可以通过其生物作用表征。在一个实施方案中，如实施例中所描述将组合物施用给哺乳动物增强胰岛素的作用。在另一个实施方案中，糖基化脂联素多肽的组合物被施用给动物时抑制糖原异生。
D.获得糖基化脂联素的方法多种方法可以用于获得本发明的组合物。可以预期，脂联素多肽可以通过重组或合成的方法制备，或从天然来源中分离或纯化。
在一个实施方案中，通过重组方法制备一种或多种脂联素同工型或糖基化同工型。可以通过将编码蛋白的多核苷酸(通常为DNA)序列插入到表达载体中并且在合适的宿主中表达该肽来重组制备脂联素。编码期望的多肽的多核苷酸，无论是融合或成熟形式，以及无论是否含有允许分泌的信号序列，被连接到适合于任何适当宿主的表达载体上。虽然由于真核细胞能够进行翻译后的修饰如糖基化而推荐采用真核表达系统，但是也可以采用任何本领域普通技术人员知晓的各种表达载体。可以在任何合适的宿主细胞中实现表达，该宿主细胞已经用含有编码重组肽的DNA的表达载体转化或转染。真核宿主细胞的例子是本领域已知的，包括酵母、鸟类、昆虫、植物和动物细胞如COS7、Hela、CHO及其它的哺乳动物细胞。重组生产的标准技术被描述如在上文的Sambrook中。可以通过在哺乳动物细胞中表达编码脂联素或具有任何在图5中描述的动物(如人、小鼠等)的序列的多肽或其生物活性片段或其变体的重组多核苷酸来获得脂联素。
在另一个实施方案中，脂联素(包括同工型和糖基化同工型的混合物)还可以从动物组织如但不限于血清或脂肪细胞中纯化。用于从脂肪细胞中纯化脂联素的方法在本领域是公知的，在实施例中被进一步描述。从中可以获得糖基化脂联素的组合物的动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、狗、牛和非人的灵长类。
重组得到或者从动物组织中获得的脂联素可以采用常规方法如在实施例中描述的电泳或层析分析，根据分子量、pI和/或脂联素多肽中的糖基化含量进行分离。在本发明的一个方面，如上描述，含有脂联素特定同工型或糖基化同工型的脂联素组合物可以通过差别纯化来制备。例如，按照本发明的方法，这包括获得含有至少两种区别于糖基化程度或类型的脂联素形式的第一组合物，然后根据糖基化的程度或类型来分离脂联素形式。这种方法制备在脂联素模式上区别于第一组合物的第二组合物。
可以通过蛋白质纯化领域一些已知的方法从其他多肽中分离糖基化的脂联素多肽。在一个实施方案中，采用双向电泳进行分离，接着从凝胶中切除和洗脱蛋白质。在另一个实施方案中，采用基于电荷选择的亲和柱进行分离。在另一个实施方案中，采用负载了凝集素的亲和柱进行分离。在另一个实施方案中，采用选择性蛋白纯化方法，如免疫亲和柱、大小排阻柱、凝集素亲和、疏水作用、反相、阴离子和阳离子交换层析等(见通常R.Scopes，蛋白质纯化(Protein Purification)，Springer-Verlag，纽约(1982)和Deutscher，酶学中的方法(Methods inEnzymology)第182卷蛋白质纯化指南，学院公司，纽约(1990)(Guideto Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.))。
在一个实施方案中，主要含有糖基化的脂联素多肽的组合物通过使用凝集素柱与糖基化脂联素多肽结合来获得，例如，伴刀豆球蛋白A或麦胚凝集素柱。非糖基化的脂联素将不会与该柱结合，从而流过该柱。然后从该柱上洗脱糖基化的脂联素多肽来获得主要含有糖基化的脂联素多肽的组合物。
在另一个实施方案中，各种同工型和/或糖基化同工型通过以下方法对重组获得的或从动物组织得到的脂联素进行双向凝胶，通过用抗体鉴定糖基化种(如实施例所示)，切除糖基化的脂联素同工型的斑点(spot)或条带(band)，从条带上洗脱糖基化的脂联素同工型来获得基本纯的一种糖基化脂联素同工型的组合物。可以预期，本发明的组合物可以通过如上描述的常规技术制备，包括分离和再结合特异性同工型和/或糖基化同工型来准备期望的实施方案。
IV.方法A.监测表达可以监测脂联素同工型和糖基化同工型的表达。在本发明的一个方面，监测和测定表达来诊断个体的疾病状态或发生与脂联素调控相关的疾病状态的可能性。在各种实施方案中，疾病状态是高血糖症，胰岛素耐受，与胰岛素耐受相关的代谢综合征，与胰岛素耐受相关的代谢综合征，2型糖尿病，代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、多囊卵巢综合征或其他与脂联素缺乏或肥胖相关的状态。脂联素可以从生物液体如血清或血液中获得，通过电泳、HLPC或质谱分析。通过任何本文公开的方法或本领域已知的方法(如双向电泳)监测表达模式。
可以通过监测特定脂联素同工型的水平，至少两种脂联素同工型或糖基化同工型的表达模式(expression profile)来进行监测。在一个实施方案中，个体中的水平或表达模式与参比模式比较，其中与参比模式(reference profile)比较的统计学上的显著相关诊断为一种症状。参比模式可以来自具有高血糖症，胰岛素耐受，与胰岛素耐受相关的代谢综合征，2型糖尿病，或肥胖的家族史的其他个体或者患有高血糖症，胰岛素耐受，与胰岛素耐受相关的代谢综合征，2型糖尿病，或肥胖症的个体。参比模式还可以来自一群根据其疾病史分组的个体，如患有高血糖症，胰岛素耐受，与胰岛素耐受相关的代谢综合征，2型糖尿病，或肥胖症。
某些糖基化脂联素同工型的表达水平或表达模式(expressionpattern)可用于统计分析来确定本文描述的特定脂联素相关疾病状态表达模式的水平范围或相关度。然后统计学上显著相关可用于确定与期望的(或不期望的)预后相关的糖基化脂联素同工型的水平或模式。然后可以确定来自生物样本(如患者样本)的糖基化脂联素同工型的表达水平或表达模式，并与参比水平和表达模式比较来预测临床结果。
在优选实施方案中，在监测方法中所用的任何一种或多种脂联素同工型是人脂联素。在另一个优选实施方案中，个体是人。
B.治疗方法和药物制备本发明还提供治疗个体中与脂联素调控相关的疾病状态。疾病状态包括但不限于高血糖症，胰岛素耐受，与胰岛素耐受相关的代谢综合征，2型糖尿病，代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、多囊卵巢综合征或其他与脂联素缺乏或肥胖相关的状态。
治疗方案通常包括给被治疗的个体施用有效量的糖基化脂联素的组合物。有效量可以通过评价生物活性来测定如在实施例中公开的胰岛素致敏作用。技术人员能够通过逐步提高剂量并在每一步评价生物功能来确定糖基化组合物的含量。
糖基化脂联素组合物可以在药学上接受的赋形剂中被施用。药学上可接受的赋形剂在本领域是已知的，是相对惰性的物质，便于药学上有效的物质的施用。在一些实施方案中，本发明的脂联素组合物被配制成通过注射施用(如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)。
因此，糖基化脂联素的组合物可以结合药学上可接受的载体如盐水，Ringer溶液，葡萄糖溶液等。特定的剂量方案，即剂量、时间选择和重复，将依赖于特定个体和该个体的病史。治疗可包括在一定时期内多次施用。可以采用常规临床测定包括但不限于葡萄糖水平、葡萄糖禁食检测和体外胰岛素致敏试验来评价治疗的生物功能。
还可以加入抑制细菌或抑制真菌浓度的抗菌剂以符合美国药典(United States Pharmacopeia)(USP)。这些试剂必须被加入到含有在多种剂量容器中的制剂中。在使用时，当内容物的一部分如被皮下注射器针头带走，还必须具有充足的浓度以防止无意间导入制剂的微生物的繁殖。
可以加入氯化钠或其他盐来调整组合物的张力(tonicity)，特别对于肠胃外的配方，应当是等渗的或基本上等渗的，否则在施用处会产生严重的刺激和疼痛。
可以预期，本发明还提供在此公开的联素组合物在制备药物组合物中的用途。
在还有一个方面，本发明在于糖基化脂联素多肽在制备剂量单位或药物组合物或药剂中的用途，剂量单位或药物组合物或药剂可在哺乳动物患者中用于治疗与脂联素调控相关的疾病状态，或用于增强胰岛素的作用，或用于抑制糖原异生。在一个实施方案中，脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。在另一个实施方案中，脂联素多肽是人脂联素。在另一个实施方案中，至少一个对应于赖氨酸残基68、71、80和104(小鼠)或残基65、68、77和101(人)的赖氨酸残基被糖基化。在另一个实施方案中，剂量单位或药物组合物或药剂还含有胰岛素。优选胰岛素的存在量足以产生在约50pM到400pM之间的血液胰岛素浓度。优选胰岛素的浓度或含量足以有效地产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度。更优选胰岛素存在量为足以有效地产生约200pM的血液胰岛素浓度。
本发明的肠胃外配方的适宜的给药路径包括肌内、静脉内、皮下、真皮的、关节内、鞘内等。皮下给药路径是优选的。也可以粘膜递送。
可以预期，本发明可以以组合物和/或配方被随同给药或连续施用和/或与胰岛素混合。这依赖于具体情况和患者。适宜的治疗方案可由医生或开业医生为每一位患者具体制定。多种胰岛素可以从许多公司获得，包括Eli Lilly & Company和Novo Nordisk。可以获得的胰岛素的种类为速效的、中等的和长效的胰岛素。在这些分类中还有各种类型胰岛素。本文定义的胰岛素与脂联素多肽之间的比例依赖于特定患者的个体需要。适宜的治疗方案可由医生或开业医生为每一位患者最佳地制定。
用于本发明的组合物通过按照常规接受的程序混合各成分来制备。例如，在搅拌机或其他标准装置中混合选定的组分来制备浓缩的混合物，然后通过加入水或增稠剂来调节到最终浓度和粘度，并可能加入缓冲剂来控制pH或其他溶质来控制张力。
C.筛选本发明的组合物还可以用于筛选与脂联素调控相关、一般来说与代谢相关的化合物。在一个实施方案中，将表达脂联素的哺乳动物细胞如培养的细胞与试验化合物接触，然后监测脂联素同工型的水平或表达模式的变化。在一个实施方案中，脂联素自然地被表达。在另一个实施方案中，脂联素被重组表达。在另一个实施方案中，通过在与试验化合物接触前量化脂联素同工型含量并将该含量与细胞与试验化合物接触后测定的含量比较来检测脂联素同工型水平的变化。在蛋白质化学领域蛋白质量化是公知的，可以通过如蛋白质印迹来实现。在另一个实施方案中，脂联素同工型可以采用检测蛋白质斑点和条带的相对水平的光密度计来量化。这种设备的例子为Molecular Dynamics的激光光密度计或Bio-Rad的GS-700。在另一个实施方案中，通过双向电泳来检测表达模式的变化。
试验化合物是各种常规种类，包括但不限于，多肽；糖如寡糖和多糖；多核苷酸；脂类或磷脂；脂肪酸；类固醇；或氨基酸类似物。试验化合物还可以是各种化学类型，包括但不限于，杂环化合物，碳环化合物，-内酰胺，聚氨基甲酸酯(polycarbamate)，寡聚-N-取代甘氨酸、苯并二氮杂，噻唑烷二酮(thiazolidinone)和咪二唑二啉二酮(imidizolidinone)。一些试验试剂是小分子，包括合成的有机化合物。试验试剂可以从文库中获得，如天然产物文库或组合文库。许多不同类型的组合文库和用于制备这种文库的方法已经被描述，包括如PCT公开WO93/06121、WO95/12608、WO95/35503、WO94/08051和WO95/30642。
在一个实施方案中，一种生物功能是脂联素致敏肝细胞对胰岛素作用的能力，其中如实施例中所描述，胰岛素对肝细胞的作用通过脂联素多肽来增强。由脂联素多肽引起的胰岛素对肝细胞作用的增强可以通过本领域技术人员公知的胰岛素活性检测来确定。一旦这种公知的检测确定胰岛素对细胞或细胞群的葡萄糖生成或糖原异生的作用。这种检测可被用于确定一种试剂对于加剧、增强或相反地减弱胰岛素的作用的能力。化合物被逐步分析来确定哪种化合物抑制或增强脂联素的活性。
提供下列实施例仅用于说明而不以任何方式限制本发明。
实施例实施例1试验方案材料-地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、α-氰-4-羟基肉桂酸(αCHC)、胶原酶、鼠尾胶原I型、氨基酸标准物、FLAG肽、抗-FLAG M2亲和凝胶和葡萄糖Trinder检测试剂盒购自Sigma。人胰岛素(Actrapid)得自Novo Nordisk。总的细胞RNA提取试剂(TRIZOL)、TEV蛋白酶、哺乳动物表达载体PCDNA3.1(+)和原核表达载体pPROEX HTb得自Invitrogen。QuikChange定点诱变试剂盒得自Stratagene。BCA蛋白检测试剂得自Pierce。用于糖蛋白探测的免疫印迹试剂盒来自Bio-Rad实验室。FuGENE6转染试剂、胰蛋白酶和ASP-N内切蛋白酶、和增强的化学发光(ECL)检测系统来自RocheMolecular Biochemicals。Ni-NTA琼脂糖柱得自QIAGEN。双向凝胶电泳的所有消耗品、3H-1-半乳糖和3H-1-葡萄糖是Amersham Pharmacia的产品。所有氨基酸分析试剂和质谱分析的Cal Mix2校准标准物来自Applied Biosystems。
