专利名称：血球分离膜和使用该血球分离膜的血液保持用具的制作方法
技术领域：
本发明涉及将血液中的血球(也称为血细胞)与血清或血浆分离的血球分离膜以及在血液的保持和检查中使用的血液保持用具。
背景技术：
在检查血液时，每个检测体所消耗的片状的血液检查用具(也称为试验片)被广泛应用。该检查用具可以列举出保持血液并从其中抽取血液进行检查的类型，或预先使检查用具含有试剂等。后一种用具，例如通过在该检查用具中滴加血液，而使血液和试剂反应后，通过光学方法和电化学方法测定该反应。
这种血液检查用具不仅常用于普通的临床检查等中，而且，还实际用于例如远距离临床检查方式中。所述的这种远距离临床检查方式是，在住宅中患者自身采集血液，并将其装在血液检查用具中、干燥后，将该血液检查用具邮寄等到医院等检查机构，进行检查的方式。邮寄了血液的患者等可以通过邮件等得知检查结果，或者直接到医院等而得知检查结果。
在检查项目为像血糖值这样的血清或血浆中的成分时，必须在血液检查用具中，将血液分离为血球和血清或血浆。因此，现有的血液检查用具一般是将玻璃滤器等血球分离材料装入到血液检查用具中。通过这种血液检查用具，例如可以通过血液分离材料将血液分离为血球与血清和血浆，通过了前述血球分离材料的血清和血浆，再通过毛细现象在展开部展开，由此可以制备血清和血浆试样。此外，最近还开发出了使用孔径在厚度方向上发生变化的非对称性多孔膜的血液检查用具(例如，特表平11-505327号公报)。如果从非对称性多孔膜的孔径大的一面供给血液，则血液在厚度方向上进行浸透的过程中，血球从前述血液中被分离出来，血清和血浆从供给面相反的一侧流出，因此可以将其回收。使用这种非对称性多孔膜的血液检查用具具有防止血球堵塞的优点。
但是，对于这些现有的血液检查用具，随着血球的分离，前述血球会溶血，前述血球内的成分可能会混入到血清等中，因此必须预先在血液中含有用于防止溶血的添加剂(例如，特开平9-196908号公报)。但是，在这种情况下，虽然防止溶血，但受前述添加剂的影响，会使所得的血清和血浆中的血细胞比容(Ht)值大幅度地降低，具有难以更精确地测定血清和血浆成分的问题。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供可以防止伴随着血球分离的血球溶血，且将血球与血清和血浆分离的血球分离膜和使用该血球分离膜的血液保持用具。
为了实现前述目的，本发明的血球分离膜的特征在于含有将血液中的血球与血清或血浆分离的多孔膜，前述多孔膜含有至少1种选自疏水性氨基羧酸、由丝得到的蛋白质、Tris、TES、ε-氨基己酸、止血环酸和肝素的防溶血剂。
如此，本发明的血球分离膜由于含有前述这种防溶血剂，所以可以防止血球溶血。因此，通过前述血球分离膜而分离出的血清或血浆试样不含有前述血球内成分，并可以以优异的精度对血清等成分进行测定。另外，还可以防止溶血而产生的血红蛋白色素的混入，所以还可以根据光学的方法或目视等直接测定前述分离的试样。
另外，如果使用本发明的血球分离膜制备血清和血浆试样，也可以高精度地测定各种成分。本发明者们对使用前述这种现有的血球分离膜的情况下的血细胞比容(Ht)值的降低以及各种分析项目的测定精度的降低进行了认真地研究。其结果是，本发明者们发现迄今为止在防止溶血中使用的添加物质为甘氨酸，通常以相对于血球分离膜的单位体积(cm3)为约100mg～200mg的高浓度含有，所以产生了前述这种影响。特别是，对GGT等分析项目来说，不仅可以发现甘氨酸的稀释效果，而且发现甘氨酸使血清或血浆成分发生变化的结果是，测定精度降低。然而，像本发明的血球分离膜，不含有甘氨酸而含有前述的防溶血剂，就不需要例如甘氨酸这样的高浓度。在上述基础上，发明者还发现，使用上述本发明的防溶血剂还可以减轻对Ht值的影响，对各种分析项目，即使对例如GGT也可以高精度地进行测定。如上所述，如果使用本发明的血球分离膜，可以防止血球分离产生的血球的溶血，并可以将血球与血清和血浆分离，而且，可以对各种分析没有影响地制备血清或血浆试样。
然后，本发明的血液保持用具具有分离血液中的血球的血球分离部和通过毛细现象将血液中的血清或血浆展开的展开部，前述血球分离部是前述本发明的血球分离膜。本发明的血液保持用具由于具有起到前述效果的血球分离膜，所以可以认为在例如前述这种远隔临床检查方式中特别有用。另外，本发明的检测体保持用具可以作为用于邮寄等中保持血球与血清和血浆被分离过的血液检测体的用具而使用，另外，也可以将其本身作为目标成分的血液检查用具而使用。
图1表示本发明的血液保持用具的一个实施例的剖面图。
图2表示本发明的血液保持用具的另一个实施例的剖面图。
图3表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图4表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图5表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图6表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图7表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图8表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图9表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
图10表示本发明的血液保持用具的又一个实施例的剖面图。
具体实施例方式
如前所述，本发明的血球分离膜的特征在于含有将血液中的血清或血浆与血球分离的多孔膜，前述多孔膜含有至少1种选自疏水性氨基羧酸、由丝得到的蛋白质、Tris、TES、ε-氨基己酸、止血环酸和肝素的防溶血剂。
