专利名称：鳄鱼血在制备抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物及保健食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鳄鱼血在制备用于抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物及保健食品中的应用。
背景技术：
据世界卫生组织1997年度报告，1996年全球58亿人口中因癌症死亡的有630万人，约占总死亡人数的12％，是仅次于心血管疾病的第2大疾病死亡原因。目前全球存活的癌症患者约有7600余万人。每年新增癌症患者约有1030余万人。在我国癌症也成了人口死亡的第2大原因，1997年公布的我国90年代人口死亡原因抽样结果显示，癌症死亡率为10万人中就有124.46人，死亡率已从二十世纪二十年代的12.57％升至17.49％，20年间上升了11.56％，年死亡人数也已由90万人增至130万人以上。我国现有癌症患者约400万人。每年新诊断出160万癌症患者。同时，病毒疾病也是危害人类健康的一大杀手，每年感染病毒的人数不断增加，以对社会及人类健康造成极大的危害。寻找新型抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物，成为当今社会的重要研究领域。
发明内容
本发明的目的是提供鳄鱼血在制备用于抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物及保健食品中的应用。
本发明经实验证明，鳄鱼血对抗肿瘤抗病毒提高免疫力具有良好的疗效，同时具有毒性低的优点。因此，可用于制备治疗抗病毒抗肿瘤提高免疫力的药物及保健食品。
所述的鳄鱼血用于制备抗病毒抗肿瘤提高免疫力的药物及保健食品，将活体鳄鱼经过无菌抗凝血抽取血液，并经过离心、添加保护剂、冷冻干燥工艺处理后，再无菌包装用于制备药物及保健食品。所用鳄鱼血冷冻干燥等工艺处理产物可与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法，根据需要制成适当的剂型，如口服片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射粉针剂、滴鼻剂等。通常以口服使用，当然也可以采用其它给药方式，不同给药方式给药剂量有所不同；其每天使用固体口服剂量一般为约0.001～100000毫克，成年人常用量为每天0.05～60000毫克，最常用剂量为5～5000毫克；每天一次或分数次使用。
具体实施例方式
实施例1一、材料实验样品鲜活湾鳄、逻罗鳄，由广东四会市贞山鳄鱼养殖限公司提供。
实验动物NIH系小鼠，由广东省医学实验中心提供，聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP K-30)，由海南南杭药业有限公司提供。
二、方法与结果鳄鱼血浆冻干粉制备鲜活鲜活湾鳄、逻罗鳄，分别经心脏插管无菌取血，经过柠檬酸钠抗凝、离心，混入5％wt聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP-K30)、冷冻干燥制成粉末，分别制备湾鳄、逻罗鳄鳄鱼血浆冻干粉。
灌胃给予受试动物急性毒性实验选择健康NIH系小鼠，体重20±2g，40只，雌雄各半，随机分成2组，即湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组，每组20只，雌雄各半。禁食12小时，提供饮水，分别将鳄鱼血冷冻粉剂以生理盐水配成含血浆冻干粉0.4g/ml溶液，湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组小鼠分别一次灌胃湾鳄血浆溶液、逻罗鳄血浆溶液0.8ml/20g体重，连续观察七天，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应，限于给药浓度和体积不能再增大，不能测出其LD50。故进行最大耐受量试验。
另选择健康小鼠40只，雌雄各半，随机分成2组，即湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组，每组20只，雌雄各半。禁食12小时，提供饮水，分别将鳄鱼血胶囊粉剂以生理盐水配成含血浆冻干粉0.4g/ml溶液，湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组小鼠分别于24小时内分6次灌服鳄鱼血浆溶液，每次0.5ml/20g体重，观察7天，此期间让小鼠自由进食和饮水，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或异常反应。