3T3-L1细胞的分化和来自细胞培养物的蛋白的浓度——3T3-L1细胞以分会合培养维持在添加了10％胎牛血清的DMEM中。为了分化，细胞被植入150mm的平板，以达到100％会合，会合后1天用含有0.25μM地塞米松、0.5mM IBMX和10μg/ml胰岛素的上述培养物诱导2天。接着用10μg/ml胰岛素培养2天。然后细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中再维持4天。
为了获得从脂肪细胞中分泌的蛋白质，细胞在分化后第8天用PBS洗涤3次，然后用无血清的培养物再培养4hr。收集培养物，以3,000×g离心10min，通过0.20μm的滤器过滤，然后用有5000Da的MWCO的浓缩器(Vivascience Ltd，Gloucestershire，UK)浓缩和脱盐。然后用BCA试剂量化蛋白质，并在-80℃下储存直到使用。
双向凝胶电泳(2-DE)，免疫印迹和糖检测——由脂肪细胞或3T3L1前脂肪细胞(preadipocytes)分泌的蛋白质通过先前描述的2-DE[24]分离。分离的蛋白质用银或考马斯亮兰R250(CBB)染色。进行免疫印迹时，通过2-DE分离的蛋白质用Multiphor IINovablot电泳转移单位(Pharmacia)转移到硝化纤维素膜上。该膜被阻断，然后用兔抗-脂联素多克隆抗体(1∶1000)在4℃下温育过夜。在用辣根过氧化物酶共轭的第二抗体在室温下再温育一个小时后，用ECL检测试剂盒检测结合的抗体。糖蛋白用市购免疫印迹试剂盒按照生产商的指导检测。
凝胶内胰蛋白酶消化和反向高效液相层析(RP-HPLC)——通过SDS-PAGE或2-DE凝胶分离的目标蛋白质被切割，和凝胶碎片按照先前描述[25]进行凝胶内胰蛋白酶消化。提取的胰蛋白酶肽混合物通过RP HLPC在Jupiter 5μ C18柱上(250×2.00mm，Phenomenex)进行分馏。预热的柱(37℃)用0.1％三氟乙酸(v/v)洗涤7min，接着用50min从8％到36％乙腈的线性梯度以200μ/min的流速洗脱。手工收集每种馏分，进一步进行如下所述的分析。3H-标记的糖肽通过液体闪烁计数来检测。
氨基酸测序和氨基酸分析——通过2-DE分离的蛋白质斑点被转移到PVDF膜上，用CBB染色，切割，采用Edman降解方法用Perkin-Elmer(Procise，型号492)蛋白质测序仪进行氨基酸测序。在RP-HPLC分馏后，通过对胰蛋白酶肽测序来获得内部氨基酸序列。
对于氨基酸分析，5μg胰蛋白酶肽被真空干燥并用6N HCl、1％苯酚在110℃下气相中水解24hr。这种处理破坏糖残基但是仍然允许检测和量化羟基赖氨酸和羟基脯氨酸[26]。将游离氨基酸残基溶解在40μl的0.025％K3EDTA中，用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生，在Spheri-5PTC 5μ柱(220×2.1mm)上分离，和通过421氨基酸分析仪(AppliedBiosystems)分析。
基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laserdesorption ionization time of flight mass spectrometry)(MALDI-TOFMS)分析——0.5μl胰蛋白酶肽混合物或RP-HPLC分离的肽与等量的αCHC基质(10mg/ml溶在60％乙腈/0.3％TFA中)混合，在样本平板上打点并风干。在Voyager DE PRO Biospectrometry Workstation(Applied Biosystem)上用脉冲激光束(氮激光，？＝337nm)进行反射(Refelectron)质谱分析。在加速电压为20.0kV的正电模式(positivemode)中记录所有的离子光谱。分光计用Cal Mix 2标准物混合物外校准。
小鼠脂联素的克隆——用TRIZOL试剂按照生产商的指示从3T3-L1脂肪细胞中纯化总的RNA。来自总RNA的寡-dT-引物cDNA作为基于小鼠脂联素核苷酸序列(编号U37222)的PCR克隆的模板。然后脂联素的全长cDNA被插入到pGEMT-easy载体上，并通过DNA测序验证其序列。蛋白质序列从甲硫氨酸残基开始计数。
脂联素及其变体的重组表达和纯化——为了制备小鼠脂联素的原核表达质粒，用5’ATCGGGATCCGAAGATGACGTTACTACAACT3’作为正向引物(sense primer)和5’TACGAATTCTCAGTTGGTATCATGGTAGAG3’作为反向引物(antisense primer)来扩增DNA序列。扩增的DNA产物的BamH I/Sal I片段被亚克隆到pPROEX HTb质粒上，得到编码其N末端具有6×His标记的全长脂联素的表达载体pPRO-His-Ad。除了正向引物为5’ATCGGGATCCGCCGCTTATATGTATCGCTC3’，类似的策略用于构建原核表达载体pPRO-His-gAd，其表达6×His标记的脂联素的球形区(在110和247之间的氨基酸残基)。His标记的全长脂联素或其球形区在BL21细胞中表达，通过往生长培养物中加入1mM异丙基β-硫代吡喃型半乳糖苷来诱导。采用Ni-NTA琼脂糖柱按照生产商的说明从细菌溶解产物中纯化全长脂联素或其球形区。纯化后，用重组TEV蛋白酶裂解除去N末端标记。通过SDS-PAGE和HPLC进行蛋白质的纯化。
采用5’GCCCGCGGATCCATGCTACTGTTGCAAGCTCT3’作为正向引物和5’GGCCGCGAATTCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTTGGTATCATGGTAGAG3’作为反向引物扩增cDNA来生成用于哺乳动物的脂联素的表达的载体。在BamH I/EcoR I消化之后，该片段被插入到pcDNA3.1载体中来生成pcDNA-Ad-F，其编码在其C末端标记FLAG表位的全长脂联素。然后采用QuikChange定点诱变试剂盒，该表达载体被用作模板来构建编码脂联素变体的载体，变体中的四个赖氨酸(68，71，80和104)被精氨酸取代。按照生产商推荐的标准设计诱变的寡核苷酸引物，密码子由AAG变为CGG(对于68和80)或由AAA变为CGA(对于71和104)。编码FLAG标记的全部四个赖氨酸被精氨酸取代的脂联素变体的质粒(称作为pcDNA-Ad(K→R)-F)，通过各个位点顺序突变来获得，所有突变通过DNA测序确定。
用FuGENE6转染试剂将这些哺乳动物的表达载体转染给COS-7细胞或HEK-293细胞，细胞往无血清培养物中分泌脂联素48hr。然后收集培养物，通过在3,000×g离心10min，接着用0.2μm的滤器过滤来去除细胞碎片。加入40％硫酸铵并在4℃下搅拌过夜来沉淀蛋白质。再以8,000×g离心1hr后，将沉淀再悬浮在TBS中，采用MWCO为7000Da的SnakeSkin管对相同的缓冲剂透析。用抗-FLAG M2亲和凝胶纯化FLAG标记的脂联素，用150μg/ml的FLAG肽洗脱抗体制备——从大肠杆菌中制备的His标记的重组脂联素与Freund完全佐剂混合，然后腹膜内注射给雌性Wistar大鼠(50μg/鼠)或者皮下注射给雌性新西兰兔(100μg/鼠)。用等量的与Freund不完全佐剂混合的蛋白强化动物两次，并在最后一次强化的1周后收集血液。
分离初级大鼠肝细胞和测定肝脏葡萄糖生成——如先前描述[27]，采用两步胶原酶灌流方法从雄性Wistar大鼠(200g)中制备初级肝细胞。分离后，细胞在具有10％胎牛血清、10mM HEPES(pH7.4)、2mML-谷氨酰胺、100nM地塞米松和1mM胰岛素的DMEM中洗涤3次。在每次洗涤之间在200g离心细胞2min。通过台盼蓝(trypan blue)排除(exclusion)评估，经过这些操作后细胞生存力一般超过80％。细胞以0.5百万细胞/孔被加载到上述培养物中的抗原I型覆盖的12孔平板上。使细胞附着细胞培养皿24hr，然后在具有5.5mM葡萄糖和无胰岛素或地塞米松的DMEM中温育过夜。接着，再用不同浓度胰岛素或/和脂联素刺激24hr。然后培养物用0.5ml无葡萄糖和酚红、添加了5mM的丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙酮酸和乳酸中的每一种的DMEM替换。温育6hr后，用葡萄糖Trinder检测试剂盒测定培养物中的葡萄糖水平。
动物和食物——按照人道对待试验动物的公共规定，重25-30g的雄性FVB/N小鼠饲养在金属丝底网的不锈钢鼠笼中，处于12小时光照/黑暗循环中。给小鼠饲喂改进的高脂肪/低碳水化合物的液体食物21，含有44％脂肪、16％蛋白质、5.5％碳水化合物，加上34.5％乙醇或等热量的麦芽糖糊精作为对照。在第一周饲喂期间，乙醇浓度从17％到34％逐步增加，然后在另外5周保持在相同浓度。
测定血浆脂联素、TNF-α和ALT水平——采用兔多克隆抗体抗脂联素19，用内部RIA(in-house RNA)测定血清脂联素水平。用市售的ELISA试剂盒(Chemico)量化循环TNF-α。用购自Sigma的剂测定血清ALT活性。
RNA提取和RNA印迹——用Trizol试剂(Invitrogen)从肝脏组织中提取总RNA。20μg来自各个样本的总RNA用变性琼脂糖凝胶分离，转移到尼龙膜上，分别用编码小鼠TNF-α、FAS或CD36的33P标记的cDNA片段探查。这些cDNA片段用特异性引物通过PCR扩增来源于小鼠肝脏组织的cDNA来获得。各个基因的相对mRNA丰度用磷光成像仪量化。
组织分析——肝脏样本在缓冲的甲醛(10％)中固定过夜并包埋在石蜡中。苏木精-cosin染色的切片根据脂肪变化、炎症和坏死的程度随机分级。检查每个肝脏的10个功能低下的区域。脂类浸润程度分为0-4级，0级表示无脂肪存在，4表示≥75％的细胞含有脂肪。
统计分析——通常以每组5-6只小鼠进行试验，数值表示为平均数±SE。以所示的代表性的数据重复所有的试验。通过单向(one-way)ANOVA确定统计学显著性。在所有统计比较中，P值＜0.05表示显著差异。
实施例2脂肪细胞分泌的脂联素以多种同工型存在2-DE分析确定8个蛋白质斑点，它们优先地由脂肪细胞表达和分泌，而不是来自未分化的3T3-L1前脂肪细胞(图1，A和B)。为了鉴定这些蛋白质的性质，500μg从脂肪细胞收集的分泌性蛋白通过制备型2-DE分离，涂点到PVDF膜上，用考马斯亮兰染色。N末端氨基酸测序表明所有这些蛋白质(斑点1-8)具有相同的N末端序列(EDDVTTTE)，该序列显然与脂肪细胞专一地表达的分泌性蛋白质，即小鼠脂联素的18到25之间的氨基酸残基匹配[5，7]。该序列片段(EDDVTTTE)紧连在假定的信号肽裂解位点之后，表明脂联素的异源同工型不是在其分泌过程中由不同蛋白酶裂解产生的。将这些蛋白质鉴定为脂联素进一步通过蛋白质印迹分析来证实，这表明所有8种蛋白质与抗小鼠脂联素的抗体发生免疫反应(图1，组C)。2-DE分离大肠杆菌生产的重组脂联素，仅检测到一个斑点(数据未显示)，表明存在多种由脂肪细胞生成的脂联素同工型是由于在分泌过程中发生的翻译后修饰。2-DE分析由COS-7和HEK-293细胞瞬时表达和分泌的重组脂联素，也观察到这种蛋白质的多种同工型，与来自脂肪细胞那些的模式相似(数据未显示)。
由2-DE分离的蛋白质的糖检测表明6种来源于脂肪细胞的脂联素同工型(斑点3-8)被糖基化(图2)，而由大肠杆菌生产的脂联素没有检测到糖类(数据未显示)，表明糖基化至少部分地赋予了脂联素的异质性。虽然存在两个共有的N连接糖基化位点(Asn53和233)，用N-连糖基化的抑制剂衣霉素[28]处理不影响糖基化的模式(数据未显示)，从而排除了脂联素上N-连糖基化的可能性。先前采用内H处理的研究也表明在脂联素上没有发生N-糖基化[5]。采用NetOGlyc 2.0预测服务器(2.0 prediction server)[29]，其产生哺乳动物蛋白质中的粘蛋白O-糖基化位点的中性网络预测，不存在预期被O-糖基化的潜在丝氨酸和苏氨酸残基。
实施例3脂联素糖基化发生在胶原域的多个保守赖氨酸残基上为了进一步表征糖基化的性质和绘制脂联素的糖基化位点，来源于脂肪细胞或瞬时转染的COS-7细胞或来自大肠杆菌的各种脂联素同工型的胰蛋白酶肽混合物通过MALDI-TOF MS分析。这些样本的质谱光谱比较检测到三种主要的肽片段(分别具有1679Da、4260Da和4276Da分子量)，其仅存在于六种糖基化的同工型中，而不存在于两种未糖基化的同工型或大肠杆菌生产的脂联素中(图3)。而且，这三种胰蛋白酶肽片段的分子量不能与任何脂联素的未被修饰的胰蛋白酶片段匹配，表明在这三种片段中可能发生脂联素的糖基化。