作为前述疏水性氨基羧酸，例如可以使用疏水性氨基酸，具体地可以使用丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等。前述的由丝得到的蛋白质是指蚕丝蛋白的水解产物(以下，也称作“丝提取物”，(silkessence))。
在前述防溶血剂中，优选缬氨酸、亮氨酸、ε-氨基己酸、止血环酸、丝提取物。这是因为，在使用它们时，除了前述这种防溶血效果以外，还可以起到以优异的效率将血清和血浆和血球分离的效果。虽然并不清楚机理，但是通过使前述血球分离膜内含有这些防溶血剂，可以抑制前述血球分离膜内的血球的浸透速度，另一方面，还可以促进血清和血浆的浸透速度。另外，即使在血球通过了前述血球分离膜的情况下，也可以抑制例如展开部中的血球的展开速度，而且可以促进血清或血浆的展开速度。因此，可以在前述展开部中缩短血球的展开距离，而延长血清或血浆的展开距离。也就是，可以两方面实现抑制血球的展开和促进血清和血浆的展开这样相反的效果，从而可以只增加血清或血浆的展开量。因此，根据含有前述防溶血剂的血球分离膜，可以容易地将血球与血清或血浆分离。此外，即使在血球通过了前述血球分离膜的情况下，也可以抑制血球的展开对血清和血浆回收率的影响，所以也可以提高其回收率。因此，还可以减少所供给的血液量，例如，可以减轻在采血时对患者的负担。
此外，其中，特别优选缬氨酸、止血环酸、ε-氨基己酸。在使用它们时，例如，与前述的甘氨酸相比，以甘氨酸的1/5～1/10左右的含量(重量)使用，就可以起到足够的效果。
另外，前述防溶血剂可以使用任何一种，也可以将二种或更多种组合使用。作为组合，例如，可以列举出缬氨酸和肝素、止血环酸和肝素等组合。
在本发明中，前述防溶血剂的含量(重量)是，例如，相对于单位体积(cm3)的前述多孔膜，优选在1mg～50mg的范围，更优选5mg～40mg的范围，特别优选10mg～30mg的范围。如果相对于单位体积(cm3)的前述多孔膜，前述防溶血剂的含量为1mg或以上，则可以充分防止溶血。另外，这里所述的“多孔膜的体积”是指含有多孔膜的空孔部分的体积。
具体地，在前述防溶血剂为缬氨酸时，其含量(重量)是，例如相对于单位体积(cm3)前述多孔膜，优选在5mg～50mg的范围，更优选在15mg～45mg的范围，特别优选在30mg～40mg的范围。
在前述防溶血剂为亮氨酸时，其含量(重量)是，例如相对于单位体积(cm3)前述多孔膜，优选在1mg～30mg的范围，更优选在5mg～25mg的范围，特别优选在10mg～20mg的范围。
在前述防溶血剂为止血环酸时，其含量(重量)是，例如相对于单位体积(cm3)前述多孔膜，优选在5mg～50mg的范围，更优选在15mg～45mg的范围，特别优选在30mg～40mg的范围。
在前述防溶血剂为ε-氨基己酸时，其含量(重量)是，例如相对于单位体积(cm3)前述多孔膜，优选5mg～50mg的范围，更优选10mg～45mg的范围，特别优选30mg～40mg的范围。
本发明的血液分离膜除了含有前述防溶血剂以外，例如，还可以含有多色霉素、BSA等添加剂。通过将它们和前述防溶血剂同时使用，可以进一步提高防溶血效果。
优选使前述血球分离膜的全体含有前述防溶血剂，但是，也可以例如在血球分离膜的至少一侧的表面上，特别是只在供给血液的表面上含有前述防溶血剂。
通常，希望血球难以从前述多孔膜的内部通过，例如，优选前述多孔膜具有血球不能通过的孔径的孔。在本发明中，所述的“血球不能通过的孔径的孔”不是指孔径比血球的球径小的意思，而是不论何种机理，只要结果是血球不能通过的孔径就可以。因此，在血球不能通过的孔径中还包含比血球的球径大的孔径。另外，根据本发明的血球分离膜，如前所述，例如即使在血球通过前述分离膜的情况下，也可以通过前述防溶血剂促进血清或血浆的展开速度，抑制血球的展开速度。在这种情况下，前述多孔膜不是在多孔膜内部完全阻止血球通过、保持前述血球的多孔膜，可以例如是血球一部分通过的多孔膜。
具体地，前述多孔膜优选具有孔径为0.1μm～20μm的孔，更优选具有孔径为1μm～10μm的孔，特别优选具有孔径为2μm～8μm的孔。
作为前述多孔膜没有特别的限定，可以使用迄今为止在血球分离中使用的各种材料。具体地，例如可以使用玻璃滤器，以及具有在厚度方向上平均孔径连续或不连续地减小的孔径分布的非对称性多孔膜等。
作为前述玻璃滤器，例如优选纤维密度稀疏的滤器，也可以使用市售的玻璃滤器，例如，Millipore公司制造的商品名为AP25等。
另外，在使用非对称性多孔膜作为前述多孔膜时，由于孔径在厚度方向上变化，因此例如伴随着血液在厚度方向上进入前述多孔膜内部血球不能缓慢通过，将血球保持在血球不能通过的孔径的部位。因此，不易产生堵塞，可以迅速且容易地分离血球。另外，在本发明中，所述的“平均孔径不连续地变小”是指，例如阶梯性地变小等。
前述非对称性多孔膜的孔径的最大孔径优选10μm～300μm的范围，最小孔径优选0.1～30μm的范围；更优选的最大孔径优选在100μm～200μm的范围，更优选的最小孔径在1μm～10μm的范围；特别优选的最大孔径在150μm～200μm的范围，特别优选的最小孔径在1μm～5μm的范围。
作为前述非对称性多孔膜的材料，没有特别的限制，例如，可以列举出聚酯、聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯、纤维素醋酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯乙烯等树脂。这些多孔膜可以单独使用，也可以将2种或多种组合后使用。其中优选例如聚砜、聚醚砜，特别优选聚醚砜。