三、结论小鼠每天灌胃分别给予湾鳄血浆溶液、逻罗鳄血浆最大耐受量应不小于0.4×6×0.5×50＝60g/kg，属于实际无毒级。
实施例2 抗肿瘤及提高机体免疫功能的药理作用一、材料及方法癌细胞株 人肺癌细胞95-D、人胃癌细胞BGC、人肝癌细胞HepG2细胞，由中山大学国家高技术(863)海洋生物功能基因组开放实验室提供；人鼻咽癌瘤源，由中山大学实验动物中心提供。
取约104个人肺癌细胞95-D、人胃癌细胞BGC、人肝癌细胞HepG2细胞、C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16分别接种于96孔培养板中，每孔180μl，于37℃含5％CO2培养箱中培养，培养24h。设阴性对照孔(含相同浓度的聚乙烯吡咯烷酮辅料对照)及湾鳄血浆冻干粉、逻罗鳄血浆冻干粉，用生理盐水溶解，各组设5个浓度，每浓度3个平行孔，每孔分别加样品20μl，于37℃含5％CO2培养箱中培养，培养48h后，每孔加入MTT(用生理盐水配制成5mg/ml)20μl，37℃温育4h，使MTT还原为甲臜(Formanza)。吸出上清液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使Formanza溶解。
指标测定 最后用酶标定量仪测定492nm处光密度值。阴性对照相比，计算肿瘤细胞抑制率。
将瘤源裸鼠脱颈处死，取出鼻咽癌肿瘤组织，切成2mm×2mm×2mm的小瘤块，用套管针将瘤块接种于每只裸鼠的背部皮下，制备成为人鼻咽癌裸鼠模型。
裸鼠50只，接种后次日随机分为5组，即空白对照组、湾鳄血浆冻干粉低、高剂量给药组、逻罗鳄血浆冻干粉低、高剂量给药组，每组10只，连续灌胃给药28天，处死动物，测定体重、肿瘤、胸腺、脾脏重量，按公式计算抑瘤率＝(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％胸腺指数(mg/10g体重)＝胸腺重量/体重脾脏指数(mg/10g体重)＝脾脏重量/体重二、实验结果表1湾鳄血浆冻干粉对95-D癌细胞的抑制率剂量(μg/mL) 900 400 150 60 40抑制率(％) 82.070.960.730.026.2表2逻罗鳄血浆冻干粉对95-D癌细胞的抑制率剂量(μg/mL)900 400 150 60 40抑制率(％) 89.073.964.7 40.032.2表3湾鳄血浆冻干粉对HepG2细胞、B16癌细胞的抑制率剂量(μg/mL) 900 400 150 60 40抑制率 HepG2 84.5 75.962.3 51.244.3(％) B16 78.2 60.151.2 48.933.2表4逻罗鳄血浆冻干粉对HepG2细胞、B16癌细胞的抑制率剂量(μg/mL)900 400 150 60 40抑制率HepG2 93.078.4 44.9 45.735.6(％) B16 86.270.3 76.3 43.130.1表5鳄鱼血浆冻干粉对荷人鼻咽癌裸鼠的影响(x±SD，n＝10)组别 剂量 体重(g) 瘤重 胸腺指数 脾赃指数(mg/kg) 始 末 (g)mg.10g-1mg.10g-1空白对照组5％PVP19.6±1.325.4±2.21.5±0.3 25.9±3.2 58.6±6.2K-30湾鳄血浆冻干粉5020.6±1.3Δ24.3±3.5Δ0.6±0.4***32.6±3.5***64.3±4.7*给药组100 19.8±1.6Δ26.1±3.1Δ0.3±0.3 36.7±4.3***68.2±5.8**湾鳄血浆冻干粉5020.7±1.8Δ25.6±3.0Δ0.5±0.3 33.3±3.6***64.5±4.2*给药组100 20.5±1.5Δ24.6±1.8Δ0.3±0.2 37.2±3.5***67.3±4.8**与空白对照组相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.空白对照组给予等体积5％PVP K-30溶液。
实施例3 提高机体免疫功能的药理作用一、材料及方法
NIH系小鼠，由广东省医药实验动物中心提供。环磷酰胺，由上海华联制药公司生产。胸腺肽肠溶片，由西安迪赛生物药业有限公司生产。