为了分离这三种肽片段，收集来自所有糖基化的同工型的胰蛋白酶肽混合物，用RP-HPLC分离，每一个馏分用MALDI-TOF MS分析(图4)。这种分析表明用16.4％乙腈洗脱的馏分A含有分子量为1679Da的肽。在馏分B和馏分C中检测到分子量为4276Da和4260Da的肽，馏分B和馏分C分别用18％和18.4％乙腈洗脱。氨基酸序列分析鉴定分子量为1679Da的肽为KGEPGEAAYVYR，该片段对应于小鼠脂联素的104和115之间的氨基酸残基。具有分子量为4260Da和4276Da的肽来源于相同的片段(DGTPGEKGEKGDAGLLGPKGETGDVGMTGAEGPR)，该片段与脂联素的62和95之间的氨基酸残基匹配。特别地，氨基酸序列分析容易检测这三种肽片段中的所有氨基酸残基，除了四个赖氨酸残基(分子量为1679Da的肽中的赖氨酸104和分子量分别为4260和4276的肽中的赖氨酸68、71和80)。这些结果表明这些赖氨酸残基可能被亲水基团如糖类修饰，亲水氨基酸衍生物不能通过常规液相测序在非极性溶剂有效地被提取。这四个赖氨酸残基抵抗被特异性地在精氨酸或赖氨酸的C末端裂解的蛋白酶，即胰蛋白酶消化，该观察结果进一步支持这四种赖氨酸残基被修饰的结论。有意思的是，所有这四个赖氨酸(Lys68，71，80和104)位于脂联素的胶原域内，具有GXKGE(D)的周边序列。序列排列表明这四个赖氨酸及其周边序列在所有脂联素种类中都非常保守(图5)。
为了证实这四个赖氨酸被修饰，如上纯化的三种肽在用6N HCl在110℃下水解24hr后，进一步进行氨基酸分析。这些结果表明虽然所有其他氨基酸残基以预期的摩尔比被检测到，但是在预期的位置上不存在赖氨酸残基，(图6)。进一步分析这些光谱，表明这三种肽上的所有赖氨酸残基都被羟基化。在肽B中也检测到羟基化的脯氨酸残基。该羟基脯氨酸接着被指定为Pro94(见如下描述)。
由于羟基化和接着糖基化羟基赖氨酸来形成α-1，2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸(GG-Hyl)已经在多种具有胶原样域的分泌性蛋白中被描述[30，31]，因此，申请推测相同类型的修饰可能发生在上述分离的三种胰蛋白酶肽中的四个赖氨酸(Lys68，71，80和104)上。通过分析这三种肽的MALDI-TOF MS数据，支持了这种推测(图4)。对于肽A，试验观察到的分子量(1679)及其理论分子量(1339)之间的差别为340Da，这正好与葡糖基半乳糖基羟基(GG-Hyl)的分子量相同。肽C的试验观察到的分子量与其预期分子量相差1020Da，这是可能结合到肽C中的三个赖氨酸残基(68，71和80)上的三个GG-Hyl基团的预期分子量。肽B(4276Da)的试验观察到的分子量与其预期分子量相差1036Da，是三个GG-Hyl基团加上图6中检测的羟基基团的预期大小。
用特异地裂解天冬酰胺的N末端的内切蛋白酶Asp-N消化肽B和C，进一步证实肽B和肽C中的每个赖氨酸具有340Da的附着糖苷基的假设。MALDI-TOF分析表明含有Lys80的片段的试验观察到的分子量比其理论分子量大340Da，而含有Lys68和71的片段的实际分子量与其理论分子量相差680Da(图7)。这些结果也表明在肽B中，额外的羟基化发生在脯氨酸94上。还通过氨基酸分析和氨基酸测序证实脯氨酸94的羟基化。
为了进一步证实附着到四个赖氨酸残基的糖苷是葡糖基半乳糖基基团，用3H-半乳糖或3H-葡萄糖放射性标记COS-7细胞瞬时表达的FLAG-标记的脂联素。从这些细胞培养物中纯化的放射性标记脂联素的胰蛋白酶混合物通过RP-HPLC分馏来分离图4中的肽A、B和C。液体闪烁计数表明3H-半乳糖或3H-葡萄糖都结合到这三种肽上(图8)。
实施例5脂联素胶原域的四个赖氨酸(68、71、80和104)的取代降低其胰岛素致敏活性为了探讨四个羟基化赖氨酸的糖基化是否影响脂联素的生物活性，制备编码脂联素变体的构建物(pcDNA-Ad(K→R)-F)，其中该变体中的四个赖氨酸被精氨酸取代。用35S甲硫氨酸脉冲追踪标记被转染的细胞，表明脂联素变体(K→R)以与野生型脂联素相似的速度被分泌到细胞培养物中(数据未显示)，说明对胶原域的四个赖氨酸的修饰对于其分泌不是必须。SDS-PAGE分析表明从COS-7细胞分泌的野生型脂联素以三个稍微不同的分子量的条带移动(图9)。上面两个条带占总脂联素的～85％，它们被糖基化。相反，脂联素变体(K→R)主要构成单个未被糖基化的条带，它比野生型脂联素的两个主要糖基化条带移动得稍微快些。这些结果进一步证实脂联素的糖基化主要地发生在胶原域的四个赖氨酸残基上。
最近的研究已经证明脂联素能够在初级大鼠肝细胞中增强胰岛素抑制葡萄糖生成的作用[9]。与该报道一致，本发明的结果表明浓度为50pM的胰岛素不能显著地影响初级大鼠肝细胞中葡萄糖的生成(图10)。在200pM的浓度下观察到半数最大抑制。由哺乳动物细胞生成的脂联素显著地增强亚生理浓度的胰岛素抑制肝葡萄糖生成的能力。存在20μg/ml脂联素时，50pM胰岛素使葡萄糖生成显著地降低～40％。浓度依赖研究表明脂联素的EC50为～4μg/ml，该浓度在脂联素的生理范围内[15，16]。与野生型脂联素比较，脂联素变体(K→R)对肝糖原异生的胰岛素致敏能力显著地减弱。存在4μg/ml脂联素变体时，50pM胰岛素对葡萄糖生成不具有显著作用，存在20μg/ml这种蛋白时，仅导致下降～13％。细菌产生的全长脂联素(图10)和球形区对提高胰岛素抑制糖原异生的肝脏作用不具有生物效果。
实施例6脂联素的体内生物学功效采用酒精诱导的肝脏损伤的小鼠模型来评价如本文所述分离的脂联素被施用给哺乳动物时的效果。
长期摄食乙醇导致小鼠中循环脂联素的显著下降。
饲喂改进的高脂肪液体-对照(HF/LC)食物和高脂肪液体乙醇(HF/LE)食物的小鼠32，在6周的处理时期内体重增加。虽然HF/LC小鼠的体重增加(7.2±0.6g)稍微大些，其与食用HF/LE食物的小鼠的体重增加(6.8±0.5g)没有显著差异。饲喂LE食物的小鼠消耗约17-19g/kg体重/天的乙醇。尸检时，摄食乙醇的小鼠的肝与体重比(8.3±0.6％)显著高于饲喂对照食物的小鼠(6.2±0.4％)(p＜0.05)。
长期摄食乙醇导致脂联素的循环浓度显著下降。血浆脂联素在饲喂HF/LE食物后，三周后下降32.1±2.9％，四周后下降40.3±4.6％(图11A)。脂联素下降与肝脏损伤进展密切相关，这通过血浆水平的丙氨酸转氨霉(ALT)活性来判断(图11B)。本发明人观察到，在长期摄食HF/LE食物后，脂联素循环浓度与TNF-α水平之间成反比(图11C)。特别地，已经证明用TNF-α培养脂肪细胞引起3T3L1脂肪细胞中脂联素表达的显著下降33。因此，酒精性肝脏损伤早期的TNF-α生成至少部分地引起酒精性肝脏损伤的发病过程中的脂联素生成下降。
为了探讨脂联素对酒精诱导的肝脏损伤的作用，如在别处所描述34，从用编码FLAG表位标记的小鼠脂联素的载体瞬时转染的HEK293细胞表达和纯化全长的重组脂联素。在饲喂HF/LE食物后三周，给小鼠手术植入渗透泵(Alzet，Newark，DE)，该泵递送30μg/天的重组脂联素或生理盐水(对照)。以该剂量递送脂联素使脂联素的循环浓度比未处理的LE小鼠增加2.7±0.3倍。脂联素处理不会显著影响食物摄取、脂肪组织量或体重增加。但是，持续施用脂联素两周会显著地降低肝脏与体重的比(图12A)。它还显著地降低乙醇诱导的血清ALT活性的升高(图12B)。
肝脏样本的组织评价证实了在仅饲喂HF/LE的小鼠中存在大规模的全腺泡(panlobular)微泡和大泡脂肪变性和炎症临时病灶(occasionalfoci)(图13)。施用脂联素显著地将脂类累积降低到自然背景值，极大地消除炎症(通过在显微镜观察炎症病灶的消失来判断)。因此，本发明结果证明了脂联素在小鼠的酒精诱导的肝脏损伤中的保护作用。
施用脂联素抑制肝脏中TNFα的生成和脂肪酸合酶以及脂肪酸转运蛋白CD36的表达。
本发明人认为(不受假设的约束)肝脏组织中Kupffer细胞的TNFα生成的增加是早期酒精诱导的肝脏损伤的关键介质35。本发明人假设所试验的是脂联素可能部分地通过抑制酒精诱导的TNF-α生成的增加来减轻酒精诱导的肝脏损伤。在验证该假设中，用重组脂联素处理HF/LE小鼠阻断了肝脏中酒精诱导的循环TNF-α的升高以及这种细胞因子的mRNA的生成(图14)。
不受理论的约束，本发明人认为除了抑制TNF-α生成，脂联素可直接对抗肝脏组织中TNF-α的破坏作用。脂联素和TNF-α产生许多相反效果。TNF-α是胰岛素耐受的诱因而脂联素提高胰岛素灵敏性36。脂联素具有抗动脉粥样化的活性37，38，而TNF-α导致抗动脉粥样硬化形成(atherosclerosis)的起始39。最近，在肌肉细胞中证实这两种激素之间的拮抗作用，它们在葡萄糖和脂类代谢调控中相互抑制彼此的作用40。在肝组织中，TNF-α已经被证实降低胰岛素灵敏性和提高糖原异生，而脂联素具有完全相反的功能9。
酒精通过抑制线粒体脂肪酸β-氧化或者通过增强肝脏脂肪生成路径，诱导肝脏的脂类浸润。乙醇氧化提高NADH/NAD+比，其随即抑制线粒体β-氧化中需要NAD+的步骤41。此外，在人和啮齿类中，长期摄食乙醇会通过诱导脂肪生成路径中关键酶的表达，增加脂肪酸合成42，43。接着，本发明人通过干扰任何这些过程，探讨脂联素是否抑制肝脏脂类累积。与先前报道41一致，长期摄食HF/LE食物引起肝的NADH/NAD+比的显著提高，还显著地提高脂肪酸合酶(FAS)mRNA的丰度(图14)。脂联素处理对NADH/NAD+比升高不起作用，但是显著地降低FAS mRNA的表达(图14)。而且，用脂联素处理后，脂肪酸转运蛋白CD36的表达被显著地抑制。
应当指出，脂联素的其他代谢作用也对抑制酒精诱导的肝脏脂肪累积起作用。例如，已经证明体内施用平截的COOH封端的脂联素球形区片段能够增强清除循环的游离脂肪酸和甘油三酯4，这接着减少汇流进入肝脏的脂肪酸来源。虽然不作用于酒精损伤后的NADH/NAD+比的升高，但是脂联素可能通过其他机制直接增加肝脏线粒体β-氧化。事实上，较近的研究已经证明了全长的脂联素能够激活大鼠脂肪细胞中的5’-AMP-活化激酶，其接着将磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(ACC)并减弱这种酶的活性30。肝脏细胞中ACC失活将导致其产物丙二酸单酰辅酶A的浓度降低，从而在该组织中诱导脂肪酸β-氧化31。这些结果共同地说明脂联素通过调控多种协同代谢路径，消除酒精诱导的脂肪肝(图15)。
脂联素消耗大量肝脂肪累积的显著作用与脂联素缺乏与胰岛素耐受的患者中的肝脂类累积密切相关是一致的44。特别地，在四氯化碳处理的小鼠的肝脏中，发现大量脂联素累积并结合到与肝细胞邻近的细胞外基质上45，表明这种激素还作为参与CCl4-诱导的肝脏损伤的修复过程的抗炎因子。
因此，除了其抗糖尿病和抗动脉粥样化形成功能外1，脂联素或其激动剂是用于治疗肝脏疾病的新试剂。
实施例7讨论虽然一些最新报道都独立地证明了脂联素抗糖尿病的作用，但是对于哪种形式的脂联素有功能活性仍存在争议。Lodish小组和Kadowaki小组的研究发现对应于脂联素球形域的平截片段对于降低高血糖症和恢复胰岛素耐受是有效的，而细菌生产的全长脂联素不具有活性[10，11]。虽然这些发现的确具有药学意义，但是生理相关性仍不清楚。血浆脂联素主要部分以具有表观分子量为30kDa的全长蛋白形式存在[5，6]。采用免疫沉淀法和蛋白质印迹分析由2-DE分离的蛋白，不能在人和小鼠血清中检测到任何脂联素的蛋白水解片段(数据未显示)。而且，氨基末端序列分析表明由脂肪细胞分泌的所有主要脂联素同工型具有相同的N末端(图1)，说明该蛋白不是在其分泌过程中被细胞内裂解。虽然Lodish及其同事提出了25kDa的模糊条带，该试验在免疫沉淀法和蛋白质印迹分析中采用相同抗体，这还可视化具有～25kDa的MW的抗体轻链。重要的是，在Lodish和Kadowaki小组采用的用于功能分析的脂联素都是从细菌中产生的，细菌中通常缺少进行各种分泌性蛋白的生物学功能所需的适当的翻译后修饰。
与这些报道相反，Scherer及其同事证实从哺乳动物细胞中生产从全长脂联素实际上降低多种糖尿病动物模型的高血糖症，而来自大肠杆菌的全长脂联素或其球形区不具有这种活性[9]。该研究还提供表明肝细胞是脂联素可能的生理学靶点之一的证据。与该报道一致，本发明人证明在增强亚生理浓度胰岛素抑制初级大鼠肝细胞中的葡萄糖生成中，由哺乳动物细胞生产的全长脂联素比细菌生产的脂联素更有效(图10)。这些观察结果表明至少对于其作为与肝脏作用相关的胰岛素致敏剂的作用，脂联素的翻译后修饰在功能上是重要的。
