专利名称：一种抗炎抗渗出药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物，特别是涉及一种由角质细胞生长因子制成的外用制剂。
背景技术：
中国专利ZL9103226.8公开了“一种低毒的抗炎抗渗出的药物组合物”，它含有下列结构式I表示的β-七叶皂甙(1)或用下列结构式II表示的β-七叶皂甙(2)或它们的混合物作活性成分和/或药学上可接受的附加剂。中国专利申请99815996.4公开了一种“低毒的抗炎抗渗出药物组合物”，它含有通式I的七叶皂甙和通式工工七叶皂甙作活性成分及药学上可接受的附加剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种专用于抗炎抗渗出的药物。
本发明所述的抗炎抗渗出药物是由药用有效量的角质细胞生长因子2和余量的药用辅料制成的水凝胶剂。
本发明所述的角质细胞生长因子2(KGF-2)是KGF2-Δ33，其药用有效量为1ug-40mg/ml；另外一个可选择的范围是1-18ug/ml。
本发明所述的抗炎抗渗出药物是一种外用制剂，具体的说是一种水凝胶剂。主要用于软组织创伤或溃疡中的炎症和渗出，其作用是抗炎、减少渗出，促进渗出液吸收。本发明的药物作为局部外用药施用时，角质细胞生长因子2的剂量为每平方厘米0.1ug至9mg。
本发明所述的角质细胞生长因子2(KGF-2)在现有技术中已有过报道，但本发明所披露的抗炎、抗渗出还未见报道。很多疾病都伴随着体液渗出，如烧伤患者，尤其是I度烧伤和II度烧伤患者；软组织创伤或溃疡患者等。烧伤除损伤的一般反应外，无论烧伤的深浅或面积的大小，伤后迅速发生的变化为体液的渗出。在较小面积的浅度烧伤，体液的渗出主要表现为局部的组织水肿。当烧伤面积大时，体液迅速丧失可致休克。导致体液渗出的主要病理生理变化为烧伤区及其周围或深层组织的毛细血管扩张和通透性增加，大量血浆样液体自血液循环渗入组织间隙形成水肿或自创面渗出，因而丧失了大量的水分、钠盐和蛋白质。在I度烧伤，主要是血管扩张，皮肤发红和疼痛，水肿较少。在II度烧伤，烧伤区及其周围发生水肿，烧伤越深则水肿越重，并在表皮与真皮间形成水疱。III度烧伤创面无渗液，但烧伤区及其周围水肿一般比II度重。
体液渗出持续时间一般为36-48小时，在严重烧伤时可延至72小时，随后血液动力学方面趋于稳定，毛细血管通透性大都逐渐恢复正常。但含大量蛋白的渗出液为细菌提供了良好的繁殖条件，容易引发并发感染，影响伤口愈合。因而毛细血管内液外渗的防治在烧伤治疗中具有重要意义。伤后应尽早阻断毛细血管内液外渗，一方面可防止烧伤水肿发生，有利于创面的早期处理。另一方面可阻止机体有效血容量减少和大面积烧伤患者发生休克。烧伤后毛细血管通透性升高由许多血管活性物质和炎症介质介导，因此目前抗渗出药物的类型主要是炎症介质阻断剂和信号转导阻断剂。
角质细胞生长因子2能促进烧烫伤动物模型创面愈合，KGF2的这种治疗作用虽与其促上皮细胞(特别是角质细胞)增殖作用有关，但对抗炎抗渗出的作用不能全用其促上皮增殖作用来解释，而可能与毛细血管通透性的调节和炎症介质的调节密切相关。在对与KGF2高度同源的KGF蛋白的研究中发现，KGF除具上皮细胞增殖作用外，还能增强毛细血管屏障功能，增强毛细血管对损伤的耐受力(Barton CC.et.al.Toxicology，143167-181，2000；Gillis P，et.al.J Cell Sci.1122049-2057，1999)，KGF还促细胞因子和生长因子的释放，这些因子以自分泌或旁分泌的方式发挥保护作用(Dlugosz AA，et.al.Cell GrowthDiffer 51283-1292，1994；Haddad IY，et.al.Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol 277L391-L400，1999；Ware LB，et.al.FASEB J 12A778，1998；Yi ES，et.al.Inflammation 22315-325，1998)。目前还没有类似的文章表明KGF2具有与KGF相似的上述功能(增强毛细血管屏障功能，增强毛细血管对损伤的抵抗力以及促细胞因子和生长因子释放)，但基于KGF2和KGF的高度同源性，以及目前发现它们具有共同受体，可以推测KGF2也具有类似的功能，在一定程度上可以解释KGF2的这种在动物实验中的抗炎抗渗出作用。KGF-2的这种抗炎抗渗出作用有潜在的临床应用价值，特别是针对多种原因导致的I度烧伤和II度烧伤患者，以及其它有渗出炎症反应的软组织创伤或溃疡患者。
