专利名称：灵芝多糖蛋白及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有5至20个氨基酸的肽，特别涉及一种从灵芝中提取而获得的灵芝多糖蛋白及其制备方法与用途。
背景技术：
灵芝具有特殊的药用价值，被视为珍贵的中药材，传统的服用方法为煎服或煮食。目前国内也有较多的学者在进行灵芝有效成分的提取、分离及药用分析的工作，其中，针对灵芝多糖的研究主要有如下几例1、期刊《中草药》1994，25(8).-395-397中记载了由作者何云庆、李荣芷撰写的《灵芝肽多糖的化学研究》，其从灵芝子实体中提取了的葡聚糖肽的分子量都较小，一般在几万的单位，分子量较小，而且也没有对所获取的多糖蛋白的药用作用进一步的研究和公开。
2、期刊《食用菌学报》1997，4(2).-40-42中记载了由作者陈书明、王勤撰写的《灵芝肽多糖生物活性初探》，其从灵芝菌丝体中分离纯化得到的灵芝肽多糖的分子量为140000，并且认为该肽多糖具有增强体液免疫和红细胞的功能。
3、期刊《分析试验室》1998，17(4).-17-21中记载了由作者罗立新、周少奇撰写的《灵芝多糖的结构分析》，其经过热水提取的多糖的分子量较小，如3.7×104和4.2×104。
综上所述，现有技术对于灵芝多糖的提取方法有热水浸提(或水煎煮)、乙醇提取和稀碱提取，提取工艺各有不同，而且只能适用于小批量制备而无法进行工业化生产，因而实用性差，并且获得的多糖的结构和分子量也不同，特别多糖肽的分子量小直接影响了灵芝多糖蛋白的药用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供一种分子量大、药用价值高的灵芝多糖蛋白及其可工业化生产的制备方法，并且还提供了灵芝多糖蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的目的可以经如下方案实现。
灵芝多糖蛋白Gl-PP，其要点在于，其以灵芝为原料母体提取提取液，将提取液浓缩后，经过超滤或透析而截留高分子量的多糖蛋白而获得。
灵芝多糖蛋白为一种结合蛋白多糖(Gamaderma Lncidumpolysacnarides peptide，简称GL-PP)。
作为原料的灵芝可以是代料栽培而获得的灵芝子实体，也可以是段木栽培的灵芝子实体，甚至还可以是通过深层发酵而获得的灵芝菌丝体。
一般认为灵芝多糖的药理活性来自于所含的几万到十几万分子量的多糖，而本发明突破现有技术从灵芝中只能提取得到分子量较小的分子多糖的技术而采用将灵芝提取液再经超滤或透析而截留得到高分子量的多糖蛋白(Gl-PP)。这种对提取液进行透析或超滤的工艺现有技术中并没有应用于提取灵芝多糖蛋白。这可能是因为现有技术中在研究灵芝多糖时一般都是实验室行为，现有课题的研究还没有意识到高分子结合多糖蛋白的存在，自然不可能超出这种普通认识而采用超滤或透析对灵芝提取液进行精加工而获得高分子量的多糖蛋白，因而本发明是一种非显而易见的发明创造。而通过这种工艺提取而获得的灵芝多糖蛋白的药用价值得到了很大的提高，例如经本发明提取而获得的灵芝多糖蛋白(Gl-PP)可以抑制肿瘤新生血管的形成，还可以直接抑制人肺癌PG细胞的侵袭，即该灵芝多糖蛋白具有抗肿瘤作用。这种精确多糖蛋白所获取的效果在现有的灵芝多糖的研究中并没有记载。
本发明还在于该多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其重均分子量Mw为40～60万。
该黄褐色至褐色粉末状物质可溶于水，现有技术中从灵芝中提取的多糖蛋白的分子量均较小，一般在几万到十几万的范围内，而本发明所获取多糖蛋白的重均分子量Mw为40～60万。
进一步还在于该多糖蛋白组分由D-葡萄糖、D-半乳糖、果糖、D-木糖、D-鼠李糖组成。
利用1HNMR波谱分析鉴定，该多糖蛋白的化学位移值具有δ4.704ppm，δ4.509ppm等信号，说明多糖蛋白中的这些单糖主要以β-型糖苷键连接。且尚有δ5.189ppm，δ5.01ppm信号，表明另有少数量α-糖苷键的存在。
本发明的另一个目的提供一种灵芝多糖蛋白的制备方法，其要点在于，1)提供一种灵芝作为原料母体，清洗，干燥，2)破碎该原料母体而得破碎物，3)用乙醇回流破碎物后干燥而得干燥物，4)将干燥物用水提取而得提取液，比例为干燥物∶水＝1∶10～15，5)将提取液静置过滤，获取滤液并浓缩至浓缩液中生药∶水＝1∶5左右时作为粗浓缩液，6)提供一种澄清剂，7)在粗浓缩液中加入澄清剂，搅拌静置加热，并进行固液分离得到提取澄清液；8)将提取澄清液进行超滤处理，截留分子量6000以上的多糖蛋白而成超滤液，9)将超滤液浓缩至含生药量0.5～1.5g/ml的超滤浓缩液后加入乙醇进行沉淀，离心分离后取沉淀物低温干燥至干，即得灵芝多糖蛋白。
现对该工艺作如下解释作为原料的灵芝可以是代料栽培而获得的灵芝子实体，也可以是段木栽培的灵芝子实体，甚至还可以是通过深层发酵而获得的灵芝菌丝体。清洗及干燥采用常规的技术进行。
采用常用破碎装置对灵芝原料母体进行破碎，破碎后的灵芝状态可以为片状或烟丝状，只要满足可以获得细胞壁已被粉碎的母体即可。
进一步还在于将灵芝子实体破碎成烟丝状。
实验表明将灵芝子实体破碎成烟丝状比破碎成块状，多糖蛋白的提取率高。而代料栽培灵芝比段木栽培灵芝提取率要高。
因为所要提取的灵芝多糖蛋白不溶于乙醇，因而将破碎物用乙醇回流处理，以便去除不必要的杂质，并将处理物干燥。