本发明的2-DE分析表明，由脂肪细胞分泌的脂联素被专一地修饰成具有不同pI和MW的多种同工型，其异源性至少部分地通过糖基化来解释(图1和图2)。未被糖基化的和糖基化的同工型之间的质谱光谱比较可以确定胶原域内的四个赖氨酸(68、71、80和104)是可能的糖基化位点(图3)。这四个赖氨酸被糖基化的结论进一步得到如下证据的支持。第一，这四个赖氨酸不能被测序，并且还抵抗胰蛋白酶的裂解，表明它们可能被修饰。第二，氨基酸分析表明所有这四个赖氨酸被羟基化(图6)。第三，在用精氨酸取代这四个赖氨酸后(图9)，或者用羟化酶抑制剂α，α’-双吡啶处理后(未公开的观察值)，脂联素的糖基化大基本下降。特别地，在所有六种主要的糖基化同工型上检测到这四个位点上的羟基赖氨酰糖基化，这些同工型占从脂肪细胞分泌的总脂联素的85％以上，说明这种糖基化是脂联素上发生的主要的翻译后修饰之一。有意义的是，所有这四个赖氨酸残基都位于共同序列GXKGE(D)中，其在迄今鉴定的所有脂联素种类中非常保守(图5)。
赖氨酸羟基化和接着用半乳糖和葡萄糖糖基化来形成葡糖基半乳糖基羟基赖氨酸(GlcGalHyl-Lys)已经在许多具有胶原样域的分泌性蛋白中被观察到，包括补体成分Clq和肺部表面活性蛋白[30]。当前这种修饰的功能相关性还是未知的。本发明人已经获得了表明附着到这四个赖氨酸上的糖苷可能是葡糖基半乳糖基基团的证据。质谱分析表明赖氨酸80和104上的糖苷基团的分子量为340Da，为GlcGalHyl残基的预期大小(图7)。放射性标记试验也表明糖苷含有3H-半乳糖和3H-葡萄糖(图8)。
这四个羟基化赖氨酸上糖基化的生理学重要性通过用脂联素变体(K→R)的功能分析来说明，它表明用精氨酸取代这些赖氨酸显著地减弱亚生理浓度的脂联素增强胰岛素抑制葡萄糖生成的肝脏作用的能力(图10)。这些结果还证实了胶原域还与脂联素的胰岛素致敏功能相关。糖苷附着到胶原域中的这四个赖氨酸残基上增强脂联素的胰岛素致敏作用的机制还有待于被阐述。其中仅四个赖氨酸残基之一被精氨酸取代的脂联素变体的胰岛素致敏能力比野生型脂联素低得多，但是显著地高于全部四个位点发生突变的变体(数据未显示)，说明附着到每个赖氨酸上的糖苷可能以协同的方式起作用。这些糖苷可能直接参与了配体-受体相互作用。另外，这对于其生物学功能所需的正确折叠及稳定其三维结构可能是重要的。目前本实验室正在探讨这些可能性。
总之，本研究证明了从哺乳动物细胞生成的全长脂联素作为胰岛素致敏剂是有功能活性的，四个赖氨酸(68、71、80和104)的羟基化和随后的糖基化产生这种活性。本发明人已经证明了在长期摄食高脂肪含乙醇的食物后，小鼠中小鼠脂联素的循环浓度显著地下降。将重组的小鼠脂联素递送给这些小鼠显著地缓解肝肿大和脂肪变性(脂肪肝)，还显著地减弱炎症和提高的血清丙氨酸转氨酶水平。发现小鼠脂联素处理降低肝脏的TNF-α生成，以及脂肪酸合酶和脂肪酸转运蛋白CD36的表达。
这些结果还表明胶原域在功能上对于脂联素的胰岛素致敏作用是重要的。对于由脂肪细胞中分泌的脂联素的多种同工型，翻译后的修饰也是功能相关的。
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100，3967(1999).)27.Ouchi，N.等.内皮粘附分子的新调节器脂肪细胞来源的血浆蛋白脂联素.循环100，2473-2476(1999).(Ouchi，N.et al.Novelmodulator for endothelial adhesion moleculesadipocyte-derived plasmaprotein adiponectin.Circulation 100，2473-2476(1999).)28.Ross，R.动脉硬化症炎症疾病.新英格兰医学期刊340，115-126(1999).(Ross，R.Atherosclerosisan inflammatory disease.New Eng.J.Med.340，115-126(1999).)29.Eaton，S.，Record，C.O.和Bartlett，K.酒精性脂肪肝的发病机理中的多种生物化学作用.欧洲临床研究期刊27，719-722(1997).(Eaton，S.，Record，C.O.& Bartlett，K.Multiple biochemical effects inthe pathogenesis of alcoholic fatty liver.Eur.J.Clin.Invest.27，719-722(1997).)30.You，M.，Fischer，M.，Deeg，M.A.和Crabb，D.W.乙醇通过激活固醇调控元件-结合蛋白(SREBP)诱导脂肪酸合成路径.生物学化学期刊277，29342-29347(2002).(You，M.，Fischer，M.，Deeg，M.A.& Crabb，D.W.Ethanol induces fatty acid synthesis pathways by activation of sterolregulatory element-binding protein(SREBP).J.Biol.Chem.277，29342-29347(2002).)31.Siler，S.Q.，Neese，R.A.和Hellerstein，M.K.在急剧食用酒精后，人体内的脂肪重新生成、脂肪动力学和全身脂肪平衡.美国临床营养学期刊70，928-936(1999).(Siler，S.Q.，Neese，R.A.& 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-Ross，R.动脉硬化症炎症疾病.新英格兰医学期刊340，115-126(1999).(Ross，R.Atherosclerosisan inflammatory disease.New Eng.J.Med.340，115-126(1999).)-Maeda，N.等.缺乏脂联素/ACRP30的小鼠中食物诱导的胰岛素耐受.自然医学8，731-737(2002).(Maeda，N.et al.Diet-induced insulinresistance in mice lacking adiponectin/ACRP30.Nat.Med.8，731-737(2002).)-Eaton，S.，Record，C.O.和Bartlett，K.酒精性脂肪肝的发病机理中的多种生物化学作用.欧洲临床研究期刊27，719-722(1997).(Eaton，S.，Record，C.O.& Bartlett，K.Multiple biochemical effects in thepathogenesis of alcoholic fatty liver.Eur.J.Clin.Invest.27，719-722(1997).)-You，M.，Fischer，M.，Deeg，M.A.和Crabb，D.W.乙醇通过激活固醇调控元件-结合蛋白(SREBP)诱导脂肪酸合成路径.生物学化学期刊277，29342-29347(2002).(You，M.，Fischer，M.，Deeg，M.A.& Crabb，D.W.Ethanol induces fatty acid synthesis pathways by activation of sterolregulatory element-binding protein(SREBP).J.Biol.Chem.277，29342-29347(2002).)-Siler，S.Q.，Neese，R.A.和Hellerstein，M.K.在急剧食用酒精后，人体内的脂肪重新生成、脂肪动力学和全身脂肪平衡.美国临床营养学期刊70，928-936(1999).(Siler，S.Q.，Neese，R.A.& Hellerstein，M.K.Denovo lipogenesis，lipid kinetics，and whole-body lipid balances in humansafter acute alcohol consumption.Am.J.Clin.Nutr.70，928-936(1999).)-Funabiki，A.，Maeda，K.，Ishihara，K.，Okada，Y.和Kasuga，M.脂联素与肝脏中的胰岛素耐受相关.糖尿病51(附录2)，A32(2002).(Funabiki，A.，Maeda，K.，Ishihara，K.，Okada，Y.& Kasuga，M.Adiponectin isassociated with insulin resistance in liver.Diabetes 51(suppl 2)，A32(2002).)-Yoda-Murakami，M.等，施用四氯化碳的小鼠肝脏中GBP28/脂联素表达的变化.生物化学生物物理学研究通讯285，372-377(2001).(Yoda-Murakami，M.et al，Change inexpression of GBP28/adiponectin incarbon tetrachloride-administrated mouse liver.Biochem.Biophys.Res.Commun.285，372-377(2001).)-Yamauchi，T.等.脂联素通过激AMP-活性蛋白激酶刺激葡萄糖利用和脂肪酸氧化.自然医学7，1-8(2002).(Yamauchi，T.et al.Adiponectinstimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activatingAMP-activated protein kinase.Nat.Med.7，1-8(2002).)-Winder，W.W.和Hardie，D.G.AMP-活性蛋白激酶是代谢总开关在2型糖尿病中的潜在作用，美国生理学期刊277，El-10(1999).(Winder，W.W.& Hardie，D.G.AMP-activated protein kinase，a metabolic masterswitchpossible roles in type 2 diabetes.Am.J.Physiol.277，El-10(1999).)应当理解，在此描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，据此的各种改进和变化对于本领域技术人员来说是被教导的，包含在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的保护范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此被全文引入作为参考，以达到与每个单独的出版物、专利或专利申请特定地、分别地被指定如此引入作为参考相同程度的目的。
权利要求
1.一种脂联素多肽，其中该脂联素多肽被糖基化和其中它是重组的、分离的、纯化的或合成的。
2.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是人脂联素。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化或未被羟基化。
4.根据权利要求3所述的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。
5.根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化。
6.根据权利要求5所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
7.根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
8.根据权利要求7所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
9.根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
10.根据权利要求9所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
11.根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化。
12.根据权利要求11所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
13.根据权利要求5所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基65的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
14.根据权利要求13所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
