专利名称：一种联苯环辛二烯木脂素在制备抗肿瘤药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从五味子属药用植物铁箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]的根和茎中分离得到的联苯环辛二烯木脂素化合物I对血液瘤和实体瘤的细胞毒作用、诱导凋亡作用、影响细胞周期作用及其在肿瘤的临床预防与治疗中的应用。
背景技术：
联苯环辛二稀类木脂素在自然界中主要来源于五味子科植物，是该科植物的特征成分，这类木脂素骨架独特，立体化学复杂，生物活性广泛。七十年代，我国临床研究中发现五味子能明显降低肝炎患者血清谷并转氨酶SGPT水平，从而引起了五味子可药用植物研究的热潮，并由此开发出治疗肝炎药物联苯双酯。近年来，人们通过研究发现，木脂素除了具有人们熟知的保肝降酶，还有其他方面的生物活性，比如调节中枢神经以及抗脂质过氧化、抗肿瘤、抗HIV等等。因此继续深入研究五味子科成分的生物活性，对阐明该科植物传统功效的物质基础具有重大意义。
铁箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]是五味子科五味子属植物，木质藤本，是我国特有的药用植物，在我国分布广泛(甘，陕，豫，鄂，滇，川，黔，桂等地均有分布)，资源丰富，在民间用来治疗风湿麻木，神经衰弱，跌打损伤，风湿骨痛，月经不调，外伤出血，疮疖肿痛，胃痛及脉管炎等疾病。本实验室在研究铁箍散的木脂素类化合物的过程中，分离得到了联苯环辛二烯木脂素化合物Schisantherin I(五味子酯I)，迄今为止未见任何有关该化合物的活性报道。
本发明的目的是在研究联苯环辛二烯木脂素Schisantherin I的细胞毒性、细胞形态学、细胞周期实验的基础上，开发推出其在抗肿瘤临床治疗中的实际应用。
发明内容
本发明提供了联苯环辛二烯木脂素类化合物Schisantherin I在制药中的应用。
本发明包括提供一种以联苯环辛二烯木脂素Schisantherin I化合物为药物活性成分的药物组合物，以及用联苯环辛二烯木脂素Schisantherin I或其药物组合物制备一种抗肿瘤药物。
本发明的药物组合物，含有生理有效量的联苯环辛烯木脂素和/或药物可接受的载体，所述联苯环辛烯木脂素类化合物I为1-羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素。
所述联苯环辛烯类化合物I在组合物的重量比为0.1-99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。
本发明的药物组合物采用适合药用的制剂形式，这些制剂形式是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
联苯环辛烯木脂素类化合物在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用，所述联苯环辛烯类化合物为1-羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素。
上述的药物组合物可应用于制备治疗和/或预防肿瘤药物。
本发明所说的联苯环辛二烯木脂素为Schisantherin I其化学结构如下 该化合物提取自铁箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]干燥根茎，30Kg原材料用95％乙醇回流提取三次(每次2小时)，浓缩至浸膏状，以适量蒸馏水混悬，静置过夜，分层得到水不溶部分A和水溶部分B。水不溶部分用适量乙醇溶解后拌以粗硅胶(100目)，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮洗脱后浓缩至浸膏。将乙酸乙酯部分浸膏(42g)经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次用石油醚至石油醚-丙酮(1∶2)不同比例的溶液梯度洗脱得到15个馏分，馏分11经Sephadex LH-20色谱柱分离，以氯仿∶甲醇(1∶1)为洗脱剂，得到12个馏分。其中5-7合并(约1.9g)利用反相硅胶柱(RP-18)分离，以65％甲醇梯度洗脱得到38个馏分，合并fr19-37得到化合物I(约891mg)。
化合物I为无色针晶，熔点167-168℃。ESI，IR，UR，1HNMR，13CNMR波谱数据与文献报道基本一致，故推定化合物I为1羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素(schisantherin I)。
