专利名称：一类海芒果苷衍生物、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是一类从中国红树林植物海芒果中分离得到新的强心苷类衍生物和它们的制备方法和用途。该类化合物对多种肿瘤细胞株具有较强的抑制作用，可作为治疗各种临床常见多发癌症的药物，也可作为一类研制新的抗肿瘤药物的先导化合物。
背景技术：
海芒果(Cerbrta manghas L.)属于夹竹桃科(Apocynaceae)，海芒果属(Cerbera)，别名山样子，为小乔木，高达6米，常生于海边湿润的地方，可作防潮树种，分布于广东和台湾，亚洲和澳大利亚的热带地区。海芒果的果实有剧毒，以核仁最毒，含毒成分为氢氰酸和海芒果苷，树皮、叶和乳汁有催吐、下泻的药用效果。
国内外对海芒果化学成分的研究发现其主要含有强心苷、环烯醚萜苷、黄酮苷、木脂素及降单萜类成分。其中强心苷是治疗心力衰竭不可缺少的重要药物，临床上用以治疗心力衰竭及节律障碍等心脏疾患。但自海芒果中分离得到的强心苷未见有抑制肿瘤细胞活性的报道。
本发明从红树林植物海芒果中分离得到一个新的强心苷类衍生物海芒果苷，同时将海芒果苷经乙酰化和对溴苯甲酰化反应后分别得到其乙酰化物、对溴苯甲酰化物两个衍生物，经对多种肿瘤细胞株的测试，海芒果苷和此二种化合物均显示有很好的活性。
发明内容
本发明的目的在于公开一类海芒果苷类衍生物；本发明的另一目的是提供一类海芒果苷类衍生物的制备方法；本发明的再一目的是提供一类海芒果苷类衍生物的医药用途。
本发明提供如下通式的海芒果苷类衍生物
其中R＝OH、OAc或对溴苯甲酰基。
本发明还提供上述通式化合物的制备方法，该方法包括如下步骤(1)将红树林植物海芒果茎杆干燥粉碎后用C1-C3低级醇浸提三次，每次浸提时间为7-10天，合并醇浸提液，减压蒸去溶剂得醇浸提物，醇浸提物用H2O溶解，再分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，分别蒸干溶剂得石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶部分。
(2)正丁醇部分经过硅胶(100-200目)柱层析，用氯仿/甲醇95∶5-50∶50梯度洗脱，再经过反复硅胶柱层析、吡啶/醋酐(1∶1)搅拌反应12小时处理，上硅胶(200-300目)柱，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，石油醚/氯仿/甲醇(1∶1∶1)为流动相分别收集Rf＝0.5(展开剂petroleum/EtOAc 1∶1)部分得到R＝OH的强心苷类衍生物海芒果苷。
(3)海芒果苷与吡啶/醋酐反应，得到R＝OAc的强心苷乙酰化物。海芒果苷与1∶1的无水吡啶和醋酐在搅拌器上搅拌10-30h，减压除去吡啶和醋酐，得到R＝OAc的通式化合物。
(4)海芒果苷与对溴苯甲酰氯反应，得到R为对溴苯甲酰的强心苷对溴苯甲酰化物。海芒果苷与对溴苯甲酰氯反应(克分子比为1∶0.8-1.5)溶于重蒸二氯甲烷与等体积的三乙胺中，再加4-二甲氨基吡啶适量，于室温下搅拌过夜即得到R为对溴苯甲酰基的通式化合物。
本发明对通式化合物进行了抗肿瘤活性测试，经试验表明该类化合物具有明显的抗肿瘤作用。
测试原理MTT法[徐叔云，卞如濂，陈修 主编。药理试验方法学(第三版)。北京人民卫生出版社，2002，1785-1786]按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液(5mg/ml，用生理盐水配制)20μl/孔，继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/L HCl)50μl/孔，于CO2培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。
观测指标观测指标按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率，半数抑制量IC50值采用Logit法计算。
实验结果的评判与解析
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
NMR用Bruker-DRX400核磁共振仪测定。ESIMS用Finnigan-MAT-95质谱仪测定。柱层析硅胶、薄层硅胶板均为青岛海洋化工有限公司生产。所使用的Sephadex LH-20为E.Merk公司生产，试剂均为上海振兴化工一厂产品。