15.根据权利要求13所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
16.根据权利要求13所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
17.根据权利要求14所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
18.根据权利要求17所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
19.根据权利要求14所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
20.根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
21.根据权利要求5所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
22.根据权利要求21所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
23.根据权利要求22所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
24.根据权利要求21所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
25.根据权利要求5所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
26.根据权利要求25所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
27.根据权利要求5所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
28.根据权利要求3所述的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基未被羟基化。
29.根据权利要求28所述的脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化。
30.根据权利要求29所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
31.根据权利要求28所述的脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
32.根据权利要求31所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
33.根据权利要求28所述的脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
34.根据权利要求33所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
35.根据权利要求28所述的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化。
36.根据权利要求35所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
37.根据权利要求29所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基65的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
38.根据权利要求37所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
39.根据权利要求37所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
40.根据权利要求37所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
41.根据权利要求38所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
42.根据权利要求41所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
43.根据权利要求38所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
44.根据权利要求39所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
45.根据权利要求29所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基68的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
46.根据权利要求45所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
47.根据权利要求46所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
48.根据权利要求45所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
49.根据权利要求29所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基77的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
50.根据权利要求49所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
51.根据权利要求29所述的脂联素多肽，其中该脂联素多肽在对应于人脂联素的赖氨酸残基101的位置上有α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸残基。
52.根据权利要求2所述的脂联素多肽，其中Lys-65、68、77和101都被糖基化。
53.根据权利要求2所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽在每个赖氨酸残基65、68、77和101上至少具有一个糖部分。
54.根据权利要求52所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有单一的糖部分。
55.根据权利要求52所述的脂联素多肽，其中所述糖基化具有多种糖部分。
56.根据权利要求2所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽在每个赖氨酸残基65、68、77和101上至少具有一个葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。
57.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽在至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一上具有结构X1，和其中每个X1单独选自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一种或多种。
58.根据权利要求57所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽在全部赖氨酸残基65、68、77和101上具有结构X1。
59.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是同工型3。
60.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是同工型4。
61.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是同工型5。
62.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是同工型6。
63.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其与药学上可接受的赋形剂、共活性剂或稀释剂的一种或多种一起配制以适合于施用给哺乳动物患者。
64.一种脂联素多肽，其在对应于人脂联素的脯氨酸残基91的位置上具有羟基脯氨酰基残基，并且它是重组的、分离的、纯化的或合成的。
65.根据权利要求64所述的脂联素多肽，其与药学上可接受的赋形剂、共活性剂或稀释剂的一种或多种一起配制以适合于施用给哺乳动物患者。
66.作为药物组合物的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的每个残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
67.作为药物剂量单位的脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的每个残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
68.一种包括脂联素多肽的组合物，其中所述脂联素多肽被糖基化和其中所述脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的或合成的。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述脂联素多肽是人脂联素。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的组合物，其与或不与其他药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等的一种或多种一起配制以适合于施用给哺乳动物患者。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中对应于人脂联素残基91的脂联素多肽的残基是羟基脯氨酸。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101赖氨酸残基之一被糖基化。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
74.根据权利要求71所述的组合物，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
76.根据权利要求71所述的组合物，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
77.根据权利要求76所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
78.根据权利要求71所述的组合物，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化。
79.根据权利要求78所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
80.根据权利要求71所述的组合物，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸。
81.根据权利要求70所述的组合物，其中对应于人脂联素的残基91的脂联素多肽的残基不是羟基脯氨酸。
82.根据权利要求81所述的组合物，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
84.根据权利要求81所述的组合物，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
86.根据权利要求81所述的组合物，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
88.根据权利要求81所述的组合物，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基中的全部四个都被糖基化。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种。
90.根据权利要求81所述的组合物，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸。
91.根据权利要求68所述的组合物，其中Lys-65、68、77和101全被糖基化。