环磷酰胺致小鼠免疫功能低下的药理作用选择健康NIH系小鼠90只，18～22g，雌雄各半，随机抽取10只，雌雄各半，作为正常对照组，其余70只口服环磷酰胺50mg/Kg体重，连续服用4天后，随机分成8组，每组10只，雌雄各半，即空白对照组，湾鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组，逻罗鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组及阳性对照组(胸腺肽组)。灌胃给受试样品，给受试样品剂量见表6，连续给受试样品40d，第41d各组小鼠禁食一天，但提供饮水。第42d，处死各组小鼠，称量各组小鼠的体重，胸腺及脾脏重量，计算胸腺指数及脾脏指数，比较各组间的差异。
对小鼠碳廓清试验的作用选择健康NIH系小鼠90只，18～22g，雌雄各半，随机抽取10只，雌雄各半，作为正常对照组，其余70只口服环磷酰胺50mg/Kg体重，连续服用4天后，随机分成8组，每组10只，雌雄各半，即空白对照组，湾鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组，逻罗鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组及阳性对照组(胸腺肽组)。灌胃给受试样品，给受试样品剂量见表7，连续给受试样品40d，第41d各组小鼠禁食一天，但提供饮水。第42d，将印度墨汁，按每10g体重0.1ml计算，经鼠尾静脉注入小鼠，待墨汁注入后立即计时，注入墨汁后2、10min，分别从小鼠眼眶内眦静脉丛取而20μl，加入2ml Na2CO3溶液中，用7550可见光-紫外分光光度计在600nm波长处测光密度(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。最后处死小鼠，称量体重，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算吞噬指数(K)及吞噬活性(α)值，比较各组差异。
吞噬指数K＝(lgOD1-lgOD2)÷(t2-t1)(t为时间，单位为min)吞噬活性α＝体重÷(肝重+脾重)×K表6对小鼠胸腺和脾脏的作用(x±SD，n＝10)项目 剂量 胸腺指数 脾脏指数组别 (mg/kg)(mg/10g体重) (mg/10g体重)空白对照组5％PVP 16.25±3.21 48.46±8.26K-30湾鳄血浆冻干粉组 60 17.35±3.32Δ56.62±10.31Δ12019.56±3.34*68.47±13.43***24020.27±2.96**76.28±9.96***逻罗鳄血浆冻干粉组60 17.98±3.45Δ57.81±8.42*12019.95±3.82*70.22±9.45***24021.26±3.55**85.29±10.26***阳性对照组24020.56±3.56**76.29±12.45***与空白对照组相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。空白对照组给予等体积5％PVP K-30溶液。
表7对小鼠碳廓清试验的作用(x±SD，n＝10)项目 剂量 吞噬指数 吞噬活性组别 (mg/kg)Kα空白对照组 5％PVP 0.0682±0.0098 7.8351±0.2469K-30湾鳄血浆冻干粉组 60 0.1190±0.0240***7.9520±0.2561Δ1200.1832±0.0310***8.5234±0.2835***2400.2266±0.0352***9.694±0.2963***逻罗鳄血浆冻干粉组 60 0.1230±0.0169***7.9932±0.2582***
1200.1925±0.0254***8.6821±0.3243***2400.2264±0.0269***9.9753±0.2562***阳性对照组 2400.1149±0.0210***8.9342±0.3386***与空白对照组相比，ΔP＞0.05，***P＜0.001.空白对照组给予等体积5％PVP K-30溶液。