实施例一化合物海芒果苷的制备(1)提取采于我国广西北海的海芒果茎杆3.0kg干燥粉碎后用甲醇浸提三次，每次浸提时间为7-10天，合并甲醇浸提液，减压蒸去甲醇，得甲醇浸提物，甲醇浸提物用H2O溶解，再分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，分别蒸干溶剂得石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶部分。
(2)正丁醇部分(100g)经过硅胶(100-200目)柱层析，用氯仿/甲醇95∶5-50∶50梯度洗脱，500ml/份，共收集70份，经薄层层析检测后合并为8个部分，分别减压浓缩，取第四个部分(7.5克)又经硅胶(200-300目)柱层析，用氯仿/甲醇98∶2-90∶10梯度洗脱，分为F41-F45五个部分分别浓缩，F44部分(2.3g)又经硅胶(200-300目)柱层析，用氯仿/甲醇95∶5-90∶10梯度洗脱，得F441-F443三个部分，F442(480mg)经醋酐和吡啶(1∶1)搅拌反应12小时后上硅胶(200-300目)柱，用石油醚/乙酸乙酯90∶10-50∶50梯度洗脱，将TLC测定显示相同部分合并为三个组分，其中F4423(36mg)经Sephadex LH-2柱层析流动相为石油醚/氯仿/甲醇(1∶1∶1)]，减压浓缩所得组分再经硅胶柱层析，以CHCl3/MeOH 99∶1-98∶2梯度洗脱，展开CHCl3/MeOH 98∶2，得R＝OH通式化合物15mg。该化合物为首次从我国广西海芒果中提取分离得到，故命名为海芒果苷。
海芒果苷的理化性质如下无色油状物，易溶于氯仿、丙酮；ESIMS显示分子离子峰901[M++Na]；其1H NMR(CDCl3，400MHz)数据，δ0.90(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，1.25(3H，d，J＝6.2 Hz，H-6’)，2.02，2.04，2.06，2.07(each 3H，s，4×OAc)，2.80(1H，t，J＝8.6Hz，H-17)，3.20(1H，d，J＝5.9Hz，H-7)，3.33(1H，t，J＝9.4Hz，H-4’)，3.52(3H，s，3’-OMe)，3.71(1H，t，J＝9.4Hz，H-3’)，4.10(1H，dd，J＝12.3，2.3Hz，H-6”a)，4.20(1H，dd，J＝12.3，5.5Hz，H-6”b)，4.55(1H，d，J＝7.6Hz，H-1”)，4.60(1H，dd，J＝3.9，9.9Hz，H-2’)，4.77(1H，dd，J＝18.0，1.7Hz，H-21a)，4.93(1H，dd，J＝18.0，1.5Hz，H-21b)，4.98(1H，t，J＝9.9Hz，H-4”)，5.02(1H，d，J＝3.7Hz，H-1’)，5.12(1H，t，J＝9.6Hz，H-3”)，5.87(1H，t，J＝1.5Hz，H-22).13C NMR(CDCl3，100MHz)数据，δ173.9(s，C-20)，173.3(s，C-23)，170.3，170.2，169.7，169.4(each s，4×OCOCH3)，117.7(d，C-22)，104.4(d，C-1”)，93.4(d，C-1’)，83.2(d，C-3’)，80.9(s，C-14)，80.4(d，C-3”)，74.6(d，C-2”)，74.3(d，C-4’)，73.3(t，C-21)，73.1(d，C-4”)，72.1(d，C-21)，71.8(d，C-3)，68.5(d，C-5”)，66.4(d，C-5’)，63.9(s，C-8)，62.3(t，C-6”)，60.9(q，3’-OCH3)，52.2(s，C-13)，51.1(d，C-7)，50.6(d，C-17)，41.0(t，C-12)，34.5(t，C-15)，33.9(s，C-10)，33.7(d，C-5)，32.4(t，C-4)，31.6(d，C-9)，31.4(t，C-1)，28.4(t，C-16)，27.9(t，C-6)，27.1(t，C-2)，24.4(q，C-19)，21.0，21.0，20.8，20.8(each q，4×OCOCH3)，20.5(t，C-11)，17.4(q，C-6’)，17.2(q，C-18).