重组角质细胞生长因子2抗炎抗渗出活性研究一、大鼠足肿胀实验选用健康雄性SD大鼠，体重220±10g，随机分成三组，每组10只，每只大鼠右后肢以硫化钡糊剂脱毛，用排水法测定右足踝关节以下足容积，然后在乙醚浅麻醉下将已脱毛的大鼠右后足置入60℃的温水中(温差±0.5℃)浸烫30sec，烫伤后立即涂抹给药，治疗组给予重组角质细胞因子凝胶剂50ul(含KGF2-Δ33蛋白10ug)，基质对照组给予凝胶剂50ul(不含KGF2-Δ33)；空白对照组不给任何药物，连续给药3d，并于给药后6h测定右后肢踝关节以下容积，将其容积减去烫伤前足容积，作为烫伤后的足肿胀度，结果见表1。
表1重组角质细胞因子2对大鼠实验性烫伤足肿胀的影响
结果表明，重组角质细胞生长因子对大鼠实验性烫伤后不同时间的足肿胀均有明显的抗渗出，与对照组比较有显著差异，(P＜0.05，或P＜0.01)，而基质组与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
二、小鼠烫伤创面组织含水量实验选取健康雄性昆明小鼠75只，体重20±3g，小鼠在乙醚浅麻醉下将右侧后肢浸泡于60℃热水中烫30sec，造成II度烫伤。烫伤后立即按上述给药25ul，24h后用剪刀自膝关节平面切下右下肢，立即用分析天平称量湿重，然后放入烤温箱内，在100℃烤箱16h后称干重，按公式(每克组织含水量＝(组织湿重-组织干重)/组织干重)求出每克组织含水量，结果见表2。结果表明，重组角质细胞生长因子2能明显减少小鼠实验性烫伤创面组织含水量，与对照组比较差异有非常显著性P＜0.05，基质组与对照组比较差异无显著性。
表2重组角质细胞因子2对小鼠创面组织含水量的影响
三、小鼠腹腔皮肤毛细血管通透性实验昆明种小鼠30只，体重20g～22g，雌雄各半。分成三个实验组。用硫化钡糊剂将动物背部脱毛，脱毛面积为体表总面积的10％，然后分别皮肤用药(每次用药总量为KGF2-Δ3320ug)，连续用药3d。在末次给药30min后，尾静脉注射1％伊文斯蓝0.1ml，腹腔注射0.7％醋酸生理盐水2ml，取腹腔液1.5ml，测定OD590值，用OD590值衡量动物腹腔渗出液的伊文斯蓝染料的含量，推测动物毛细血管的通透性。结果如表3。结果表明，应用重组角质细胞因子2的动物腹腔毛细血管通透性明显降低，伊文斯蓝渗出明显减少，与正常对照组比较P＜0.01，表明重组角质细胞因子2具有明显的抗渗出作用。
表3重组角质细胞因子2对小鼠毛细血管通透性的影响
图1是实施例中编码KGF2-Δ33的DNA序列。
图2是实施例中所述的重组表达质粒pTrcKGF2的示意图。
图3是实施例中由所述方法制备得到的重组KGF2-/Δ33蛋白的细胞活性。
图4是实施例中重组KGF2凝胶剂在4℃保存6个月后凝胶剂的细胞活性。
具体实施例方式
通过下述实施例详细描述本发明。
实施例1、重组KGF2-A33蛋白的制备行包皮切除手术组织得到表皮，用QIAGEN公司的oligotex Direct mRNA MicroKit提取其mRNA，用大连宝生物公司的BcaBestTMRNA Kit Verl.1，以oligodT作引物扩增第一链，以引物(K2F5’CATATGACCTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACA，K2R5’GTCGACTTACTATGAGTGTACCACCATTGGAAG)扩增得到KGF2 cDNA，克隆入宝生物公司的pMT18载体，转化大肠杆菌DH5alpha，用蓝白斑筛选结合PCR法筛选得阳性克隆，提取质粒并测序证实。用表达引物K2P3(5’TACATATGAGTTATAATCACCTTCAAGGAGAT)和K2R作引物扩增得到目的片断，克隆入pMT18载体，筛选得阳性克隆，提取质粒，用NdeI/SalI双酶切得到目的基因片断，表达载体pThioHisA(invitrogen)用NdeI/SalI双酶切后回收大片断，与目的基因片断连接，转化入大肠杆菌，筛选得到阳性克隆克隆，提取表达质粒pTrcKGF2并测序证实，序列如图1，表达质粒pTrcKGF2示意图如图2所示。