因为灵芝多糖蛋白溶于水，因而将干燥物用水提取，提取时间越长，提取率越高，但成本也相应增加，因而可以选择在2～3小时为好。并对提取液进行浓缩获取药物活性成份浓度较高的粗浓缩液。粗浓缩液中含生药量的浓度会对接下来的纯化工艺产生一定的影响，但对整个提取工艺的效果不会产生太大的影响，因而只需合理控制便可，但尽量控制在浓缩液中生药∶水＝1∶5左右最佳。
在浓缩液中加入澄清剂，因为澄清剂可以除去鞣质、蛋白质、树脂及色素等杂质，因而可以增加提取的灵芝多糖蛋白的纯净度。
采用常规固液分离方式，例如过滤，离心。
超滤处理的进行可以达到精制和提纯的目的，从而获取高分子的多糖蛋白，并获得更为精确的灵芝多糖蛋白(Gl-PP)。在灵芝多糖蛋白的提取工艺中采用超滤工艺此为首次。
灵芝多糖的分离纯化常采用乙醇沉淀法，将超滤液浓缩至含生药量0.5～1.5g/ml时加入乙醇进行沉淀，离心分离后取沉淀物低温干燥至干，即得灵芝多糖蛋白(Gl-PP)。
本发明进一步还在于用水提取的步骤可以具体为二次提取，第一次提取时间为2.5小时，第二次1.5小时。
对提取液进行浓缩的设备或为转速控制在90～100r/min的旋转蒸发仪，或为真空浓缩锅。
在粗浓缩液中加入澄清剂，搅拌静置加热，并进行固液分离得到提取澄清液的具体步骤为1)提供一种ZTC-II天然澄清剂，2)澄清剂分A组分与B组分，配制时A组分加水配A溶液，B组分加1％醋酸溶液配成B溶液，3)将提取液浓缩到生药∶水＝1∶5左右时，按0.2～0.4％加入B溶液，每20分钟搅拌一次，2h后用同样方法加入0.1～0.2％的A溶液，加料30～60分钟再搅拌一次，2h后粗过滤，静置过夜，滤过为澄清液。
ZTC-II天然澄清剂市面上有售，其产品有标明A组分与B组分的结构及使用方法，例如南开大学就有提供这种澄清剂。
将提取澄清液进行超滤处理的具体步骤可以为1)提供一种超滤装置为CLW型的组件，该组件以中空纤维超滤膜、泵、管道、阀门、压力表和预处理装置组成，开机前将溶液阀及超滤液阀打开，然后启动泵，待组件充满溶液后，逐步调整溶液阀，并观察压力表至工作压力0.1～0.2mpa，保持该压力值，2)将提取澄清液通过该超滤装置，截留分子量6000以上的多糖蛋白而成超滤液。
上述设备的连接方式由生产厂商提供，为一种现有技术。
超滤浓缩液用乙醇沉淀的具体步骤为用三倍量于超滤浓缩液的95％乙醇洗涤、搅拌超滤浓缩液2～3次，离心分离后取沉淀物在5℃干燥至干即得灵芝多糖蛋白。
本发明所提供的这种高分子灵芝多糖蛋白的制备方式有多种，在此本发明只是提供了一种更适于工业化生产的超滤工艺生产方式，即获取本发明所指的高分子灵芝多糖蛋白的方式并不限于上文提供的制备方式，例如本发明人在2001年12月29日向国家知识产权局专利局提出的专利申请《草栽灵芝多糖肽及其提取方法》(申请号01138079.9)就公开了一种灵芝多糖蛋白的提取方法，这种方法主要是通过透析的方法来截留高分子的多糖蛋白，但这种方法如果要大批量获取灵芝多糖蛋白成本太高，因为较不适于工业化生产，但其制备而获得的也是一种高分子的灵芝多糖蛋白。
下面提供该灵芝多糖蛋白在医药方面的应用。
灵芝多糖蛋白Gl-PP应用于制备抗肿瘤作用的药物，其要点在于，其包含有有效剂量的高分子灵芝多糖蛋白，该灵芝多糖蛋白系以灵芝为原料母体提取提取液，将提取液浓缩后，经超滤或透析而截留高分子量的多糖蛋白而获得。
有效剂量的定义依据现有医药领域中根据实验药量而转换获得的用药量而定。
而该药物的剂型可以是现有技术中常用的，例针剂，片剂，口服液等等。例如可以依《中华人民共和国药典》简称《中国药典》2000版记载的各种剂型药物的制作方法制作而成，再例如《药剂学》(人民卫生出版社，屠锡德等)第三版对各种药物剂型的制备均有详细的记载。
且该多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其重均分子量Mw为40～60万。
70年代以来，国内外一系列研究证明灵芝(Ganoderma lucidum)对肿瘤具有抑制肿瘤细胞生长作用，可使瘤重减轻和延长生存时间。并认为灵芝多糖可能是灵芝抗肿瘤作用的重要有效成分。然而，研究却发现它们对体外培养的多种肿瘤细胞均无直接抑制作用。研究者推论灵芝多糖的抗肿瘤作用机制主要归结为由机体免疫系统介导所致。本发明却研究发现，Gl-PP有一定抑制肿瘤细胞和抗肿瘤新生血管形成活性，此为抗肿瘤作用的新的机制之一。
侵袭及转移是恶性肿瘤的基本特征。肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节，是肿瘤细胞运动、粘附、酶降解基质、基质内增殖等一系列过程的表现。本发明人观察了Gl-PP对肿瘤细胞粘附性、运动性及基质金属蛋白酶活性和表达的影响，从不同环节研究Gl-PP对肿瘤细胞侵袭性的影响，结果发现灵芝多糖蛋白GL-PP可降低肿瘤的侵袭能力，防止肿瘤转移。
该灵芝多糖蛋白GL-PP对人的肺癌PG细胞作用后，肺癌细胞的运动能力明显下降，细胞向划痕处爬行的速度明显慢于对照组，并呈一定的量效关系。
粘附是癌细胞侵袭的前序步骤，高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性粘附能力通常较高，有利于肿瘤细胞侵犯基底膜等正常组织。抑制肿瘤细胞的粘附性，可降低其侵袭能力，防止肿瘤转移。本发明通过实验证明该不同浓度的灵芝多糖蛋白GL-PP对人的肺癌PG细胞作用后，肿瘤细胞的粘附性有一定程度的下降，即GL-PP可抑制肺癌PG细胞的侵袭性，防止肿瘤转移。