实施例4 抗病毒药理作用NIH系小鼠，由广东省医药实验动物中心提供。流感病毒鼠肺适应株FM1，由北京医学科学院医药生物技术研究所提供，病毒唑，购于北京华康药业。禽流感病毒H5N1亚型，由华南农业大学兽医学院提供。对因小鼠体内感染流感病毒所致死亡的保护作用将选择健康NIH系小鼠，体重20±2g，90只，雌雄各半，随机分为病毒对照组、正常对照组、湾鳄血浆冻干粉给药低、中、高剂量组，逻罗鳄血浆冻干粉给药低、中、高剂量组，除正常对照组外，其余各组分别以FM1(血凝效价为1∶512)滴鼻感染，给药组自感染病毒前1d开始到感染后4d，共滴鼻给药0.05ml/次，2次/d，同时各组按表8剂量连续10天口服灌胃给药，病毒对照组及正常对照组给予等体积5％PVP-K30溶液，逐日观察动物发病和死亡数，并观察15天，计算死亡保护率及生命延长率。
表8鳄鱼血浆冻干粉对小鼠感染病毒性肺炎所致死亡的保护作用(x±SD，n＝10)组别N/只 给药浓度(mg/L) 死亡(n)死亡率(％) 平均存活(d)病毒对照组 105％PVP-K30 8 80 9.7±3.1正常对照组 105％PVP-K30 0 0 15.0±0.0***病毒唑组101000 5 50 13.6±0.6***湾鳄血浆冻干1060 6 60 12.0±2.8**粉给药组101203 30 13.7±2.4***102403 30 14.3±1.3***逻罗鳄血浆冻1060 6 60 12.2±2.7Δ干粉给药组 101203 30 13.9±1.9***102402 20 14.7±0.7***与空白对照组相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
将选择健康NIH系小鼠，体重20±2g，90只，雌雄各半，随机分为病毒对照组、正常对照组、湾鳄血浆冻干粉给药低、中、高剂量组，逻罗鳄血浆冻干粉给药低、中、高剂量组，除正常对照组外，其余分别以禽流感病毒H5N1亚型(血凝效价为1∶256)滴鼻感染，共滴鼻给药0.05ml/次，1次/d，连续滴鼻4天，同时各组按表9剂量连续10天口服灌胃给药，病毒对照组及正常对照组给予等体积5％PVP-K30溶液，逐日观察动物发病和死亡数，并观察20天，计算死亡保护率及生命延长率。
表9鳄鱼血浆冻干粉对小鼠H5N1所致死亡的保护作用(x±SD，n＝10)组别 N/只给药浓度(mg/L) 死亡(n)死亡率(％) 平均存活(d)病毒对照 10 5％PVP-K8 80 13.4±3.930正常对照 10 5％PVP-K0 020.0±0.0***病毒唑10 30 5 50 17.1±2.8*1000湾鳄血浆冻干 10 60 6 60 17.0±2.8*粉给药组 10 120 3 30 18.7±2.4**10 240 2 20 19.3±1.3***
逻罗鳄血浆冻 10 60 6 60 17.2±2.7*干粉给药组10 120 3 30 18.9±1.9***10 240 2 20 19.7±0.7***与空白对照组相比，ΔP＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.00权利要求
1.鳄鱼血在制备用于治疗抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物及保健食品中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征是所用的鳄鱼血对活体鳄鱼经过无菌抗凝血抽取，并经过离心、添加保护剂、冷冻干燥工艺处理后，再无菌包装用于制备药物及保健食品。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征是将鳄鱼血冷冻干燥产物与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法制成所需要的药物及保健食品。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征是所述的药物及保健食品为含有鳄鱼血成分。
全文摘要
本发明涉及利用鳄鱼血在制备用于抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物及保健食品中的应用。本发明经实验证明，鳄鱼血对抗病毒抗肿瘤提高免疫力具有良好的疗效，同时具有毒性低的优点。因此，可用于制备治疗抗肿瘤抗病毒提高免疫力的药物及保健食品。
文档编号A61P31/12GK1634147SQ200410051860
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者许东晖, 许实波, 梅雪婷, 林峰亮 申请人:中山大学