将表达质粒pTrcKGF2转化入大肠杆菌BL2(DE3)或BL2(DE3)placI后，用合适培养基在适当培养条件下培养至一定菌浓度，加入一定浓度的诱导剂IPTG诱导表达，表达一段时间后离心收菌，悬浮于适当的缓冲液中用超声破碎等方法破碎后离心去除沉淀，将上清过肝素亲和层析柱，然后用含一定NaCl浓度的缓冲液洗脱得到重组KGF2-Δ33。所得重组KGF2-Δ33因在大肠杆菌中表达的缘故，有可能在其N端加了一个甲硫氨酸。
用原代培养的人角质细胞测定重组KGF2-Δ33蛋白的效价。取手术后包皮组织，剪成小片，用dispase酶消化，分离出表皮，表皮再用trypsin消化，然后用soybean trypsin inhibitor终止消化，离心收集，用completed k-SFM(invitrogen公司)培养至长满60％培养瓶以上。消化后在96孔培养板中每孔接种1000-2000细胞，用completed k-SFM培养24小时或更长，用K-SFM洗一至两次，然后用K-SFM培养24小时，然后换成加有不同浓度重组KGF2的培养基，继续培养2-3天，然后加入含10％alamarBlue(Biosource公司)的K-SFM培养直至颜色改变，测OD570和OD630值。测得的EC50与文献报道的基本相同，如图3所示。
2、重组角质细胞生长因子2水凝胶剂的制备及其稳定性实验将重组KGF2-Δ33蛋白原液过滤除菌，调整至合适浓度，加入赋形剂、保护剂、缓冲液等，得到重组角质细胞生长因子2水凝胶剂型，分装后置4℃保存。以下药物组合在4℃放置6个月，其活性未见变化，如图4所示。我们实验中发现当KGF2多肽浓度在1-18ug/ml时，更佳的在10ug/ml时，其水凝胶剂型有很好的稳定性。在临床上作为局部外用药能起到很好的治疗作用，安全性更高。
一种重组角质细胞生长因子2水凝胶剂的组成成份(重量百分比)(a)10ug/ml KGF2-Δ33(b)1.25％羧甲基纤维素钠(c)7％蔗糖(d)1％甲硫氨酸(e)125mM氯化钠(f)1mM EDTA(四乙基乙二酸钠盐)(g)0.01％Tween 80(吐温80)(h)20mM柠檬酸钠)(i)0.08％甲基对羟基苯甲酸酯和0.02％丙基对羟基苯甲酸酯或0.1％三氯叔丁醇(j)水(k)pH6.1。
权利要求
1.一种抗炎抗渗出药物，其特征在于是由药用有效量的角质细胞生长因子2和余量的药用辅料制成的水凝胶剂。
2.按照权利要求1所述的抗炎抗渗出药物，其特征在于所述的角质细胞生长因子2含量为1ug-40mg/ml。
3.按照权利要求1所述的抗炎抗渗出药物，其特征在于所述的角质细胞生长因子2含量为1-18ug/ml。
4.按照权利要求1所述的抗炎抗渗出药物，其特征在于其包含以下重量百分比的成分(a)1-18ug/ml KGF2-Δ33(b)1.25％羧甲基纤维素钠(c)7％蔗糖(d)1％甲硫氨酸(e)125mM氯化钠(f)1mM四乙基乙二酸钠盐(g)0.01％ 吐温80(h)20mM柠檬酸钠(i)0.08％甲基对羟基苯甲酸酯和0.02％丙基对羟基苯甲酸酯或0.1％三氯叔丁醇(j)水。
全文摘要
本发明涉及一种药物，特别是涉及一种由角质细胞生长因子制成的外用制剂。本发明所述的抗炎抗渗出药物是由药用有效量的角质细胞生长因子2和余量的药用辅料制成的水凝胶剂。所述的角质细胞生长因子2(KGF－2)是KGF2－Δ33，其药用有效量为1ug－40mg/ml；另外一个可选择的范围是1－18ug/ml。本发明所述的抗炎抗渗出药物是一种外用制剂。主要用于软组织创伤或溃疡中的炎症和渗出，其作用是抗炎、减少渗出，促进渗出液吸收。本发明的药物作为局部外用药施用时，角质细胞生长因子2的剂量为每平方厘米0.1ug至9mg。
文档编号A61K38/18GK1704116SQ20041002264
公开日2005年12月7日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者赵彬, 赵晶 申请人:昆明滇虹药业有限公司