具有转移能力的肿瘤细胞能直接分泌或者通过诱导宿主基质细胞分泌胶原蛋白酶降解细胞外基质(ECM)，基质金属蛋白酶MMP-9是人体内降解ECM的主要蛋白酶家族，其活性是影响肿瘤细胞侵袭和转移的重要因素之一，衡量药物对肿瘤细胞分泌金属蛋白酶的水平的影响是评价该药物抗侵袭作用的一个重要方面。经不同浓度Gl-PP作用于人肺癌PG细胞后，金属蛋白酶MMP-9活性呈剂量依赖性下降；当GL-PP剂量为100μg.ml-1时，对MMP-9活性抑制率可达41.53％。即Gl-PP使金属蛋白酶MMP-9的活性及mRNA的表达均有一定程度降低，也受到不同程度的抑制。
GL-PP在体外对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖有直接抑制作用，抑制率分别是9.41％，15.63％和40.44％。
而通过鸡胚尿那囊膜实验显示(CAM)，灵芝多糖蛋白Gl-PP或含灵芝多糖蛋白Gl-PP的血清在CAM试验中，明显抗新生血管的形成。
总之，Gl-PP可作用于肿瘤细胞侵袭过程中运动、粘附、基质、金属蛋白酶等多个环节，对肿瘤细胞的侵袭有一定的抑制效应。具体的实验及效果详见实施例。
综上所述，本发明相比现有技术具有如下优点可以获得一种高分子量、药用价值高的灵芝多糖蛋白，且提供一种可以工业化生产高分子灵芝多糖蛋白的制备方法，该制备方法成本低、提取率高、提取纯度高，而所获得的灵芝多糖蛋白可以通过抑制肿瘤血管的新生及抑制癌细胞的侵袭而抑制肿瘤的生长，抑制效果好，为一种新型的抗肿瘤药物。
图1为灵芝多糖蛋白Gl-PP抑制BALB/c裸鼠异种人肺癌PG的生长的示意图。其中横坐标day为天数，纵坐标tomor volume为肿瘤体积，control为对照，50mg/kgGL、100mg/kgGL、200mg/kgGL分别为给药Gl-PP50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。
图2为鸡胚尿囊膜(CAM)试验的对照结果图。
图3为鸡胚尿囊膜(CAM)试验中Gl-PP50mg·kg-1组含药血清(10μl/药膜)的结果图。
图4为鸡胚尿囊膜(CAM)试验中Gl-PP(80μg/药膜)的结果图。
图5为Gl-PP体外给药的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖的示意图。
图6为体外Gl-PP对人肺癌PG细胞运动性的影响(400×)示意图。其中48h Control、72h Control、96h Control分别为48h对照、72h对照、96h对照。
图7为体外Gl-PP可抑制人肺癌PG细胞MMP9的活性示意图。
图8为体外Gl-PP(μg.ml-1)对人肺癌PG细胞mRNA表达的影响示意图。(MMP9552bp GAPDH498bp)具体实施方式
一、下面首先例举两种获取高分子灵芝多糖蛋白Gl-PP的制备方法。
实施例1灵芝多糖蛋白Gl-PP的制备方法1、挑选草栽灵芝，将灵芝干品子实体清洁后，烘干，用粗颗粒粉碎机破碎成20目左右的烟丝状物质。
2、称取300克的已经粉碎的烟丝状灵芝，用95％的乙醇3000～4000毫升回流3小时，回收乙醇，干燥灵芝丝状物。采用灵芝丝状物∶热水＝1∶15的比例对灵芝丝状物进行热水回流提取3次，时间分别为2.5小时、2小时、1小时，并合并过滤后的水提取液。
3、在90℃的温度下浓缩水提取液至原体积的十分之一，再用速度为3000r/min，时间为15min的离心机进行离心分离，将上清液浓缩至相当于每毫升含灵芝生药量1克为标准。
4、用三倍量的95％乙醇处理浓缩液，搅拌，恒温5℃静置得第一沉淀物。将第一沉淀物再离心得第二沉淀物，将第二沉淀物溶于适量的蒸馏水，将此溶液用2～3倍量的95％乙醇沉淀，搅拌，5℃左右静置24小时得第三沉淀物，将第三沉淀物再离心得第一多糖蛋白沉淀。
5、将第一多糖蛋白沉淀用95％乙醇，丙酮和乙醚各洗涤3次，用速度为3000r/min，时间为15min的离心机进行离心分离，去上清液，取沉淀物于低温5℃干燥得第一多糖蛋白。
6、将第一多糖蛋白溶于蒸馏水，放置于透析袋内，逆流透析48小时得透析液，将透析液在90℃下浓缩而得浓缩液。
7、用三倍量于浓缩液的95％乙醇处理浓缩液，得第二多糖蛋白沉淀，将第二多糖蛋白沉淀用95％乙醇，丙酮和乙醚各洗涤3次，用速度为3000r/min，时间为15min的离心机进行离心分离，去上清液，取沉淀物于低温5℃干燥即得灵芝多糖蛋白，该灵芝多糖蛋白的重均分子量MW在45万～54万之间，多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其多糖组成为鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖，且各糖摩尔比为0.549∶3.614∶3.167∶0.556∶6.89。
实施例2灵芝多糖蛋白的制备方法，1、提供一种段木灵芝子实体作为原料母体，将灵芝干品子实体清洁后，烘干，用粗颗粒粉碎机破碎成20目左右的烟丝状物质。
2、称取300克的已经粉碎的烟丝状灵芝，用95％的乙醇3000～4000毫升回流3小时，回收乙醇，干燥灵芝醇后得干燥物。
3、将干燥物用水提取，比例为干燥物∶水＝1∶15，提取2次，第一次提取时间为2.5小时，第二次提取1.5小时，合并两次的提取液。
4、将提取液静置过滤，获取滤液并浓缩至浓缩液中含生药∶水＝1∶5左右后作为粗浓缩液，浓缩设备为转速控制在90～100r/min的旋转蒸发仪。
5、提供一种ZTC-II天然澄清剂，该澄清剂分A组分与B组分，配制时A组分加水配A溶液，B组分加1％醋酸溶液配成B溶液，将提取液浓缩到生药∶水＝1∶5左右时，按0.2％加入B溶液，每20分钟搅拌一次，2h后用同样方法加入0.1％的A溶液，加料30分钟再搅拌一次，2h后粗过滤，静置过夜，滤过为提取澄清液。