将得到的化合物Schisantherin I用DMSO溶解配成10mg/ml的浓缩液，分别进行细胞毒性试验、细胞形态学试验(细胞凋亡)和细胞周期试验。细胞毒性试验结果表明，化合物Schisantherin I对血液瘤及实体瘤均有较好的抑瘤作用。对小鼠正常成纤维细胞株NIH3T3的IC50值均大于其它肿瘤细胞株，说明化合物Schisantherin I在抑制肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒性较低。细胞形态学试验结果表明，化合物Schisantherin I对细胞株HL-60能引起与凋亡和G1期停滞有关的形态学变化。琼脂糖凝胶电泳实验结果表明，化合物Schisantherin I能诱导细胞凋亡，出现特征性的凋亡梯带。细胞周期试验结果表明，化合物Schisantherin I在10ug/ml时可使细胞株HL-60、MDA-MB-231、MCF-7停止在G1期。
本发明涉及的化合物Schisantherin I在体外对血液瘤(HL-60)和实体瘤(MDA-MB-231、MCF-7)均有良好的杀伤作用，而对小鼠正常成纤维细胞株NIH3T3杀伤作用相对微弱，DNA电泳实验、细胞形态学和细胞周期试验证明，所说化合物主要是通过诱导细胞凋亡和G1期阻滞来起作用的。因此，本发明所说的联苯环辛烯木脂素类化合物Schisantherin I可用于临床肿瘤预防和治疗药物。
图1Schisantherin I的制备流程；图2Schisantherin I的细胞凋亡形态学变化；图3Schisantherin I的细胞凋亡电泳梯形条带。
具体实施例方式
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明的药物组合物，含有生理有效量的联苯环辛烯木脂素和/或药物可接受的载体，所述联苯环辛烯木脂素类化合物I为1-羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素。
上述的药物组合物可应用于制备治疗和/或预防肿瘤药物。
上述联苯环辛烯木脂素类化合物可应用于制备治疗和/或预防肿瘤药物，所述联苯环辛烯类化合物为1-羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素。
本发明的药物组合物采用适合药用的制剂形式，这些制剂形式可以是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
本发明所说的联苯环辛二烯木脂素为Schisantherin I其化学结构如下 该化合物提取自铁箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]干燥根茎，30Kg原材料用95％乙醇回流提取三次(每次2小时)，浓缩至浸膏状，以适量蒸馏水混悬，静置过夜，分层得到水不溶部分A和水溶部分B。水不溶部分用适量乙醇溶解后拌以粗硅胶(100目)，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮洗脱后浓缩至浸膏。将乙酸乙酯部分浸膏(42g)经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次用石油醚至石油醚-丙酮(1∶2)不同比例的溶液梯度洗脱得到15个馏分，馏分11经Sephadex LH-20色谱柱分离，以氯仿∶甲醇(1∶1)为洗脱剂，得到12个馏分。其中5-7合并(约1.9g)利用反相硅胶柱(RP-18)分离，以65％甲醇梯度 洗脱得到38个馏分，合并fr19-37得到化合物I(约891mg)，其分离流程见附图1。
化合物I为无色针晶，熔点167-168℃。ESI，IR，UR，1HNMR，13CNMR波谱数据与文献报道基本一致，故推定化合物I为1羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素(schisantherin I)。
将得到的化合物Schisantherin I用DMSO溶解配成10mg/ml的浓缩液，分别进行细胞毒性试验、细胞形态学试验(细胞凋亡)和细胞周期试验。细胞毒性试验结果表明，化合物Schisantherin I对血液瘤及实体瘤均有较好的抑瘤作用。对小鼠正常成纤维细胞株NIH3T3的IC50值均大于其它肿瘤细胞株，说明化合物Schisantherin I在抑制肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒性较低。细胞形态学试验结果表明，化合物Schisantherin I对细胞株HL-60能引起与凋亡和G1期停滞有关的形态学变化。琼脂糖凝胶电泳实验结果表明，化合物Schisantherin I能诱导细胞凋亡，出现特征性的凋亡梯带。细胞周期试验结果表明，化合物Schisantherin I在10ug/ml时可使细胞株HL-60、MDA-MB-231、MCF-7停止在G1期。