参照文献[1，Abe F.，Yamauchi T.Chem.Pharm.Bull.，1977，25(10)2744-2748；2，Yamauchi T.，Abe F.，Wan A.S.C.Chem.Pharm.Bull.，1987，35(7)2744-2749]。不难发现本发明分离出的海芒果苷只比已知化合物17αH-tanghinigeninβ-L-thevetoside acetate少了一个乙酰基，经仔细分析海芒果苷的1H NMR和13C NMR数据，并与已知化合物比较，发现海芒果苷在2”位没被乙酰基取代，为一强心苷类化合物的新的衍生物，化学名为17αH-tanghinigeninβ-L-thevetoside 2’，3”，4”，6”-four acetate。
实施例二 海芒果苷衍生物乙酰化物的制备称取海芒果苷5.0mg于25mL圆底烧瓶中，加入无水吡啶和醋酐各1.5ml，在磁力搅拌器上搅拌24h，减压除去吡啶和醋酐，得到R＝OAc的通式化合物(4.5mg)。
海芒果苷乙酰化物为无色油状物，易溶于氯仿、丙酮；ESIMS显示分子离子峰943[M++Na]；其1H NMR(CDCl3，400MHz)数据，δ0.92(3H，s，H-18)，0.95(3H，s，H-19)，1.25(3H.d，J＝6.2Hz，H-6’)，2.02，2.04，2.05，2.06，2.07(each 3H，s，5×OAc)，2.79(1H，t，J＝8.5Hz，H-17)，3.23(1H，d，J＝6.0Hz，H-7)，3.32(1H，t，J＝9.5Hz，H-4’)，3.55(3H，s，3’-OMe)，3.68(1H，t，J＝9.5Hz，H-3’)，4.12(1H，dd，J＝12.5，2.4Hz，H-6”a)，4.21(1H，dd，J＝12.5，5.7Hz，H-6”b)，4.50(1H，d，J＝7.8Hz，H-1”)，4.58(1H，dd，J＝3.9，9.9Hz，H-2’)，4.75(1H，dd，J＝17.6，1.8Hz，H-21a)，4.93(1H，dd，J＝17.6，1.5Hz，H-21b)，4.96(1H，t，J＝9.7Hz，H-4”)，5.00(1H，d，J＝3.7Hz，H-1’)，5.10(1H，t，J＝9.4Hz，H-3”)，5.85(1H，t，J＝1.8Hz，H-22)。
实施例三海芒果苷衍生物对溴苯甲酰化物的制备称取海芒果苷3.0mg于10ml圆底烧瓶中，分别加入2mg对溴苯甲酰氯，1ml重蒸二氯甲烷和1ml三乙胺，再加4-二甲氨基吡啶少许，于室温下搅拌过夜即得到R＝为对溴苯甲酰基的通式化合物(2.3mg)。
海芒果苷对溴苯甲酰化物的理化性质如下无色油状物，易溶于氯仿、丙酮；ESIMS显示分子离子峰1083[M++Na]；其1H NMR(CDCl3，400MHz)数据，δ0.95(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，1.24(3H，d，J＝6.5Hz，H-6’)，2.03，2.04，2.05，2.07(each 3H，s，4×OAc)，2.81(1H，t，J＝8.6Hz，H-17)，3.25(1H，d，J＝6.3Hz，H-7)，3.33(1H，t，J＝9.4Hz，H-4’)，3.50(3H，s，3’-OMe)，3.74(1H，t，J＝9.0Hz，H-3’)，4.10(1H，dd，J＝12.6，2.5Hz，H-6”a)，4.18(1H，dd，J＝12.5，5.5Hz，H-6”b)，4.58(1H，d，J＝7.7Hz，H-1”)，4.61(1H，dd，J＝4.1，9.7Hz，H-2’)，4.77(1H，dd，J＝18.2，1.5Hz，H-21a)，4.95(1H，dd，J＝18.2，1.5Hz，H-21b)，4.99(1H，t，J＝9.9Hz，H-4”)，5.05(1H，d，J＝3.5Hz，H-1’)，5.11(1H，t，J＝9.5Hz，H-3”)，5.87(1H，t，J＝1.5Hz，H-22)，7.59(2H，br d，J＝8.6Hz，H-4，6)，7.93(2H，br d，J＝8.6Hz，H-3，7)。