92.根据权利要求68所述的组合物，其中所述脂联素多肽在每个赖氨酸残基65、68、77和101上至少包括一个糖部分。
93.根据权利要求91所述的组合物，其中所述糖基化具有单一的糖部分。
94.根据权利要求91所述的组合物，其中所述糖基化具有多种糖部分。
95.根据权利要求68所述的组合物，其中所述脂联素多肽在每个赖氨酸残基65、68、77和101上至少具有一个葡糖基半乳糖基部分或半乳糖基葡糖基部分。
96.根据权利要求68所述的组合物，其中所述脂联素多肽在至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一上具有结构X1，和其中每个X1单独选自葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基半乳糖基部分、半乳糖基葡糖基部分的一种或多种。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述脂联素多肽在全部赖氨酸残基65、68、77和101上包含结构X1。
98.根据权利要求68所述的组合物，其中所述脂联素多肽具有天然的哺乳动物脂联素多肽的序列。
99.一种包含脂联素多肽的组合物，其基本上不含至少一个未被糖基化的脂联素多肽同工型。
100.根据权利要求99所述的组合物，其中该组合物基本上不含同工型1。
101.根据权利要求99所述的组合物，其中该组合物基本上不含同工型2。
102.根据权利要求99所述的组合物，其中该组合物基本上不含任何未被糖基化的脂联素多肽同工型。
103.一种包含脂联素多肽的组合物，其中主要的脂联素多肽种类完全被糖基化。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中Lys-65、68、77和101全都被糖基化。
105.根据权利要求103所述的组合物，其中该组合物包含超过一种脂联素多肽同工型。
106.根据权利要求103所述的组合物，其中同工型3是组合物中主要的脂联素多肽。
107.根据权利要求103所述的组合物，其中同工型4是组合物中主要的脂联素多肽。
108.根据权利要求103所述的组合物，其中同工型5是组合物中主要的脂联素多肽。
109.根据权利要求103所述的组合物，其中同工型6是组合物中主要的脂联素多肽。
110.根据权利要求68所述的组合物，其中将该组合物施用给哺乳动物增强胰岛素的作用。
111.根据权利要求68所述的组合物，其中所述组合物有效使亚生理血液胰岛素浓度产生正常生理血液胰岛素浓度的生物学效果。
112.根据权利要求110或权利要求111所述的组合物，其还包含胰岛素。
113.根据权利要求112所述的组合物，其中所述胰岛素的存在量或浓度足以产生在约50pM到约400pM之间的血液胰岛素浓度。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述胰岛素的存在量或浓度足以产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度。
115.根据权利要求114所述的组合物，其中所述胰岛素的存在量或浓度足以产生约200pM的血液胰岛素浓度的存在量或浓度。
116.一种糖基化脂联素多肽的组合物，其中当该组合物被施用给个体时抑制糖原异生。
117.根据权利要求68所述的组合物，其有效产生在1microg/mL和20microg/mL之间的血浆脂联素多肽浓度。
118.根据权利要求117所述的组合物，有效产生在1.9microg/mL和17microg/mL之间的血浆脂联素多肽浓度。
119.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其纯度为至少约50％。
120.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其纯度为至少约80％。
121.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其纯度为至少约90％。
122.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其纯度为至少约95％。
123.根据权利要求1所述的脂联素多肽，其纯度为至少约99％。
124.根据权利要求66所述的脂联素多肽，其纯度为至少约50％。
125.根据权利要求66所述的脂联素多肽，其纯度为至少约80％。
126.根据权利要求66所述的脂联素多肽，其纯度为至少约90％。
127.根据权利要求66所述的脂联素多肽，其纯度为至少约95％。
128.根据权利要求66所述的脂联素多肽，其纯度为至少约99％。
129.根据权利要求67所述的脂联素多肽，其纯度为至少约50％。
130.根据权利要求67所述的脂联素多肽，其纯度为至少约80％。
131.根据权利要求67所述的脂联素多肽，其纯度为至少约90％。
132.根据权利要求67所述的脂联素多肽，其纯度为至少约95％。
133.根据权利要求67所述的脂联素多肽，其纯度为至少约99％。
134.一种在个体中诊断存在或倾向于产生疾病状态的方法，其包括确定特定脂联素多肽同工型的水平或者该个体中至少两种糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式，以及比较该表达模式与表征未患有该疾病状态的个体的表达模式，其中表达模式的差异指示存在或倾向于产生该疾病。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所用的任何一种或多种脂联素多肽同工型是根据权利要求1所述的糖基化的脂联素多肽。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所用的任何一种或多种脂联素多肽同工型是人脂联素。
137.根据权利要求135或权利要求136所述的方法，其中该个体是人。
138.根据权利要求134所述的方法，其中所述疾病状态是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
139.根据权利要求134所述的方法，其中所述脂联素多肽从生物样本中获得。
140.根据权利要求134所述的方法，其中所述水平或表达模式通过量化或评价糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式获得。
141.根据权利要求134所述的方法，其中所述评价方法采用电泳、HLPC，或质谱分析。
142.根据权利要求140所述的方法，其中采用特异性抗糖基化脂联素多肽同工型的抗体来量化或评价所述水平或表达模式。
143.一种在个体中诊断存在或倾向于产生疾病状态的方法，其包括确定特定脂联素多肽同工型的水平或者该个体中至少两种糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式，并且比较该表达模式与表征患有该疾病状态的个体的表达模式，其中表达模式相似表示存在或倾向于产生该疾病。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所用的任何一种或多种脂联素多肽同工型是根据权利要求1所述的糖基化的脂联素多肽。
145.根据权利要求143所述的方法，其中所用的任何一种或多种脂联素多肽同工型是人脂联素。
146.根据权利要求144或权利要求145所述的方法，其中该个体是人。
147.根据权利要求143所述的方法，其中所述疾病状态是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
148.根据权利要求143所述的方法，其中所述脂联素多肽从生物样本中获得。
149.根据权利要求143所述的方法，其中所述水平或表达模式通过量化或评价糖基化的脂联素多肽同工型的表达模式获得。
150.根据权利要求143所述的方法，其中所述评价方法采用电泳、HLPC，或质谱分析。
151.根据权利要求149所述的方法，其中采用特异性抗糖基化脂联素多肽同工型的抗体来量化或评价所述水平和表达模式。
152.一种用于治疗与脂联素多肽调控或异常胰岛素灵敏性相关的疾病状态的方法，其包含施用有效量的糖基化的脂联素多肽，并且伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述疾病状态是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
154.根据权利要求152所述的方法，其中所述糖基化的脂联素多肽是人脂联素。
155.根据权利要求152所述的方法，其中所述脂联素多肽是选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
156.根据权利要求152所述的方法，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
157.根据权利要求152所述的方法，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
158.一种用于治疗与脂联素调控或异常胰岛素灵敏性相关的疾病状态的方法，其包括施用有效量的权利要求68的组合物，并且伴随有或没有药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂等。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述疾病状态是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
160.糖基化的脂联素多肽(可选与药学上可接受的赋形剂、共活性剂、稀释剂和包装容器)在制备用于哺乳动物患者的药物组合物或药剂或剂量单位的用途，其用于i)治疗与脂联素多肽调控相关的疾病状态；或ii)增强胰岛素作用；或iii)抑制糖原异生。
161.根据权利要求160所述的用途，其中所述药物组合物或药剂或剂量单位还包含胰岛素。
162.根据权利要求161所述的用途，其中所述胰岛素的浓度足以产生在约50pM到约400pM之间的血液胰岛素浓度。
163.根据权利要求161所述的用途，其中所述胰岛素的浓度足以产生在约100pM到约300pM之间的血液胰岛素浓度。
164.根据权利要求163所述的用途，其中所述胰岛素的浓度足以产生200pM的血液胰岛素浓度。
165.根据权利要求160所述的用途，其中所述糖基化的脂联素多肽是人脂联素。
166.根据权利要求160所述的用途，其中所述脂联素多肽选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
167.根据权利要求160所述的用途，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
168.根据权利要求160所述的用途，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
169.一种制品，其包含或包括含有至少糖基化的脂联素多肽的容器或呈递单元和所述脂联素多肽或糖基化的脂联素多肽的使用说明书，其在哺乳动物患者中有效用于i)治疗与脂联素多肽调控相关的疾病状态；或ii)增强胰岛素作用；或iii)抑制糖原异生。
170.根据权利要求169所述的产品，其中所述糖基化的脂联素多肽是人脂联素。
171.根据权利要求169所述的产品，其中脂联素多肽选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
172.根据权利要求169所述的制品，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
173.一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够递送有效量的糖基化脂联素多肽其足以有效地用于治疗哺乳动物患者中与脂联素多肽调控相关的疾病状态。
174.根据权利要求173所述的配方或剂量形式，其中所述配方或剂量形式还含有胰岛素。
175.根据权利要求174所述的配方或剂量形式，其中胰岛素的浓度足以产生在约50pM到约400pM的血液胰岛素浓度。
176.根据权利要求174所述的配方或剂量形式，其中所述胰岛素的浓度足以产生在约100pM到约300pM的血液胰岛素浓度。
177.根据权利要求176所述的配方或剂量形式，其中所述胰岛素的浓度足以产生约200pM的血液胰岛素浓度。
178.根据权利要求173所述的配方或剂量形式，其中所述糖基化的脂联素多肽是人脂联素。
179.根据权利要求173所述的配方或剂量形式，其中所述脂联素多肽选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