另外，前述非对称性多孔膜可以使用前述各种树脂制造，也可以使用市售的非对称性多孔膜，例如U.S Filter公司制造的商品名为BTS-SP、Spectral Diagnostics公司制造的商品名为Primecare S/G的等。
前述血球分离膜的大小，例如可以根据供给的血液量等适当确定。具体地，在供给的血液量为120μL时，例如是长度4mm×宽度1.5mm×厚度50μm～长度50mm×宽度20mm×厚度2000μm，优选长度5mm×宽度3mm×厚度75μm～长度30mm×宽度15mm×厚度1250μm，更优选长度10mm×宽度5mm×厚度90μm～长度20mm×宽度12mm×厚度1100μm。另外，前述的长度表示血球分离膜的纵向的长度，宽度表示横向的长度，以下相同。
在使用玻璃滤器作为前述血球分离膜时，其厚度例如为200μm～2000μm的范围，优选500μm～1000μm的范围。另外，在供给的血液量为120μL时，其大小例如为长度4mm×宽度1.Smm×厚度100μm～长度50mm×宽度20mm×厚度2000μm，优选长度5mm×宽度3mm×厚度200μm～长度30mm×宽度15mm×厚度1250μm，更优选长度10mm×宽度5mm×厚度250μm～长度20mm×宽度12mm×厚度1100μm。
在使用非对称性多孔膜作为前述血球分离膜时，其厚度例如为50μm～400μm的范围，优选100μm～350μm的范围。另外，在供给的血液量为40μL时，其大小例如为长度4mm×宽度1.5mm×厚度50μm～长度50mm×宽度20mm×厚度400μm，优选长度5mm×宽度3mm×厚度100μm～长度30mm×宽度15mm×厚度350μm，更优选长度10mm×宽度5mm×厚度200μm～长度20mm×宽度12mm×厚度300μm。
本发明的血球分离膜的制造方法没有特别的限定，例如，包括在前述防溶血剂的分散液或在溶液中浸渍前述多孔膜后干燥，或者将前述分散液等滴加到前述多孔膜上使其浸透后，进行干燥的方法等。
前述分散液或溶液中的前述防溶血剂的浓度，例如在0.1重量％～5重量％的范围，优选在0.5重量％～4重量％的范围，更优选在2重量％～3重量％的范围。
另外，前述多孔膜由于可以使全血快速透过，所以在保持前述防溶血剂前，可以预先浸渍在例如羟丙基纤维素(HPC)、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素(CMC)等亲水性高分子等处理液中，进行亲水化处理。前述处理液的浓度例如为0.1重量％～50重量％的范围，处理时间例如为0.1小时～24小时的范围。作为前述溶液的溶剂，例如可以使用水和各种有机溶剂等，作为前述有机溶剂可以列举出乙醇等醇类等。
然后，如前所述，本发明的血液保持用具具有如下特征其包括分离血液中的血球的血球分离部和通过毛细现象将血液中的血清或血浆展开的展开部，前述血球分离部是前述本发明的血球分离膜。
作为本发明的血液保持用具，例如，可以列举出将前述展开部和前述血球分离部层叠的层叠型的实施方案A-1，非对称性多孔膜具有前述展开部和前述血球分离部的单层型的实施方案(A-2和A-3)以及血球分离膜具有血球分离部和展开部的单层型的实施方案。对A-1、A-2和A-3的方案在以下进行具体地说明。
(实施方案A-1)该实施方案是前述血球分离部为本发明的血球分离膜，前述展开部由多孔膜构成，且在前述展开部(展开用多孔膜)上层叠有前述血球分离膜的例子。在该实施方案中，前述血球分离膜的表面为血液供给部。
图1的剖面图表示前述血液保持用具的一个例子。如该图所示，该血液保持用具10的结构是，在展开部11的一侧的端部上层叠了血球分离部12，血球分离部12的表面为血液供给部13。在图1中，箭头A表示血液中的血清和血浆的展开方向(以下，图2～10中也相同)。
作为构成展开部11的展开用多孔膜，例如可以使用滤纸、醋酸纤维素膜、多孔膜、玻璃纤维膜。作为前述多孔膜的材料，例如可以列举出聚酯、聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯、纤维素醋酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯乙烯等树脂等，优选的是聚醚砜、聚碳酸酯。另外，也可以使用前述的非对称性多孔膜。如果使用前述非对称性多孔膜作为展开部，则即使在血球通过血球分离部时，也可以通过前述非对称性多孔膜的孔结构，在展开部中进一步进行血球分离。这些多孔膜可以单独使用，也可以将2种或多种组合使用。其中，优选的是，例如滤纸、醋酸纤维素膜、硝基纤维素膜、聚砜制多孔膜、聚酯制多孔膜、聚碳酸酯制多孔膜，特别优选的是滤纸、聚砜制多孔膜、聚酯制多孔膜。另外，由于可以与前述血球分离膜同样地进一步促进血清或血浆的展开，所以也可以施加亲水化处理。
对于前述展开用多孔膜的平均孔径，例如只要是可以通过毛细现象将血清或血浆展开，就没有特别的限制，优选0.1μm～30μm的范围，更优选1μm～100μm的范围，特别优选2μm～50μm的范围。该展开用多孔膜的大小，例如可以根据所供给的血液量等适当决定，在供给的血液量为40μL时，例如为长度4mm×宽度1.5mm×厚度50μm～长度50mm×宽度20mm×厚度400μm，优选长度5mm×宽度3mm×厚度100μm～长度30mm×宽度15mm×厚度350μm，更优选长度10mm×宽度5mm×厚度200μm～长度20mm×宽度12mm×厚度300μm。
另外，不仅是前述血球分离膜可以含有前述防溶血剂，而且前述展开用多孔膜也可以含有前述防溶血剂。
作为前述血球分离膜和展开用多孔膜的组合，没有特别的限制，优选例如使用玻璃滤器作为血球分离膜、使用非对称性多孔膜作为展开用多孔膜的组合，以及使用非对称性多孔膜作为血球分离膜、使用硝基纤维素膜作为展开用多孔膜的组合等。