6、提供一种超滤装置为CLW型的组件，该组件以中空纤维超滤膜、泵、管道、阀门、压力表和预处理装置组成，开机前将溶液阀及超滤液阀打开，然后启动泵，待组件充满溶液后，逐步调整溶液阀，并观察压力表至工作压力0.1～0.2mpa，保持该压力值，将提取澄清液通过该超滤装置，截留分子量6000以上的多糖蛋白而成超滤液，截留分子量6000以上的多糖蛋白而成超滤液。
7、将超滤液浓缩至含生药量0.5g/ml的超滤浓缩液，超滤浓缩液用三倍量于超滤浓缩液的95％乙醇洗涤2～3次并搅拌，离心分离后取沉淀物在5℃干燥至干即得灵芝多糖蛋白。多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其重均分子量Mw为40～60万。多糖蛋白组分由D-葡萄糖、D-半乳糖、果糖、D-木糖、D-鼠李糖组成。多糖蛋白中的单糖主要以β-型糖苷键连接，另有少数量以α-糖苷键连接。
最佳实施例将干燥物用水提取，比例为干燥物∶水＝1∶10。
提供一种ZTC-II天然澄清剂，该澄清剂分A组分与B组分，配制时A组分加水配A溶液，B组分加1％醋酸溶液配成B溶液，将提取液浓缩到生药∶水＝1∶5左右时，按0.4％加入B溶液，每20分钟搅拌一次，2h后用同样方法加入0.2％的A溶液，加料60分钟再搅拌一次，2h后粗过滤，静置过夜，滤过为提取澄清液。
将超滤液浓缩至含生药量1.5g/ml的超滤浓缩液。
本实施例未述部分与实施例2相同。
上述各实施例未述部分与现有技术相同。
二、下面对该灵芝多糖的具体应用作如下描述。
实施一，灵芝多糖蛋白Gl-PP的抗新生血管形成活性而引起的抗肿瘤机制。
研究灵芝多糖蛋白Gl-PP制剂在动物体内观察Gl-PP对荷瘤鼠(或荷瘤裸鼠)模型肿瘤生长的影响；同时在体外实验用MTT法检测Gl-PP或Gl-PP含药血清对肿瘤细胞的直接作用。为了观察荷瘤裸鼠免疫功能特点，检测了裸鼠脾淋巴细胞的增殖效应，证明裸鼠确是T细胞功能缺损模型。还观察了Gl-PP对裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响。肿瘤的生长、转移是血管依赖性的，为了观察体内Gl-PP对新生血管生成的影响，进行了鸡胚尿囊膜(CAM)实验；并在体外检测了Gl-PP对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响。
(一)实验材料1.实验动物BALB/c近交纯系小鼠，♂，6-8周龄，体重18-22g(II级，合格证号scxk11-00-0004)，BALB/c裸鼠，♂，6-8周龄，体重18-22g(III级，合格证号scxk11-00-0010)，由北京大学医学部实验动物部提供。
2.药品灵芝多糖蛋白Gl-PP由采用实施例1至最佳实施例所示任一方法获得的产品，其为褐色粉末，可溶于水，其平均分子量为40～50万。多糖部分由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为0.549∶3.614∶3.167∶0.556∶6.89，主要以β-糖苷键连接，另有少量α-糖苷键。
(二)实验方法1、小鼠移植瘤实验取肿瘤细胞(荷瘤小鼠腹腔S180肉瘤细胞2×106或人肺癌PG细胞2×106)接种于雄性健康小鼠(BALB/c小鼠或BALB/c裸鼠)腋下，随机分组。于接种后第2天开始灌胃给药，1次/天，剂量分别为50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1Gl-PP，对照给予相应体积的生理盐水，连续灌胃10天或33天，于试验结束时，摘眼球取血，摘瘤、称瘤重。
2、PG细胞增殖实验用0.125％胰酶消化、收集PG细胞，用含10％FCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×104·ml-1，96孔培养板每孔加入100μl，37℃，5％CO2孵育24h。吸弃培养液，加入含5％FCS的RPMI-1640配制的0、0.1μg·ml-1、1μg·ml-1、10μg·ml-1、100μg·ml-1Gl-PP100μl或NS组和50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1Gl-PP给药组的BALB/c小鼠过滤除菌含药血清(1∶2稀释)，37℃，5％CO2共孵育48h，培养结束后采用MTT法检测细胞增殖。
3、ConA/LPS刺激裸鼠脾淋巴细胞体外增殖实验分别制备NS组和50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1Gl-PP给药组的裸鼠脾淋巴细胞。颈椎脱臼处死以上各实验组裸鼠(每组5只)，75％乙醇浸泡1-2分钟。在无菌操作台内迅速取出脾脏，置于盛有5-10ml冷Hanks液的平皿内，平皿内预先放置一块略大于平皿的孔径为400目的尼龙筛网。用无菌针芯轻捻脾组织，使单个脾细胞滤过筛网进入平皿内。吸取冷Hanks冲洗筛网，将细胞悬液吸入离心管。4℃离心(1500rpm，5min)，弃上清，加入适量的Tris-NH4Cl(0.16mol·L-1，pH7.2)以溶解红细胞，吹打均匀，静置1-2分钟。再次离心并用冷Hanks液悬浮并离心洗涤细胞2次，弃上清，用完全RPMI-1640培养基悬浮细胞，作细胞计数，调细胞浓度至1×107·ml-1。取96孔平底细胞培养板，每组每孔加入1×106个裸鼠脾淋巴细胞及终浓度为2.5μg·ml-1的ConA或5μg·ml-1的LPS共孵育，各组处理均作6个平行孔。在5％CO2、37℃水蒸气饱和的二氧化碳培养箱内培养68小时，培养结束后采用MTT法检测细胞增殖。