180.根据权利要求173所述的配方或剂量形式，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
181.根据权利要求173所述的配方或剂量形式，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
182.一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，能够递送有效量的糖基化脂联素多肽其足以有效地增强胰岛素的作用。
183.根据权利要求182所述的配方或剂量形式，其中所述脂联素多肽是人脂联素。
184.根据权利要求183所述的配方或剂量形式，其中所述脂联素多肽选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
185.一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，其能够递送有效量的糖基化脂联素多肽其足以有效地增强胰岛素的作用，其中所述脂联素多肽被糖基化。
186.根据权利要求185所述的配方或剂量形式，其中所述配方或剂量形式还包含胰岛素。
187.根据权利要求186所述的配方或剂量形式，其中所述胰岛素的浓度足以产生在约50pM到约400pM的血液胰岛素浓度。
188.根据权利要求187所述的配方或剂量形式，其中所述胰岛素的浓度足以产生约200pM的血液胰岛素浓度。
189.一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，它能够递送有效量的糖基化脂联素多肽其足以有效地抑制糖原异生。
190.根据权利要求189所述的配方或剂量形式，其中所述脂联素多肽是重组的、分离的、纯化的、或合成的。
191.根据权利要求190所述的配方或剂量形式，其中所述脂联素多肽是人脂联素。
192.根据权利要求191所述的配方或剂量形式，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化。
193.一种配方或剂量形式，当被施用给或自动施用给人类或其他哺乳动物时，它能够递送有效量的糖基化脂联素多肽其足以增强胰岛素的作用，其中所述脂联素多肽被糖基化。
194.根据权利要求193所述的配方或剂量形式，其中所述配方或剂量形式还包含胰岛素。
195.根据权利要求194所述的配方或剂量形式，其中所述胰岛素的浓度足以产生在约50pM到约400pM的血液胰岛素浓度。
196.根据权利要求195所述的配方或剂量形式，其中所述胰岛素的浓度足以产生约200pM的血液胰岛素浓度。
197.一种对哺乳动物个体的治疗的监控方法，该个体易感或患有以下症状d.与脂联素多肽调控相关；e.需要增强胰岛素，或f.需要抑制糖原异生，所述方法包含或包括监控个体中糖基化脂联素多肽的存在提高的步骤，其中糖基化的脂联素多肽具有如下之一(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化。(C)(A)和(B)。
198.根据权利要求197所述的方法，其中任何一种或多种所用的脂联素多肽同工型是具有(C)(即具有(A)和(B))的糖基化脂联素多肽。
199.根据权利要求197所述的方法，其中任何一种或多种所用的脂联素多肽同工型是人脂联素。
200.根据权利要求199所述的方法，其中个体是人。
201.根据权利要求197所述的方法，其中所述症状可以是高血糖症、胰岛素耐受、与胰岛素耐受相关的代谢综合征、2型糖尿病、或肥胖症、代谢综合征包括高血压、动脉硬化形成、冠心病、缺血性心脏病、或多囊卵巢综合征。
202.根据权利要求197所述的方法，其中所述脂联素多肽得自生物样本。
203.根据权利要求197所述的方法，其中所述水平或表达模式通过量化或评价糖基化脂联素多肽同工型的表达模式来获得。
204.根据权利要求197所述的方法，其中所述评价方法采用电泳、HLPC，或质谱分析。
205.根据权利要求203所述的方法，其中所述水平或表达模式采用特异性抗糖基化的脂联素多肽同工型的抗体来量化或评价。
206.一种制备含有糖基化的脂联素多肽的组合物的方法，其包括步骤；(a)获得包括至少两种形式的糖基化程度或类型不同的脂联素多肽的第一组合物；和(b)区分脂联素多肽的各形式至少到一定程度，使得这种区分基于糖基化程度或类型，从而产生在脂联素多肽模式上区别于第一组合物的第二组合物。
207.根据权利要求206所述的方法，其在第二组合物中富含或至少主要分离出脂联素多肽，其具有(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)。
208.根据权利要求206所述的方法，其中所述脂联素多肽是通过在哺乳动物细胞中表达编码脂联素多肽的重组多核苷酸得到。
209.根据权利要求206所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码具有图5中描述的序列的多肽或其生物活性片段或其变体。
210.根据权利要求206所述的方法，其中所述脂联素多肽从动物组织中纯化。
211.根据权利要求206所述的方法，其中所述动物是人、小鼠、大鼠、狗、牛或非人的灵长类。
212.根据权利要求206所述的方法，其中所述组织是血清或脂肪细胞。
213.根据权利要求206所述的方法，其中所述分离包括电泳步骤。
214.根据权利要求206所述的方法，其中所述分离不包括电泳步骤。
215.根据权利要求206所述的方法，其中所述分离包括层析步骤。
216.根据权利要求206所述的方法，其中所述分离不包括层析步骤。
217.根据权利要求206所述的方法，其中所述第二组合物是脂联素多肽的组合物或含有脂联素多肽的组合物，该脂联素多肽至少具有如下之一(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)。
218.一种组合物，其通过包含如下步骤的制备包括糖基化的脂联素多肽的方法制备(a)获得包含至少两种形式的糖基化程度或类型不同的脂联素多肽的第一组合物；(b)区分脂联素多肽的各个形式至少到一定程度，使得这种区分基于糖基化程度或类型，从而产生在脂联素多肽模式上区别于第一组合物的第二组合物。
219.一种抗体，其特异性抗选自如下的脂联素多肽的糖基同工型(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)。
220.根据权利要求219所述的抗体，其为单克隆抗体。
221.根据权利要求219所述的抗体，所述抗体能够双位点捕获。
222.一种组合物，其包含特异性抗选自如下的脂联素多肽的糖基同工型的抗体(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)。
223.一种杂交瘤，其特别用于生产特异性抗选自如下的脂联素多肽的糖基同工型的抗体(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)。
224.一种方法，其用于筛选一种试剂或用于在哺乳动物中用以提高具有如下之一的糖基化脂联素多肽的水平的试剂(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)，该方法包括给予哺乳动物或其组织或一种或多种细胞或使哺乳动物任何通过这些哺乳动物或哺乳动物组织或一种或多种细胞提高这种糖基化的脂联素多肽的生成。
225.一种试剂，其用于提高具有如下之一的糖基化脂联素多肽的水平(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，(C)(A)和(B)，通过筛选的方法来确定，该方法包括给予哺乳动物或其组织或通过这些哺乳动物或哺乳动物组织提高哺乳动物这种糖基化的脂联素多肽产品。
226.一种脂联素多肽同工型的混合物，其通过去除、转化或合成，基本含有或富含具有至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化的同工型。
227.一种脂联素多肽同工型的混合物，其通过去除、转化或合成，基本含有或富含具有至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基未被羟基化的同工型。
228.脂联素多肽同工型，其基本含有或富含(无论是通过去除、转化或合成)至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化的同工型。
229.脂联素多肽同工型，其基本含有或富含(无论是通过去除、转化或合成)至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和在对应于人脂联素的脯氨酸残基91的位置上具有羟基脯氨酰基残基的同工型。
230.脂联素多肽同工型，其基本含有或富含(通过去除、转化或合成)至少一个或多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化和在对应于人脂联素的脯氨酸残基91的位置上不具有羟基脯氨酰基残基的同工型。
231.一种用于筛选一种或多种能够表达糖基化脂联素多肽的细胞的方法，其包含鉴定和/或确定特异的脂联素多肽同工型的水平或至少两种由所述细胞表达的糖基化脂联素多肽同工型的表达模式和/或纯化和/或分离所述细胞。
232.根据权利要求231所述的方法，其中所述糖基化的脂联素多肽为人脂联素。
233.根据权利要求231所述的方法，其中所述脂联素多肽选自以下的一种或多种i)一种脂联素多肽，其中至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基之一被糖基化，ii)如i)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分中的任何一种或多种，iii)一种脂联素多肽，其中两个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，iv)如iii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，v)一种脂联素多肽，其中三个或更多个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的赖氨酸残基被糖基化，vi)如v)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，vii)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的全部四个赖氨酸残基都被糖基化，viii)如vii)中定义的脂联素多肽，其中所述糖基化具有葡糖基半乳糖基部分、葡糖基葡糖基部分、半乳糖基葡糖基部分或半乳糖基半乳糖基部分的任何一种或多种，ix)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸，和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸，和x)一种脂联素多肽，其中对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
234.根据权利要求231所述的方法，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
235.根据权利要求231所述的方法，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
236.根据权利要求231所述的方法，其中采用特异性抗选自下列的脂联素多肽的糖基同工型来鉴定和/或确定任何一种或脂联素多聚体(A)至少对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的赖氨酸残基之一被糖基化，(B)对应于人脂联素的脯氨酸残基91的脯氨酰残基被羟基化，和(C)(A)和(B)。
237.根据权利要求236所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
238.根据权利要求236所述的方法，其中所述抗体特异性抗脂联素多肽，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基是羟基脯氨酸。
239.根据权利要求236所述的方法，其中所述抗体特异性抗脂联素多肽，其中每个对应于人脂联素的赖氨酸残基65、68、77和101的脂联素多肽的残基是α-1-2-葡糖基半乳糖基-O-羟基赖氨酸和其中对应于人脂联素的脯氨酸残基91的残基不是羟基脯氨酸。
240.通过筛选一种或多种能够表达糖基化的脂联素多肽的方法鉴定和/或分离和/或纯化的任何一种或多种细胞，该方法包括鉴定和/或确定特异的脂联素多肽同工型的水平或至少两种由所述细胞表达的糖基化脂联素多肽同工型的表达模式以及鉴定和/或纯化和/或分离所述细胞。