本发明的血液保持用具，可以按以下方法制造例如在前述展开用多孔膜上只配置前述血球分离膜并进行层叠；或者确定前述展开用多孔膜和前述血球分离膜的位置后，将前述两者的端部粘合或压合等。
另外，前述展开用多孔膜优选通过前述支持体支持。这是因为，由此可以与前述展开用多孔膜的强度无关地得到足够强度的血液保持用具，且操作简便。作为形成前述支持体的材料，例如可以使用聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚氯乙烯、丙烯酸树脂、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)等塑料。前述材料可以使用任何一种，也组合使用二种或更多种。另外，如后所述，在使用血液保持用具，通过光学方法等直接测定时，前述支持体优选为光透过性，例如，可以使用聚苯乙烯、PET、丙烯酸树脂制造的支持体等。
然后，根据图1，对在血液保持用具10中添加血液制备血清或血浆试样的一个例子进行说明。
首先，将血液滴加到血球分离部12表面的血液供给部13。血液一边在血球分离部12内在厚度方向移动，一边分离为血球与血清和血浆。然后，被分离的血清和血浆到达展开部11，通过毛细现象在面方向上(该图中，箭头A方向)展开到展开部11内。此时，通过本发明的血液保持用具，由于血球分离部12含有前述防溶血剂，所以可以防止分离血球时产生的溶血，得到抑制了血球成分混入的血清或血浆试样。
在回收展开后的血清或血浆试样时，通过风干或自然干燥等干燥血液保持用具10。之后，可以从血液保持用具10剥离展开部11，并从展开部只切下血清或血浆的展开部分。
然后，将通过切下等而得到的切片放到例如实验管中，向其中添加萃取溶液并放置，由此萃取血清或血浆并进行回收。作为前述萃取溶液只要是可以萃取血清或血浆，且对血清或血浆中的分析对象成分的检测没有影响的就可以，没有特别的限制。例如，可以是缓冲液、生理盐水、精制水、蛋白溶液等以及它们的混合液。作为前述缓冲液，例如可以列举出含有磷酸、柠檬酸、盐酸、醋酸等的各种缓冲液等，其pH值，例如为6～8的范围。前述萃取溶液的添加量没有特别的限制，可以根据切片的大小等适当决定，例如，是切片体积的1倍～1000倍。另外，萃取时间也没有特别的限制，例如萃取时间为1分钟～300分钟。
另外，在使血清或血浆展开后，也可以通过切下展开部并直接离心分离而进行回收。
使用该回收液，可以测定血清或血浆中的分析对象成分。
另一方面，在该血液保持用具10中，也可以不通过萃取液回收保持在展开部11中的血清或血浆，而是直接进行分析。此时，预先使展开部11含有分析用试剂，形成试剂部。在展开部11配置试剂的方法，例如可以列举出印刷法、含浸法、喷雾法等。
前述分析试剂没有特别的限定，可以根据目标的分析对象成分的种类适当决定。作为前述试剂成分，例如可以列举出各种酶、磷酸盐和碳酸盐等缓冲物质，发色剂等。具体地，在分析葡萄糖时，可以含有葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-NADP、ATP和缓冲液等。
另外，如果在展开部11上，相对于血清或血浆的移动方向且并列地含有试剂，则可以在同一个血液保持用具中进行多项分析。此时，为了不混合多个项目的试剂，例如优选通过含有疏水性树脂溶液，在试剂部之间设置边界层。
通过这样的血液保持用具10，如前所述，如果供给血液并使血清或血浆展开，则可以在展开部11内，使各种分析对象成分分别和其检测试剂反应。通过电化学方法和光学方法(含目视)检查该反应的显色等，可以容易地进行分析。
(实施方案A-2)该实施方案是如下结构前述血球分离部为非对称性多孔膜，前述非对称性多孔膜进一步含有前述展开部，在前述非对称性多孔膜中，前述血球分离部和前述展开部位于面方向，供给血球侧是前述血球分离部，沿着前述供给的血液的展开方向的下流侧是展开部。也就是如下方案在一个非对称性多孔膜的面方向，存在有血球分离部和展开部，在一个非对称性多孔膜中，可以进行血球分离和血清或血浆的展开。
图2的剖面图表示前述血液保持用具的一个例子。如该图所示，该血液保持用具20由在厚度方向上平均孔径具有连续地或不连续的减小的孔径分布的非对称性多孔膜构成。箭头A方向的上流侧是血液分离部22，下流侧是展开部21。而且，血液分离部22的表面为血液供给部23。
前述非对称性多孔膜的孔径的最大孔径，例如为10μm～300μm的范围，优选50μm～150μm的范围；最小孔径例如为0.1μm～30μm的范围；更优选1μm～10μm的范围。
血液保持用具20的大小与前述同样地没有特别的限制，可以根据供给的血液检测体的量等适当决定。供给的全血约为100μL时，血液保持用具20整体的大小，例如为长度4mm×宽度1.5mm×厚度50μm～长度60mm×宽度20mm×厚度400μm，优选长度5mm×宽度3mm×厚度100μm～长度30mm×宽度15mm×厚度350μm，更优选长度10mm×宽度5mm×厚度200μm～长度20mm×宽度12mm×厚度300μm。另外，所述的长度是血液保持用具的长度方向的长度，所述的宽度是宽度方向的长度。
这种血液保持用具20，例如血液分离部22和展开部21不需要通过严密的边界线分开。对于血液保持用具20来说，如果在血液供给部23中滴加血液，则前述血液一边往厚度方向移动，一边分离为血球和血清或血浆，在其面方向(在该图中，为箭头A方向)进一步被展开。血液供给部23的大小，例如长度2mm×宽度1.5mm～长度15mm×宽度20mm，优选长度4mm×宽度3mm～长度10mm×宽度15mm，更优选长度4mm×宽度5mm～长度6mm×宽度12mm。该血液供给部23在厚度方向上的区域通常相当于血球分离部22。
该血液保持用具20由如前所述的单层的非对称性多孔膜构成。因此例如，含前述防溶血剂的溶液可以只在作为血球分离部22的部分中含有，或者也可以将前述非对称性多孔膜浸渍在前述溶液中，整体浸渍。