4、裸鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红(NR)实验分别制备NS组和50mg·kg-1、100mg·kg-1、200mg·kg-1Gl-PP给药组的裸鼠腹腔巨噬细胞。颈椎脱臼处死以上各实验组裸鼠(每组5只)，75％乙醇浸泡1-2分钟。在无菌操作台内用无菌注射器吸取5mlD-Hanks液注入腹腔，轻揉腹部2-3分钟，吸出腹腔内渗出物。1500rpm离心5分钟，弃上清，用冷Hanks液重悬洗涤细胞2-3次，最后用完全RPMI-1640培养液重悬细胞，作细胞计数，调整细胞浓度至2×106·ml-1。以上操作细胞均置于0-4℃。取96孔平底细胞培养板，每孔加入腹腔渗出细胞2×105，各组处理均作6平行孔，将培养板置于5％CO2、37℃水蒸气饱和的二氧化碳培养箱内孵育4小时后用37℃预温含2％NBS的Hanks液洗去未贴壁细胞，并加入适量的完全RPMI-1640培养液，在5％CO2、37℃水蒸气饱和的二氧化碳培养箱内培养24小时后，吸弃孔内培养基，每孔加入终浓度为0.075％的NR溶液100μl。37℃、5％CO2培养箱内孵育1小时。取出，甩弃NR溶液。用预温的PBS洗96孔细胞培养板3次，吸水纸吸干，加入细胞裂解液150μl，室温静置过夜后，于酶标仪上测定各孔在540nm的吸光度值(A540)。
5、鸡胚尿囊膜(Chick Chorioallantoic Membrane，CAM)实验将新鲜受精的白皮来航鸡种蛋，气室端朝上呈45℃角，置于37℃、60％湿度的恒温室中孵育，每日早晚各转动一次。孵育3天后，用甲醛稀释液(1∶4000)清洗外壳，空气晾干，75％酒精消毒鸡蛋外壳，之后水平静置数分钟，小心将鸡胚去壳放入直径10cm的平皿中，再加入含有青霉素和链霉素各100U·ml-1、10％NBS的1640培养液5ml，37℃、60％湿度、3％CO2孵箱中继续孵育3天。在体视显微镜下观察鸡胚的生长发育状况，取药膜(Whatman玻璃纤维滤膜制成2mm大小的膜片负载药物)置于生长良好的鸡胚尿囊膜的外1/3处，37℃、60％湿度、3％CO2孵箱中继续孵育48h，体视显微镜下观察药物对鸡胚尿囊膜新生血管生成的影响，并用数码照相机照像。
6、人脐静脉内皮细胞培养和细胞增殖实验取健康产妇分娩后3h以内的脐带(长度为20cm以上)，用I型胶原酶从脐带静脉中消化下内皮细胞，将细胞用含20％BCS、50μg·ml-1ECGS(内皮细胞生长支持物)、肝素(40u·ml-1)、胰岛素(0.4u·ml-1)和双抗的DMEM培养液重悬细胞，接种于明胶包被的塑料培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养，每48h换液一次。传代至3-4代的细胞用于实验。
用0.05％胰酶-0.02％EDTA消化收集细胞，用含20％BCS的DMEM调整细胞浓度至4×104·ml-1，铺于明胶包被的96孔培养板(0.1ml/孔)，37℃、5％CO2培养箱内培养24h后，吸弃培养液，加入含5％BCS的DMEM培养液配制的0、1μg·ml-1、10μg·ml-1、100μg·ml-1Gl-PP100μl，37℃，5％CO2共孵育48h，培养结束后采用MTT法检测细胞增殖。
7、统计学分析实验结果均以X±SD表示，采用SPSS 10.0统计软件进行统计。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学显著性分析，P值低于0.05为显著性差异。
三、实验结果1.Gl-PP整体给药对BALB/c小鼠S180肉瘤的抑制作用Gl-PP 50，100，200mg·kg-1可以显著抑制BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的生长，其抑制率分别为35.20％，45.25％，61.88％，详见表1。
表1.Gl-PP整体给药可抑制BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的生长组别 剂量 体重 瘤重 瘤重指数 抑制率(灌胃×10天)(g)(g) (％)NS -- 16.8±2.2 1.401±0.281 8.45±1.96Gl-PP(mg·kg-1) 50 16.6±2.0 0.908±0.387c5.47±2.40c35.20100 16.1±2.4 0.767±0.286c4.56±1.78c45.25200 16.4±1.9 0.534±0.205c3.21±1.03c61.88瘤重指数＝肿瘤重量/体重(g/g)×100，n＝10，X±S与NS组比较，cP＜0.01。
2.Gl-PP体外给药对人肺癌PG细胞增殖的作用Gl-PP在体外对人肺癌PG细胞增殖无显著抑制作用(p＞0.05)；然而，Gl-PP(50，100，200mg·kg-1)含药血清可以显著抑制PG细胞增殖，抑制率分别是22.54％，26.76％，30.28％，见表2。
表2.体外Gl-PP和Gl-PP含药血清对人肺癌PG细胞增殖的影响组别剂量吸光度值(OD 540nm)RPMI1640-- 0.123±0.009Gl-PP 0.1 0.113±0.015(μg·ml-1)1.0 0.120±0.01410.00.122±0.014100.0 0.119±0.008NS含药血清 -- 0.142±0.024Gl-PP含药血清 50.00.110±0.013b