上述有关试/实验举例如下细胞形态学实验(细胞调亡)1.材料人急性早幼粒白血病细胞株(HL-60)，Hoechst 33258荧光染色剂，PBS(无Ca2+，Mg2+，PH7.2)，4％甲醛溶液。
2.方法在35×10mm含HL-60细胞的培养皿中，给药作用一段时间后，收集约106个细胞，用冷的PBS洗2次，4％甲醛溶液在4℃固定10min，用1ug/mlHoechst 33258在37℃染色7min，滴片，在40×10荧光倒置显微镜下观察。
3.结果观察化合物1对HL-60细胞形态学的影响，发现化合物1对HL-60细胞株能引起调亡形态学的变化，调亡的细胞核呈现凝聚并裂解。(见附图2)细胞毒性试验1.材料人乳腺癌细胞株MCF-7(ER+)、MDA-MB-231(ER-)，人急性早幼粒白血病细胞株HL-60，小鼠成纤维细胞株NIH3T3均购自美国ATCC(American Type CultureCollection)。培养基RPMI 1640、DMEM，胎牛血清均购自Gibico公司，MTT(3-(4，5-DIMETHYLTHIAZOL-2-YL)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)为AMRESCO公司产品，生产批号3133B50。其它试剂均为国产分析纯。
2.方法细胞增殖检测(MTT法)，细胞以1×104/孔接种96孔板上，在预实验基础上选用倍比稀释后的六个药物浓度(3.125～100μg/ml)，每个浓度重复3孔，空白对照组用等体积溶媒替代。孵育72小时后每孔加入5mg/mlMTT液10μl后再孵育4小时，离心去上清，每孔加入二甲基亚砜液150μl，振荡器充分振荡后，用Zenyth 200rtmicroplate reader测定各孔在540nm处的吸光度(A)，根据药物处理组A值、对照组A值，计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率按下式计算对照组A值-实验组A值/对照组A值，并计算50％细胞存活时药物浓度(IC50)。
3.结果联苯环辛二烯木脂素类化合物Schisantherin I作用于细胞72小时后，与对照组比较，细胞株HL-60、MDA-MB-231、MCF-7、NIH3T3均表现为A值减低，提示细胞生长受抑，说明联苯环辛二烯木脂素类化合物Schisantherin I对血液瘤及实体瘤均有较好的抑瘤作用，且对小鼠正常成纤维细胞株NIH3T3的IC50值均大于其它肿瘤细胞株，说明化合物Schisantherin I在抑制肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒性较弱(表1)。
表1 化合物Schisantherin I对肿瘤细胞株以及正常细胞的IC50
细胞周期试验1.材料RNase A(Sigma公司产品，生产批号063k1174)；PI(propidium iodide)(Fluka公司产品，生产批号1086355 30304232)。其它试剂均为国产分析纯。
2.方法FCM检测HL-60、MDA-MB-231、MCF-7细胞DNA含量及细胞周期分析，细胞以1×106/ml接种100ml培养瓶，分别加入终浓度为10μg/ml的联苯环辛烯木脂素类化合物Schisantherin I，同时设空白对照组，24小时后收获细胞，1000rpm×5分钟离心，用冷PBS洗3次后弃上清液，用预冷75％酒精固定，4℃保存。临用前固定细胞悬液离心，加预冷PBS2ml，2000rpm×5分钟洗2次，调整细胞浓度至1×106/ml，加入RNaseA(10mg/ml)100μl混匀，室温孵育10分钟；加入碘化丙啶染液(PI，50μg/ml)800μl混匀，4℃避光放置30分钟后流式细胞仪检测分析，Celluest3.1软件获取直方图，Multicycle3.0分析获取数据。
3.结果联苯环辛二烯木脂素类化合物Schisantherin I在10ug/ml浓度时，作用24小时，使细胞株HL-60、MDA-MB-231、MCF-7均停止在G1期(表2)。
表2.化合物Schisantherin I对细胞周期的影响
细胞凋亡试验1.材料琼脂糖(Spanish公司产品，上海生物工程公司分装，生产批号GI-122401)；溴化乙锭(sigma公司产品，生产批号)；RNase A(Sigma公司产品，生产批号063k1174)；Proteinase K(MERCK公司产品，生产批号Y354968 926)。其它试剂均为国产分析纯。