然后，根据图2，对在前述血液保持用具20中滴加血液制备血清或血浆试样的一个例子进行说明。
首先，向血液供给部23中滴加血液。前述血液一边在血液在厚度方向向分离部22的内部移动，一边分离出血球。然后，血清或血浆在其面方向(该图中，箭头A方向)，通过毛细现象在展开部21中展开。之后，可以与前述实施方案A-1同样地从展开部21回收血清或血浆。
(实施方案A-3)对于由具有实施方案A-2所示的这种血液分离部和展开部两者的非对称性多孔膜构成的血液保持用具，为了可以进一步提高血球的分离效率，优选在例如前述血球分离部和前述展开部的边界上进一步设置血球阻断部。具体地讲，在前述血球分离部和前述展开部之间，前述非对称性多孔膜的宽度方向上，形成只由具有血球不能通过的孔径的孔构成的血球阻断部。而且，其结构如下在供给血液时，沿着血液的展开方向，从前述血球阻断部开始的下流侧是展开部，前述血球阻断部与从前述血球阻断部开始的上流侧是血液分离部。作为这样的结构，例如，血液中的血球不仅在厚度方向移动，而且即使在面方向移动时，通过前述血球阻断部可以可靠地防止血球向展开部通过，只是将血清或血浆在展开部展开。另外，对于前述血液阻断部，优选例如在前述非对称性多孔膜的前述宽度方向上形成沟槽，从前述沟槽的底面到与该底面对应的非对称性多孔膜表面之间的部分作为前述血液阻断部。另外，如果没有特别的表示，本实施方案的血液保持用具是与前述实施方案A-2同样的条件(大小，材料等)。
图3的剖面图表示前述血液保持用具的一个例子。如该图所示，该血液保持用具30与前述实施方案A-2的血液保持用具同样地由单层的非对称性多孔膜构成，进一步在其宽度方向形成沟槽。从该沟槽的底面到与前述底面对应的非对称性多孔膜表面之间的部分成为血球阻断部32。而且，血球阻断部32和箭头A方向的上流侧为血球分离部，血球阻断部32的下流侧成为展开部31。另外，血球分离部的孔径较大的表面成为血液供给部33。
在前述非对称性多孔膜中，血球阻断部32的孔径，例如为0.1μm～50μm的范围，优选1μm～30μm的范围。
血液保持用具30的大小与前述同样地没有特别的限制，可以根据供给的血液检测体的量等适当决定。在供给的全血约为100μL时，血球阻断部32的大小，例如为长度0.1mm×宽度1.5mm×厚度10μm～长度10mm×宽度20mm×厚度400μm，优选长度0.2mm×宽度3mm×厚度15μm～长度8mm×宽度15mm×厚度350μm，更优选长度0.3mm×宽度5mm×厚度20μm～长度6mm×宽度12mm×厚度300μm。
对于前述沟槽，例如可以将前述非对称性多孔膜的表面的一部分压缩而形成所述沟槽。例如，可以通过旋转圆盘状滚筒并压缩，或者压缩到刀尖较钝的刀具无法切割的程度而形成所述沟槽。如此，在压缩形成沟槽时，在血球阻断部中也可能含有非对称性多孔膜的大孔径的孔，由于压缩导致孔变形、压坏，所以血球无法通过。
另外，例如可以使用切割机等刀具切取前述非对称性多孔膜的一部分形成前述沟槽。这时，沟槽的大小等与前述相同。
接着，作为本发明的血液保持用具的具体例子，针对血液检查用具而使用的实施方案使用图4～10进行说明。另外，本发明的血液保持用具并不限于此。
(实施方案B-1)图4的剖面图表示血液保持用具的第1方案(B-1)。如该图所示，血液保持用具40具有血液分离膜46和支持体44，在血液分离膜46的一端形成含有分析试剂的试剂部45。以露出血液分离膜46的一端(与试剂部45相反侧)的方式在血液分离膜46的一侧的表面层叠支持体44，并将该露出部分作为血液供给部43。
通过这种血液保持用具40，例如，如果在血液供给部43上滴加血液，则滴加的血液一边在血液分离膜46内沿箭头A方向移动，一边分离为血球和血清。另外，由于血液分离膜46如前述那样含有防溶血剂，所以防止血球的溶血的同时，将血球和血清分离。而且，被分离的血清在血液分离膜46内移动，在试剂部45中展开，在试剂部45中分析试剂和血清中的分析对象反应。例如可以通过电化学方法和光学方法(含目视)检测该反应。
(实施方案B-2)图5的剖面图表示血液保持用具的第2方案(B-2)。另外，如果没有特别的表示，本方案与第1方案(B-1)相同，以下所示的第3～第6方案(B-3～B-6)也相同。
如该图所示，血液保持用具50包括试剂层55和支持体54，所述试剂层55包含血液分析膜56和分析试剂。以露出其一端的方式在血液分析膜56的一侧的表面上层叠支持体54，该露出部分作为血液供给部53。另外，在作为血液分离膜56的另一侧的表面(与支持体层叠面相反侧的表面)且与血液供给部53相反侧的端部层叠试剂层55。
通过这种血液保持用具50，例如，在血液分离膜56内被分离的血清在层叠于血液分离膜56上的试剂层55中展开，试剂层55中的分析试剂和血清中的分析对象反应。
(实施方案B-3)图6的剖面图表示血液保持用具的第3方案(B-3)。如该图所示，血液保持用具60具有血液分离膜66、支持体64和67。在血液分离膜66的一侧表面上层叠支持体67，以露出其一端的方式在血液分离膜66的另一侧的表面上层叠支持体64。该露出部分成为血液供给部63。血液分离膜66具有3个含有分析试剂的试剂部，沿着图中的箭头A方向，依次形成其中的第1试剂部651、第2试剂部652和第3试剂部653。另外其中的第1试剂部651、第2试剂部652和第3试剂部653中分别含有第1分析试剂、第2分析试剂和第3分析试剂。
通过这种血液保持用具60，例如，血液分离膜66内被分离的血清首先在第1试剂部651中展开，血清中的分析对象与第1分析试剂反应。该反应液进一步在第2试剂部652中展开，与第2分析试剂反应。然后，该反应液最后在第3试剂部653中展开，与第3分析试剂反应。如前所述那样检测该反应即可。