(mg·kg-1) 100.00.104±0.015b200.00.099±0.021c因此，不同剂量的Gl-PP对人肺癌PG细胞的增殖无直接抑制作用，然而Gl-PP含药血清可明显抑制PG细胞的增殖。
n＝6，X±S，与NS含药血清组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。
3.Gl-PP整体给药对BALB/c裸鼠人肺癌PG肿瘤的抑制作用移植人肺癌PG细胞的裸鼠每天一次灌胃给予50，100，200mg·kg-1Gl-PP，从第11天起，每隔3天测量1次裸鼠的肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察Gl-PP对肿瘤生长的影响。n＝5，X±S结果，Gl-PP 50，100，200mg·kg-1可以显著抑制BALB/c裸鼠异种人肺癌PG肿瘤的生长，其抑制率分别55.47％，46.04％，46.79％，见图1和表3。
表3.Gl-PP整体给药对BALB/c裸鼠异种人肺癌PG的抑制作用组别 剂量 体重 瘤重 瘤重指数 抑制率(灌胃×32天) (g) (g)(％)NS --24.43±1.74 2.65±0.823 10.90±3.52Gl-PP(mg·kg-1) 5024.46±1.58 1.18±0.556c4.88±2.52c55.47100 22.71±1.54 1.43±0.712c 6.26±3.23c 46.04200 22.09±2.50 1.41±0.652c 6.40±2.93c 46.79n＝5，X±S，与NS组比较，cP＜0.014.Gl-PP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管形成的影响为了测试Gl-PP在体内对新生血管形成的影响，应用了鸡胚尿囊膜(CAM)实验。观察到80μg Gl-PP/药膜或10μl Gl-PP(50mg·kg-1)-含药血清/药膜组可明显减少药膜周围的微血管，有潜在的抑制新生血管形成作用，见图2(对照)、图3(Gl-PP50mg·kg-1组含药血清)和图4(Gl-PP)。n＝5，数码相机拍照记录。
结果Gl-PP50mg·kg-1组含药血清(10μl/药膜)或Gl-PP(80μg/药膜)作用CAMs48h，CAMs药膜周围的新生微血管减少或被阻断。
5.Gl-PP体外给药对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响Gl-PP(1，10，100μg·ml-1)在体外对HUVEC的增殖有直接抑制作用，抑制率分别是9.41％，15.63％，和40.44％，见图5。
n＝6，X±S与对照组比较，cP＜0.01。
实施二，灵芝多糖蛋白对人肺癌细胞侵袭的影响一、实验的材料1.药品和试剂灵芝多糖蛋白(Ganoderma lucidumpolysacnaride peptide，Gl-PP)由上文实施例1到最佳实施例所示方法而获得。MTT、明胶为Sigma公司产品，层粘连蛋白(LN)购自北京大学医学部细胞生物系，RPMI-1640培养液为Gibco公司产品，Access RT-PCR system试剂盒为Promega公司产品，其余为国产分析纯试剂。
2.细胞培养人高侵袭性肺癌细胞系PG购自北京大学医学部基础医学院病理学系。PG细胞用含10％FCS的RPMI-1640培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
二、实验的方法1.细胞运动实验 根据Birch等的方法改进。PG细胞接种于24孔板，每孔5×104个细胞，培养24h细胞基本长满后划痕，3复孔，用无血清RPMI-1640洗细胞一遍，加入含5％FCS的RPMI-1640配制的0、50、200ug·ml-1Gl-PP。分别于24h、48h、72h和96h动态观察细胞的迁徙能力，拍照记录。
2.细胞粘附实验96孔细胞培养板中，每孔加入层粘连蛋白(LN)溶液20μl(含LN 2μg)，室温干燥后，用含1％BSA的RPMI-1640培养液100μl 4℃封闭过夜，用前各孔用PBS洗3遍。含5％FCS的RPMI-1640配制的0、50、100、200μg·ml-1Gl-PP作用48h的PG细胞，用0.125％胰酶消化、收集，用含0.1％BSA的无血清RPMI-1640培养液调整细胞至8×105/ml，每孔加入100μl。37℃，5％CO2孵育2h，用PBS洗去未粘附细胞，每孔加入100μl无血清RPMI-1640培养液溶解的MTT，于培养箱中继续孵育4h，酶标仪540nm处测定吸光度值(OD)。
3.金属蛋白酶活性分析(Zymography)用0.125％胰酶消化对数生长期PG细胞，用含10％FCS的RPMI-1640培养液调整细胞至5×104/ml，24孔培养板每孔加入500μl，37℃，5％CO2孵育24h。吸弃培养液，加入含5％FCS的RPMI-1640配制的0、50、100、200μg·ml-1Gl-PP 500μl，37℃，5％CO2共孵育48h。以无血清RPMI-1640洗一次，每孔加入200μl无血清RPMI-1640共孵育16h，收集上清，2,000r·min-1离心5min去细胞碎片，将上清置于-70℃冻存备用。Bio-Rad蛋白定量，5μg条件培养基于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(含1.0g·L-1明胶)电泳后，凝胶于2.5％(体积分数)TritonX-100中浸泡振摇1h，中间换液1次，明胶酶缓冲液(50mmol·L-1Tris，10mmol·L-1CaCl2，200mmol·L-1NaCl，1μmol·L-1ZnCl2，PH7.5)中37℃孵育18-24h，考马斯亮蓝R250染色，脱色后，扫描保存。