2.方法DNA提取及电泳分析，细胞株HL-60、MDA-MB-231均以5×105/ml接种35mm培养皿，培育24小时后，加入不同浓度化合物Schisantherin I，继续孵育48小时后，1000rpm×5分钟收集细胞，PBS洗2次。每2×106/ml细胞加600μl裂解液(10mmol/LTris.CL，10mmol/LEDTA，75mmol/LNaCl；5g/LSDS)，力RNase A 10μl(10mg/ml)和蛋白酶K 15μl(20mg/ml)，56℃孵育2小时，用酚和氯仿抽提DNA，沉淀的DNA溶于20μl TBE缓冲液，加6×DNA加样缓冲液1μl，1％琼脂糖、40V×4小时电泳，Kodak凝胶成像系统下摄片。
3.结果细胞DNA片段分析，用浓度为10、20μg/ml化合物Schisantherin I处理细胞后48小时，提取DNA并行琼脂糖凝胶电泳，出现明显的DNA断裂梯形条带(图3)。
所述联苯环辛烯类化合物I在组合物的重量比为0.1-99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。以下为几种常用制剂形式的制备实施例片剂的制备Schisantherin I 40g微晶纤维素 80g硬脂酸镁1.2％3％聚维酮乙醇溶液适量共制成 1000片取处方量化合物1与处方量微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，50℃干燥30-45分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片。每片含化合物40mg。
颗粒剂的制备Schi santherin I 40g微晶纤维素 80g硬脂酸镁1.2％3％聚维酮乙醇溶液 适量取处方量Schisantherin I与处方量微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液适量制软材，过18目筛制颗粒，50℃干燥30-45分钟，整粒，装袋，每袋含化合物40mg。
注射剂的制备Schi santherin I 20g土温-80 40g山梨醇 10g
生理盐水 加到1000ml共制成 1000瓶取处方量Schisantherin I与处方量土温-80和山梨醇混合均匀，加入适量生理盐水使溶解，过滤，分装，灭菌，包装即得。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于含有生理有效量的联苯环辛烯木脂素和/或药物可接受的载体，所述联苯环辛烯木脂素类化合物I为1-羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述联苯环辛烯类化合物I在组合物的重量比为0.1-99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，采用适合药用的制剂形式，这些制剂形式是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
4.联苯环辛烯木脂素类化合物在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用，所述联苯环辛烯类化合物为1-羟基-2，3，12，13，14-五甲氧基-6-己酸酯基-7-羟基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-联苯环辛二烯木脂素。
5.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种联苯环辛烯类木脂素在制备抗肿瘤药物的用途，该化合物是从五味子属植物铁箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]的根和茎中提取的一种联苯环辛烯类木脂素(1羟基－2，3，12，13，14－五甲氧基－6－己酸酯基－7－羟基－8－甲基－9－苯甲酸酯基－联苯环辛二烯木脂素)，实验研究证明，它们具有对血液瘤和实体瘤的细胞毒作用，能诱导肿瘤细胞凋亡和G1期阻滞的细胞形态学和细胞周期的变化，有望开发其在肿瘤的临床预防与治疗中的应用。
文档编号A61K31/222GK1660067SQ20041007728
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月1日 优先权日2004年12月1日
发明者陈新滋, 肖培根, 陈士林, 陈四保, 许利嘉 申请人:普尔药物科技开发(深圳)有限公司