这种血液保持用具60适用于使用多阶段反应测定分析对象的情形，根据其反应顺序，配置与第1试剂部651、第2试剂部652和第3试剂部653分别对应的试剂即可。
(实施方案B-4)图7的剖面图表示血液保持用具的第4方案(B-4)。如该图所示，血液保持用具70具有血液分离膜76、含有分析试剂的3个试剂层(751、752和753)、支持体74和77。，以露出其一端的方式在血液分离膜76的一侧的表面上层叠支持体74，该露出部分作为血液供给部73。另外，在血液分离膜76的另一侧的表面上，沿着图中的箭头A方向依次层叠第1试剂层751、第2试剂层752和第3试剂层753，通过这些试剂层再层叠支持体77。另外，第1试剂层751、第2试剂层752和第3试剂层753分别含有第1分析试剂、第2分析试剂和第3分析试剂。
通过这种血液保持用具70，例如，血液分离膜76被分离的血清分别在血液分离膜76上层叠的第1试剂层751、第2试剂层752和第3试剂层753上展开。然后，血清中的分析对象与各试剂层(751、752和753)的各分析试剂反应。因此，例如如果在各试剂层中配置分别与分析项目对应的试剂，则在同一用具中，可以针对同一检测体进行多项目的分析。
(实施方案B-5)图8的剖面图表示血液保持用具的第5方案(B-5)。
如该图所示，血液保持用具80具有血液分离膜86、含有分析试剂的试剂层85、支持体84和87。以，其露出其一端的方式在血液分离膜86的一侧的表面上层叠支持体84，该露出的部分作为血液供给部83。另外，在血液分离膜86的另一侧的表面上层叠具有通孔的支持体87，在前述通孔对应的部分上层叠试剂层85。
另外，如图9的剖面图所示，沿着箭头A的方向依次在支持体97上也可以配置3个通孔，在与各通孔对应的血液分离膜86的表面上分别设置试剂层(851、852和853)。该血液保持用具90与第4方案(B-4)同样地适用于多项目的检查。另外，在与图8相同的位置上，标注同一符号。
(实施方案B-6)图10的剖面图表示血液保持用具的第6方案(B-6)。
如该图所示，血液保持用具100具有血液分离膜102、展开层101、支持体104和107。以露出其一端的方式在展开层101的一侧的表面上，层叠支持体107，在另一侧的表面上层叠有支持体104，并且，在该露出部分中，层叠血液分离膜102。该血液分离膜102的表面作为血液供给部103。然后，展开层101上沿着图中的箭头A方向依次形成含有分析试剂的第1试剂部151和第2试剂部152。然后，第2试剂部再兼作第1检测部。相对于该第2试剂部(第1检测部)，箭头A方向的下流侧作为第2检测部153。
以下，使用血液保持用具100，通过抗原抗体反应进行血清内成分的分析的方法的一个例子进行说明。另外，在第1试剂部151中配置对分析对象(抗原)进行标记化的第1抗体和对后述的第2抗体标记化的第3抗体。在第2试剂部152中，对抗原未标记的第2抗被固定。前述标记化的第1抗体和标记化的第3抗体分别使用着色胶乳(colored latex)粒子作为标记。
首先，如果在血液供给部103上滴加血液，则通过血液分离膜102后分离出血清，分离出的血清在展开层10内沿箭头A方向移动。前述血清先在第1试剂部展开，血清中的抗原和标记化的第1抗体通过抗原抗体反应形成复合体。含有该复合体、未与抗原结合的标记化的第1抗体和标记化的第3抗体的血清进一步在第2试剂部152中展开。这里，前述复合体和标记化的第3抗体通过抗原抗体反应与固定在第2试剂部152的未标记的第2抗体结合，并被第2试剂部152捕捉。然后，含有未与抗原结合的标记化的第1抗体、未被第1检测部(第2试剂部)152捕捉的前述复合体和标记化的第3抗体的血清再在第2检测部153展开。
然后，如下所述进行测定。首先，在第1检测部(第2试剂部)152中，检测出被捕捉的抗原和标记化的第1抗体的复合体。然后，分别在第1检测部152中，检测被捕捉的标记化的第3抗体；在第2检测部153中，检测在第2试剂部152中未被捕捉的标记化的第3抗体。另外，可以通过以特定波长对标记化的第1抗体和标记化的第3抗体的各标记(着色胶乳)测定吸光度来进行这些检测。然后，由标记化的第3抗体的检测结果求得第2试剂部152中的捕捉效率。由该捕捉效率和前述复合体的表观上的检测结果算出实际的复合体量(抗原量)。如此，通过一并测定标记化的第3抗体，可以使用捕捉效率进行补正，所以本实施方案可以提高分析对象(抗原)的分析精度。
实施例(实施例1、比较例1)制造前述实施方案中A-1中的图1所示的血液保持用具，使用该用具进行血球分离，确认是否有溶血。以下，防溶血剂的浓度(％)如果没有特别的表示，则以100分率表示溶剂体积(100mL)中的防溶血剂的重量(单位g)(单位(w/v)％)。
(展开用多孔膜)将市售的聚醚磺酸制造非对称性多孔膜(商品名为PrimecareS/GSpectral Diagnostics公司制造)在以下条件下进行洗净，将其作为展开用多孔膜使用。该多孔膜的大小为厚度290μm、长度20mm、宽度6mm，其最大孔径为200μm，最小孔径为2μm。洗净首先是将前述非对称性多孔膜在精制水中浸渍、放置10分钟后，将所使用的精制水替换为新的精制水，共进行该操作5次。然后，将前述非对称性多孔膜风干半天，再在干燥器中干燥半天后，得到前述展开用多孔膜。
(血液分离膜)预先将防溶血剂溶于溶剂(蒸馏水)中，准备下述表1所示的各防溶血剂。然后，在厚度1200μm、长度12mm、宽度6mm的市售的玻璃滤器(商品名AP25Millipore公司制造)中，滴加30μL下述表1所示的各种浓度的防溶血剂、使其干燥。将干燥后的玻璃滤器作为血液分离膜使用。下述丝提取物使用FUKUI KINU SHOJICO，LID.制造的商品名为Silk Extract。