实施例四海芒果苷及其衍生物抗肿瘤活性测试实验方法MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的Hela，A-549，Bel-7402，HL-60肿瘤细胞90μl/孔分别接种于96孔培养板内，培养24小时后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液(5mg/ml，用生理盐水配制)20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/L HCl)50μl/孔，于CO2培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。经多次体外抗肿瘤活性实验表明，该通式化合物具有显著的抗肿瘤作用，实验结果如下
权利要求
1.一类具有如下结构的海芒果苷衍生物 其中R＝OH、OAc或对溴苯甲酰基。
2.如权利要求1所述的海芒果苷类衍生物的制备方法，其特征在于步骤如下a)以植物海芒果茎杆为原料，用C1-C3低级醇浸提、合并浸提液，浓缩，浓缩物溶于H2O分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇浸物以及水溶物；b)正丁醇浸提物连续硅胶柱层析，合并所得的第二个组分用醋酐/吡啶(1∶1)搅拌反应12小时，再上硅胶(200-300目)柱，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，然后又经过Sephadex LH-20柱层析，以石油醚/氯仿/甲醇(1∶1∶1)洗脱，所得组分再经硅胶柱层析，以CHCl3/MeOH洗脱，得到R＝OH的海芒果苷；c)海芒果苷与1∶1的无水吡啶和醋酐在搅拌器上搅拌10-30小时，得到R＝OAc的强心苷类衍生物；d)海芒果苷与对溴苯甲酰氯(克分子比为1∶0.8-1∶1.5)反应，溶于重蒸二氯甲烷与等体积的三乙胺中，再加4-二甲氨基吡啶适量，于室温下搅拌过夜即得到R为对溴苯甲酰基的通式化合物。
3.根据权利要求2所述的海芒果苷类衍生物的制备方法，其特征在于正丁醇部分经硅胶柱层析的流动相依次为氯仿∶甲醇95∶5-50∶50梯度洗脱。
4.根据权利要求2所述的海芒果苷类衍生物的制备方法，其特征在于反应物用石油醚/乙酸乙酯90∶10-50∶50梯度洗脱。
5.如权利要求1所述的海芒果苷类衍生物的用途，其特征是该类化合物具有抗肿瘤活性，可以在制备治疗各种临床常见多发癌症的药物中得到应用。
全文摘要
本发明公开一类海芒果苷类衍生物、制备方法和用途。涉及医药技术领域，具体是一类从红树林植物海芒果(Cerbera manghas L)中提取、分离获得的新的具有显著抗肿瘤活性的海芒果苷类衍生物，结构如下其中R＝OH、OAc、或对溴苯甲酰基经多次体外抗肿瘤活性实验表明，该类化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可在制备抗癌症药物中应用。本发明可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物，对开发利用我国红树林植物资源具有重要意义。
文档编号A61K31/7048GK1715292SQ200410025718
公开日2006年1月4日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年7月2日
发明者郭跃伟, 王继栋, 于嘉陵, 丁健 申请人:中国科学院上海药物研究所