241.一种治疗遭受或患有肝脏疾病和/或具有任何肝脏疾病特征的哺乳动物患者的方法，其包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
242.根据权利要求241所述的方法，其中所述哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
243.根据权利要求241或242所述的方法，其中所述脂联素是全长的。
244.根据权利要求241所述的方法，其中所述脂联素被糖基化。
245.根据权利要求241所述的方法，其中所述脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的一个或多个残基被糖基化的人脂联素。
246.根据权利要求245所述的方法，其中所述脂联素制剂以适合于肠胃外施用的方式配制。
247.一种治疗遭受或患有酒精性肝脏疾病和/或具有任何酒精性肝脏疾病特征的哺乳动物患者的方法，其包含或包括给该患者施用所述脂联素和/或其激动剂。
248.一种治疗哺乳动物患者以预防和/或反转肝脏疾病和/或具有任何肝脏疾病特征的的方法，其包含或包括给该患者施用所述脂联素和/或其激动剂。
249.一种治疗正患肝脏疾病和/或具有任何肝脏疾病特征的人的方法，其包含或包括给该患者施用有效量的脂联素和/或其激动剂。
250.一种治疗哺乳动物患者以预防和/或反转酒精性肝脏疾病和/或具有任何酒精性肝脏疾病特征的的方法，其包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
251.一种治疗正患酒精性肝脏疾病和/或具有任何酒精性肝脏疾病特征的人的方法，其包含或包括给该患者施用有效量的脂联素和/或其激动剂。
252.一种治疗遭受肝脏脂肪变性(脂肪浸润)、肝脏炎症、肝坏死、肝纤维化、肝硬化、和/或肝功能紊乱的任何一种或多种的哺乳动物患者的方法，其包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
253.一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的容器；和脂联素或脂联素激动剂(如，含在容器中的)用于治疗、预防或反转肝脏疾病和/或肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
254.一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的容器；和脂联素或脂联素激动剂(如，含在容器中的)和/或这种剂量单位用于治疗、预防或反转酒精性肝脏疾病和/或酒精性肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
255.一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的包装材料；脂联素和/或脂联素激动剂(如，含在包装材料中的)用于治疗、预防或反转肝脏疾病和/或肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
256.一种制品，其包含或包括含有脂联素、和/或脂联素激动剂的包装材料；和脂联素和/或脂联素激动剂(如，含在包装材料中的)用于治疗、预防或反转酒精性肝脏疾病和/或酒精性肝脏疾病的任何特征的使用说明书。
257.脂联素和/或脂联素激动剂在与其他材料(无论受体、共活性剂、稀释剂等和/或无论剂量单位定义的容器)加工有效用于在哺乳动物患者(人或其他动物)中治疗、预防或反转疾病和/或肝脏疾病的任何特征的剂量单位或药物组合物中的用途。
258.有效量的脂联素和/或脂联素激动剂在与其他材料(无论受体、共活性剂、稀释剂等和/或无论剂量单位定义的容器)加工有效用于在哺乳动物患者(人或其他动物)中治疗、预防或反转酒精性疾病和/或酒精性肝脏疾病的任何特征的剂量单位或药物组合物中的用途。
259.一种治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包含或包括，监测哺乳动物患者中的脂联素和/或给该哺乳动物施用脂联素和或其激动剂，这种治疗的目的在于治疗、反转或预防肝脏疾病和或肝脏疾病(和包括酒精性肝脏疾病)的任何特征。
260.根据权利要求259所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
261.一种治疗哺乳动物患者的方法，其以任何顺序包含或包括，监测哺乳动物患者中的脂联素mRNA，和或给该哺乳动物施用脂联素和或其激动剂，这种治疗的目的在于治疗、反转或预防肝脏疾病和/或肝脏疾病(和包括酒精性肝脏疾病)的任何特征。
262.根据权利要求261所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
263.一种测定哺乳动物患者中脂联素的方法，其包含或包括检测血液或组织中的脂联素浓度。
264.根据权利要求263所述的方法，其中该浓度通过免疫学方法如放射免疫检测(RIA)，和/或BLISA确定。
265.根据权利要求263所述的方法，其中所述组织是脂肪组织。
266.一种测定哺乳动物患者中的脂联素的方法，其包含或包括检测血液或组织中的脂联素mRNA的浓度。
267.根据权利要求266所述的方法，其中所述脂联素mRNA的浓度可以通过RT-PCR、Northern分析、原位杂交和/或放射免疫检测(RIA)测定。
268.根据权利要求266所述的方法，其中所述组织是脂肪组织。
269.一种能够测定哺乳动物患者的脂联素的检测方法，其包含或包括从哺乳动物患者中分离血液或组织样本，制备样本，检测血液或组织中的脂联素浓度。
270.根据权利要求269所述的方法，其中该浓度通过免疫学方法如放射免疫检测(RIA)，和/或BLISA确定。
271.一种治疗哺乳动物患者的方法，该患者遭受或患有选自急性肝脏疾病、慢性肝脏疾病、肝脏炎症、肝脏功能紊乱、脂肪肝(肝脏脂肪变性)、肝脏纤维化、肝脏硬化、肝脏坏死、肝细胞坏死、酒精性肝脏疾病、酒精性肝脂肪变性、酒精性肝炎、酒精性肝坏死、酒精性肝硬化、肝坏死、肝脂肪变性、与糖尿病相关的肝脂肪变性、与富含脂类的饮食相关的肝脂肪变性、与脂类代谢异常相关的肝脂肪变性、由任何情况引起的肝炎、由任何情况导致的肝坏死、急性肝炎、慢性肝炎、慢性自发性肝炎、肝脏的病毒感染或发炎继发的肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、任何药物或毒素作用继发的肝炎、胆汁郁积随之发生的肝炎或肝功能紊乱、原发性胆汁性肝硬化、肝脏肉芽肿病，和/或其中肿瘤坏死因子的组织或血液浓度升高起致病作用的情况的任何症状，其包含或包括给该患者施用脂联素和/或其激动剂。
272.根据权利要求271所述的方法，其中所述患者是人和脂联素是人脂联素。
273.根据权利要求271所述的方法，其中所述脂联素是全长的。
274.根据权利要求271所述的方法，其中所述脂联素被糖基化。
275.一种治疗其自身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，其包含向该患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来将TNF-α水平抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平。
276.根据权利要求275所述的方法，其中这种施用是为了治疗、改善、预防和/或反转TNT-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
277.根据权利要求275所述的方法，其中所述哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
278.根据权利要求275所述的方法，其中所述脂联素是全长的。
279.根据权利要求275所述的方法，其中所述脂联素被糖基化。
280.根据权利要求279所述的方法，其中所述脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的残基的一个或多个被糖基化的人脂联素。
281.一种治疗其自身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，其包含或包括给该患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来将TNF-α水平抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平，从而对于如下的任何一种或多种的症状产生有利反应炎症性疾病、循环疾病、门脉高压、肺动脉高压、变应性疾病、克隆病、自体免疫溶血性贫血、牛皮癣、肝脏疾病、胰腺病、神经变性疾病、中枢神经衰竭、毒血症、更年期衰退、妊娠中毒、肥胖病、高脂血症、高胆固醇血症、异常葡萄糖耐受、实体瘤、肿瘤和伴随的恶病质、内分泌疾病、Creutzfeldt-Jakob病、病毒感染、经皮冠状动脉成形、血管肥大或闭塞、PTCA/支架/旁路手术后的血管再闭塞/再狭窄、干预后的血管肥大或闭塞、抑制植入诱导的血管衰退和排斥、器官或组织移植后的排斥和自体免疫疾病、在新型治疗过程中TNF生成相关的负作用，还消除和改善与治疗或预防移植排斥相关的休克相关综合症、透析性低血压、青光眼、眼压高、重症肌无力、长期脱脂症、骨病、神经紊乱、TNF-α诱导的胰岛素耐受、异常凋亡、糖尿病或应激高血糖症的并发症、慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎和肺气肿。
282.一种治疗其自身还能够编码脂联素的哺乳动物患者的方法，其包含向该患者施用足量的脂联素和/或脂联素作用位点的激动剂来将TNF-α的mRNA水平抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平。
283.根据权利要求282所述的方法，其中这种施用用于治疗、改善、预防和/或反转TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征。
284.根据权利要求282所述的方法，其中所述哺乳动物是人和脂联素是人脂联素。
285.根据权利要求282所述的方法，其中所述脂联素是全长的。
286.权利要求282所述的方法，其中所述脂联素被糖基化。
287.权利要求286所述的方法，其中所述脂联素是对应于赖氨酸残基65、68、77和101的残基的一个或多个被糖基化的人脂联素。
288.脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的用途，其与其他材料(σ)制造(ωηετηερ ρεχιπιευτσ，χο-αχτιωεσ，διλυευτσ ορ τηελικε ανδ/ορωηετηερ αδοσαγευνιτ δεφινινγ ωεσσελ)οφα δοσαγε υνιτ ορ πηαρμαχευτιχαλ χομποσιτιον εφφεχτιωε φορ υσε το συππρεσσ TNφ-α)低于没有这种施用时存在或可能存在的水平。
289.脂联素和/或脂联素作用位点激动剂与其他材料(无论是受体、共活性剂、稀释剂或等等和/或剂量单位定义的容器)在加工有效用于治疗、预防和/或反转TNF-α疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的剂量单位或药物组合物中的用途。
290.一种有效用于将TNF-α水平抑制为低于没有这种施用时存在或可能存在的水平的制品，其包含或包括含有脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的容器；脂联素和/或脂联素作用位点激动剂(例如，含在容器中)的使用说明书。
291.一种用于治疗、预防或反转TNF-□疾病或紊乱和/或TNF-α疾病或紊乱的任何特征的制品，其包含或包括含有脂联素和/或脂联素作用位点激动剂的容器；脂联素和/或脂联素作用位点激动剂(例如，含在容器中)的使用说明书。
全文摘要
本发明涉及脂联素多肽(特别是优选在对应于人脂联素的赖氨酸位点65、68、77和101上被糖基化的那些和特别是在脯氨酸91上被羟基化的那些)被证明有效用于治疗各种症状。本发明公开了相关的组合物、用途和方法。
文档编号A61P1/00GK1886423SQ03806207
公开日2006年12月27日 申请日期2003年1月17日 优先权日2002年1月18日
发明者徐爱民, 汪玉, G·J·S·库珀 申请人:普罗特米克斯公司