(血液保持用具的制造方法)准备长50mm、宽6mm、厚180μm的PET薄膜作为支持体，在其上用粘合剂粘合前述展开用多孔膜，再如图1所示那样，在前述展开用多孔膜的一侧的端部上配置前述玻璃滤器。然后，在未配置玻璃滤器的前述展开用多孔膜的表面上配置覆盖用PET(厚度100μm)。将其作为血液保持用具使用(实施例1-1～1-8)。
另一方面，作为比较例1，除了使玻璃滤器含有5％甘氨酸以外，与前述实施例1同样地制造血液保持用具。
(血球的溶血)在制造的各血液保持用具的玻璃滤器的表面上，滴下100μL的全血(血细胞比容38％)，分离血球和血浆，并使前述血浆展开。然后，经过2分钟后，确认血球是否有溶血。另外，使血浆完全展开直到浸透到展开部的顶端(在图1中，是展开部11的右端部)。血球的溶血是通过展开的血浆是否会被血球内的Hb着色成红色而来进行判断。
表1
如前述表1所示，在比较例1中发现有溶血，含有同浓度或该浓度以下的防溶血剂溶液的实施例1(1-1～1-8)可以防止溶血。
(实施例2、比较例2)除了含有下述表2所示的各种防溶血剂以外，与实施例1同样地制造血液保持用具，使用该保持用具，并确认血球的展开。
(血球展开距离的测定)血球展开距离是如下测定的距离在血浆展开而达到展开部的顶端(图1中，是展开部11的右端部)的时候，从滴下的展开用多孔膜的血液侧的端部到血球展开的顶端(图1中，是展开部11的左端部)的距离。
表2
如前述表1和表2所示，相对于5％甘氨酸(比较例2)所产生的溶血，含有等量或该含有量或以下的防溶血剂的实施例2(2-1～2-6)当然可以防止溶血，与比较例2相比，血球的展开距离也得到抑制。如此可知，含有前述防溶血剂的本实施例的血液保持用具，通过抑制血球展开和促进血浆展开，可以充分分离血球和血浆，所以血浆的展开率增加，血浆的回收率提高。
(实施例3、比较例3)除了使用如下所示的展开用多孔膜(滤纸、醋酸纤维素膜)和血球分离用多孔膜(玻璃滤器)，使用缬氨酸作为防溶血剂以外，与前述实施例1同样地制造血液保持用具(实施例3-1、3-2)。另外，作为比较例3，除了不使血球分离用多孔膜含有缬氨酸以外，与前述实施例3-1或3-2同样地制造血液保持用具(比较例3-1、3-2)。然后，使用它们与实施例1和实施例2同样地分离血球，确认是否有溶血和血球的展开。这些结果如下述表3所示。
(滤纸)商品名3MMchr(Whatman公司制造)材料纤维素制造厚度340μm
重量185g/mm2孔隙率(porosity)20sec/100mL/inch2(醋酸纤维素膜)商品名C300A293C(东洋滤纸公司制造)材料醋酸纤维素厚度185μm重量40g/mm2(血球分离用多孔膜)使用厚度1200μm的玻璃滤器(商品名AP25Millipore公司制造)。
表3
如前述表3所示，玻璃滤器中未含有缬氨酸的比较例3-1、3-2会产生溶血，相对于此，实施例3-1、3-2都没有产生溶血。另外，实施例3-1显示出比比较例3-1更短的血球展开距离，实施例3-2也显示出比比较例3-2更短的血球展开距离。由此，与前述实施例2同样地，通过本实施例的血液保持用具可以抑制血球的展开，而只增加血浆的展开，并提高其回收率。另外，在前述实施例3-1和3-2中，血球展开距离不同，这是由展开用多孔膜的种类引起的。
(实施例4、比较例4)除了含有各种浓度(5％、2％、1％)的缬氨酸溶液、2％的亮氨酸溶液作为防溶血剂以外，与实施例1同样地分别制造10个血液保持用具，使用其回收血浆，测定血浆成分(实施例4)。
作为比较例4，除了使玻璃滤器含有规定的浓度(20％、5％、0％)的甘氨酸溶液以外，与前述实施例1同样地分别制造10个血液保持用具。
在各血液保持用具中滴加全部的血液检测体，进行血球分离和血浆展开。血浆展开后，将展开用多孔膜的只展开血浆的部分切下10mm×6mm的大小。针对各防溶血剂收集10块该切片，将它们用于直接离心分离机(15,000g、10分钟)，回收血浆。将该血浆作为试样测定各成分量。另外，使用离心分离(3000g、10分钟)前述全部血液检测体而得到的血浆作为对照。
(成分量的测定)使用如下所示的市售的用品，根据它们的使用方法，通过自动分析器(商品名日立7070，日立制作所公司制造)测定各成分量。在各种测定中，使用精致水作为空白剂。
1.高比重脂蛋白胆固醇(HDL-C)商品名LIQUI TECH HDL-C(Roche Diagnostics公司制造)2.淀粉酶(AMY)商品名AMY-NP(DENKA SEIKEN公司制造)3.白蛋白(ALB)商品名Clinimate albumin(第一化学药品公司制造)4.谷草转氨酶(GOT)商品名LIQUI TECH GOT IFCC(Roche Diagnostics公司制造)5.γ-谷胺酰转肽酶(GGT)商品名γ-GTP-J-HA Wako(和光纯药公司制造)6.谷丙转氨酶(GPT)商品名LIQUI TECH GPT IFCC(Roche Diagnostics公司制造)7.甘油三酸酯(TG)商品名LIQUI TECH TG(Roche Diagnostics公司制造)
8.乳酸脱氢酶(LDH)商品名LDH II-HA Wako(和光纯药公司制造)9.总蛋白质(TP)商品名RD总蛋白质(Roche Diagnostics公司制造)10.总胆红素(T-Bil)商品名T-Bil-V5(AZWELL公司制造)11.肌酸酐(CRE)商品名LIQUI TECH Creamtinine PAP(Roche Diagnostics公司制造)12.总胆固醇(TC)商品名T-Cho-KL(国际试剂公司制造)13.碱性磷酸酶(ALP)商品名碱性Phospha II-HR Test Wako(和光纯药公司制造)14.尿素氮(BUN)商品名尿素氮II-HA Test Wako(和光纯药公司制造)15.尿酸(UA)商品名Uricolor·Liquid尿酸(小野药品公司制造)16.果糖胺(FRA)商品名LIQUI TECH Fructosamine(Roche Diagnostics公司制造)17.葡萄糖(Glu)商品名LIQUI TECH Glucose(Roche Diagnostics公司制造)18.肌酸磷酸激酶(CPK)商品名CK E-HA test Wako(和光纯药公司制造)对于这些实施例4和比较例4的结果，将以空白的测定值为100％的情况下的相对值(平均％)表示在下述表4中。