4.RNA提取和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)0、50、100、200μg·ml-1Gl-PP作用48h的PG细胞，用0.125％胰酶消化、收集，用DEPC处理的PBS洗细胞1次，总RNA提取按TRIzol Reagent RNA提取试剂盒(Gibco BRL)说明书操作。PG细胞中MMP-9的mRNA的表达用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，按Access RT-PCR system(Promega)试剂盒说明书进行。GAPDH作为内参照。MMP-9、GAPDH引物设计参阅文献，由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列、扩增片断长度(base pair，bp)及PCR扩增程序见表4。取PCR产物6μl进行琼脂糖凝胶电泳，Gel Doc 2000(Bio-Rad公司)凝胶成像分析系统成像、密度扫描及Quantity One软件分析各目的条带的灰度值，以各样品的GAPDH为对照计算相对表达强度。
表4用于半定量RT-PCR人引物序列PCR基因 基因号上游引物序列 下游引物序列产物MMP-9 NM_004994 ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC GAAGGGGAAGACGCACAGCT 552bpGAPDH M33197 GCCAAGGTCATCCATGACAACGTCCACCACCCTGTTGCTGTA 498bp
所有计量资料采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，实验数据均以X±SD表示。
三、结果1.细胞运动实验0，50，200μg·L-1的Gl-PP与人肺癌PG细胞共同培养48h、72h、96h，结果可见对照组人肺癌PG细胞运动生长活跃，铺展良好；而PG细胞经不同浓度Gl-PP作用后，运动能力明显下降，细胞向划痕处爬行的速度明显慢于对照组，给药组PG细胞运动生长受抑，并呈一定的剂量效应。在Gl-PP与PG细胞共培养96h时，还可见细胞的粘附性下降，有部分细胞漂浮，见图6(400×)。
2.细胞粘附实验0，50，100，200μg·L-1的Gl-PP与人肺癌PG细胞共同培养48h，对基底膜成分LN的粘附有一定的抑制作用，抑制率分别为3％、24.17％和17.85％，见表5。
表5.体外Gl-PP可抑制人肺癌PG细胞的粘附性(n＝6，X±SD)组别 剂量(μg ml-1) 吸光度值(OD 540nm)RPMI1640 --0.633±0.0275Gl-PP 500.614±0.0269100 0.480±0.0153**200 0.520±0.0181**Gl-PP与对照组比较，**P＜0.01{抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％}3.金属蛋白酶活性分析0，50，100，200μg·L-1的Gl-PP与人肺癌PG细胞共同培养48h，结果显示Gl-PP可降低人肺癌PG细胞的金属蛋白酶MMP9的活性，100μg ml-1Gl-PP对MMP-9活性抑制率可达41.53％。(见图7，表6)表6.体外Gl-PP抑制人肺癌PG细胞MMP9的活性(n＝3，X±SD)组别 剂量(μg ml-1) MMP9灰度值
RPMI1640-- 44.358±5.2805Gl-PP 50 29.707±3.9040**100 25.936±3.0444**Gl-PP与对照组比较，**P＜0.01。
4.MMP-9 RT-PCR0，50，100，200μg·L-1的Gl-PP与人肺癌PG细胞共同培养48h，结果显示Gl-PP有降低人肺癌PG细胞的金属蛋白酶MMP-9的mRNA表达的趋势，200μg·L-1Gl-PP降低人肺癌PG细胞的金属蛋白酶MMP-9的mRNA表达有显著性(图8，表7)。
表7.体外Gl-PP(μg.ml-1)抑制人肺癌PG细胞mRNA的表达组别 剂量(μg.ml-1)MMP9灰度值比率(％)RPMI1640 -- 67.636±4.7664Gl-PP 50 62.277±5.091210056.671±6.659820039.221±7.6621**Gl-PP与对照组比较，**P＜0.01(n＝3，X±SD)结论1.本实验结果显示人肺癌PG细胞经不同浓度Gl-PP作用后，运动能力明显下降，细胞向划痕处爬行的速度明显慢于对照组。
2.本实验显示PG细胞经不同浓度Gl-PP作用后，粘附性有一定程度的下降。说明抑制肿瘤细胞的粘附性，可降低其侵袭能力，防止肿瘤转移。
3.经不同浓度Gl-PP作用于人肺癌PG细胞后，金属蛋白酶MMP9的活性及mRNA的表达均有一定的降低。
综上所述，Gl-PP可作用于肿瘤细胞侵袭过程中运动、粘附、基质金属蛋白酶等多个环节，对肿瘤细胞的侵袭有一定的抑制效应。
权利要求
1.灵芝多糖蛋白Gl-PP，其特征在于，其以灵芝为原料母体提取提取液，将提取液浓缩后，经超滤或透析而截留高分子量的多糖蛋白而获得。