表4
如前述表4所示，根据添加甘氨酸的比较例，发现在各成分的测定精度方面有偏差。特别是，对GGT来说，其结果是，相对空白的相对值为50％左右。相对于此，根据添加缬氨酸或亮氨酸的血液保持用具，可以得到各成分都优异的测定结果，特别是对GGT也同样得到了优异的结果。另外，实施例4完全可以防止溶血，但是在比较例4中，含有5％的甘氨酸溶液的血液保持用具确认有溶血。另外，含有20％的甘氨酸溶液的比较例4的血液保持用具的结果是，在所有的成分项目中，都显示出低的相对值。据认为，这是由于，高浓度的甘氨酸导致血球萎缩，并引起血浆成分的体积增加，结果是产生了血浆成分的稀释。根据以上结果，通过本发明的血液保持用具可以防止溶血，且可以对各成分的测定没有影响地制造试样。
如上所述，根据本发明的血球分离膜，防止血球溶血的同时，将血球与血清或血浆分离，从而可以有效地制备血清或血浆试样。另外，由此制备的试样对各种成分的测定系统的影响很少，所以可以高精度地测定。因此，本发明的血球分离膜和血液保持用具用于例如前述的临床医疗等领域中。
权利要求
1.一种血球分离膜，其含有将血液中的血清或血浆与血球分离的多孔膜，所述多孔膜含有至少1种选自疏水性氨基羧酸、由丝得到的蛋白质、Tris、TES、ε-氨基己酸、止血环酸和肝素的防溶血剂。
2.根据权利要求1所记载的血球分离膜，其中疏水性氨基羧酸是疏水性氨基酸。
3.根据权利要求2所记载的血球分离膜，其中疏水性氨基酸是至少1种选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的氨基酸。
4.根据权利要求1所记载的血球分离膜，其中所述多孔膜含有至少1种选自缬氨酸、亮氨酸、ε-氨基己酸、止血环酸和丝提取物的防溶血剂。
5.根据权利要求1～4任一项所记载的血球分离膜，其中相对于单位体积所述多孔膜，所述防溶血剂的含量为1mg～50mg，所述单位体积的单位是cm3。
6.根据权利要求1～5任一项所记载的血球分离膜，其中多孔膜是玻璃滤器和在厚度方向平均孔径连续或不连续地减小的孔径分布的非对称性多孔膜之中的至少一种。
7.根据权利要求6所记载的血球分离膜，其中所述非对称性多孔膜的材料为至少1种选自聚砜、聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚芳基酰肼的树脂。
8.根据权利要求6或7所记载的血球分离膜，其中在所述非对称性多孔膜中，其最大孔径在30～300μm的范围，其最小孔径在1～30μm的范围。
9.根据权利要求1～8任一项所记载的血球分离膜，其中在血球分离膜的至少一个表面侧含有所述防溶血剂。
10.一种血液保持用具，其包括分离血液中的血球的血球分离部和展开血液中的血清或血浆的展开部，所述血液分离部是所述权利要求1～9任一项所记载的血球分离膜。
11.根据权利要求10所记载的血液保持用具，其中在所述展开部上层叠有所述血球分离部。
12.根据权利要求10～11任一项所记载的血液保持用具，其中所述展开部是多孔膜。
13.根据权利要求10所记载的血液保持用具，其中血液分离膜具有血球分离部和展开部。
14.根据权利要求12所记载的血液保持用具，其中所述多孔膜的材料为至少1种选自聚砜、聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚芳基酰肼的树脂。
15.根据权利要求10所记载的血液保持用具，其中所述血球分离膜为非对称性多孔膜，所述非对称性多孔膜进一步具有所述展开部，在所述非对称性多孔膜中，所述血球分离部和所述展开部位于面方向，供给血液侧是所述血球分离部，沿着所述被供给的血液的展开方向，下流侧是展开部。
16.根据权利要求15所记载的血液保持用具，其中所述血球分离膜为非对称性多孔膜，所述非对称性多孔膜进一步具有所述展开部，在所述非对称性多孔膜中，所述血球分离部和所述展开部位于面方向，在所述血球分离部和所述展开部之间且在所述非对称性多孔膜的宽度方向上，形成只由具有血球不能通过的孔径的孔构成的血球阻断部。
17.根据权利要求16所记载的血液保持用具，其中在所述非对称性多孔膜中，在所述宽度方向形成沟槽，从所述沟槽的底面到与该底面对应的非对称性多孔膜表面之间的部分是血球阻断部。
18.根据权利要求10～17任一项所记载的血液保持用具，其中所述展开部进一步含有至少1种选自疏水性氨基羧酸、由丝得到的蛋白质、Tris、TES、ε-氨基己酸、止血环酸和肝素的防溶血剂。
19.根据权利要求10～18任一项所记载的血液保持用具，其中在所述展开部形成含有分析试剂的试剂部。
20.根据权利要求10～19任一项所记载的血液保持用具，其中进一步具有含试剂的试剂层。
全文摘要
本发明提供防止血球溶血且将血清或血浆与血球分离的血球分离的分离膜。本发明的血球分离膜是通过使从所供给的血液中分离血球的多孔膜含有下述溶液并进行干燥而得到的，其中该溶液含有疏水性氨基羧酸、由丝得到的蛋白质、Tris、TES、ε－氨基己酸、止血环酸或肝素。
文档编号A61K35/16GK1759316SQ20048000655
公开日2006年4月12日 申请日期2004年3月9日 优先权日2003年3月10日
发明者田中义行, 岛田健太郎, 冈本雅司, 中村勤 申请人:爱科来株式会社