2.根据权利要求1所述的灵芝多糖蛋白Gl-PP，其特征在于，该多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其重均分子量Mw为4()～60万。
3.根据权利要求1所述的灵芝多糖蛋白Gl-PP，其特征在于，多糖蛋白组分由D-葡萄糖、D-半乳糖、果糖、D-木糖、D-鼠李糖组成。
4.根据权利要求1所述的灵芝多糖蛋白Gl-PP，其特征在于，多糖蛋白中的单糖主要以β-型糖苷键连接，另有少数量以α-糖苷键连接。
5.灵芝多糖蛋白Gl-PP的制备方法，其特征在于，1)提供一种灵芝作为原料母体，清洗，干燥，2)破碎该原料母体而得破碎物，3)用乙醇回流破碎物后干燥而得干燥物，4)将干燥物用水提取而得提取液，比例为干燥物∶水＝1∶10～15，5)将提取液静置过滤，获取滤液并浓缩至浓缩液中生药∶水＝1∶5左右时作为粗浓缩液，6)提供一种澄清剂，7)在粗浓缩液中加入澄清剂，搅拌静置加热，并进行固液分离得到提取澄清液；8)将提取澄清液进行超滤处理，截留分子量6000以上的多糖蛋白而成超滤液，9)将超滤液浓缩至含生药量0.5～1.5g/ml的超滤浓缩液后加入乙醇进行沉淀，离心分离后取沉淀物低温干燥至干，即得灵芝多糖蛋白。
6.根据权利要求5所述的灵芝多糖蛋白的制备方法，其特征在于，将灵芝子实体破碎成烟丝状。
7.根据权利要求5所述的灵芝多糖蛋白的制备方法，其特征在于，用水提取的步骤可以具体为二次提取，第一次提取时间为2.5小时，第二次1.5小时。
8.根据权利要求5所述的灵芝多糖蛋白的制备方法，其特征在于，对提取液进行浓缩的设备或为转速控制在90～100r/min的旋转蒸发仪，或为真空浓缩锅。
9.根据权利要求5所述的灵芝多糖蛋白的制备方法，其特征在于，在粗浓缩液中加入澄清剂，搅拌静置加热，并进行固液分离得到提取澄清液的具体步骤为1)提供一种ZTC-II天然澄清剂，2)澄清剂分A组分与B组分，配制时A组分加水配A溶液，B组分加1％醋酸溶液配成B溶液，3)将提取液浓缩到生药∶水＝1∶5左右时，按0.2～0.4％加入B溶液，每20分钟搅拌一次，2h后用同样方法加入0.1～0.2％的A溶液，加料30～60分钟再搅拌一次，2h后粗过滤，静置过夜，滤过为澄清液。
10.根据权利要求5所述的灵芝多糖蛋白的制备方法，其特征在于，将提取澄清液进行超滤处理的具体步骤可以为1)提供一种超滤装置为CLW型的组件，该组件以中空纤维超滤膜、泵、管道、阀门、压力表和预处理装置组成，开机前将溶液阀及超滤液阀打开，然后启动泵，待组件充满溶液后，逐步调整溶液阀，并观察压力表至工作压力0.1～0.2mpa，保持该压力值，2)将提取澄清液通过该超滤装置，截留分子量6000以上的多糖蛋白而成超滤液。
11.根据权利要求5所述的灵芝多糖蛋白的制备方法，其特征在于，超滤浓缩液用乙醇沉淀的具体步骤为用三倍量于超滤浓缩液的95％乙醇洗涤、搅拌超滤浓缩液2～3次，离心分离后取沉淀物在5℃干燥至干即得灵芝多糖蛋白。
12.灵芝多糖蛋白Gl-PP应用于制备抗肿瘤作用的药物，其特征在于，其包含有有效剂量的高分子灵芝多糖蛋白，该灵芝多糖蛋白系以灵芝为原料母体提取提取液，将提取液浓缩后，经超滤或透析而截留高分子量的多糖蛋白而获得。
13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于，该多糖蛋白呈黄褐色至褐色粉末状，其重均分子量Mw为40～60万。
14.根据权利要求12所述的药物，其特征在于，该灵芝多糖蛋白Gl-PP应用于抑制BACB/C小鼠体内S180肉瘤的生长，及应用于抑制BALB/c裸鼠异种抑制物人肺癌PG肿瘤的生长，或含该灵芝多糖蛋白Gl-PP的血清应用于抑制人体的肺癌PG细胞的生长。
15.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，该灵芝多糖蛋白GL-PP对人的肺癌PG细胞作用后，肺癌细胞的运动能力明显下降。
16.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，该灵芝多糖蛋白GL-PP对人的肺癌PG细胞作用后，肿瘤细胞的粘附性有一定程度的下降，降低其侵袭能力，防止肿瘤转移。
17.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，灵芝多糖蛋白Gl-PP作用于人肺癌PG细胞后，金属蛋白酶MMP9的活性及mRNA的表达均有一定的降低。
18.根据权利要求14所述的药物，其特征在于，通过鸡胚尿那囊膜实验显示(CAM)，灵芝多糖蛋白Gl-PP或含灵芝多糖蛋白Gl-PP的血清在CAM试验中，明显抗新生血管的形成。
全文摘要
本发明涉及一种含有5至20个氨基酸的肽，特别涉及一种从灵芝中提取而获得的灵芝多糖蛋白G1－PP，其以灵芝为原料母体提取提取液，将提取液浓缩后，经过超滤或透析而截留高分子量的多糖蛋白而获得。还涉及该灵芝多糖蛋白可工业化生产的制备方法及该灵芝多糖蛋白G1－PP应用于制备抗肿瘤作用的药物。本发明可以获得一种高分子量、药用价值高的灵芝多糖蛋白，且提供一种可以工业化生产高分子灵芝多糖蛋白的制备方法，该制备方法成本低、提取率高、提取纯度高，而所获得的灵芝多糖蛋白可以通过抑制肿瘤血管的新生及抑制癌细胞的侵袭而抑制肿瘤的生长，抑制效果好，为一种新型的抗肿瘤药物。
文档编号A61K38/16GK1629186SQ20041001468
公开日2005年6月22日 申请日期2004年4月14日 优先权日2004年4月14日
发明者林志彬, 林树钱, 王赛贞, 吕松涛, 曹琦珍 申请人:福州绿谷生物药业技术研究所, 林志彬, 林树钱, 王赛贞, 吕松涛, 曹琦珍