专利名称：血液、血浆或滑液制品的抗凝处理的制作方法
技术领域：
本发明涉及用可以适度地与钙结合的抗凝剂对血液、血浆或滑液制品进行抗凝处理，以及任意地用一种可溶性钙盐把钙离子活性调节到生理水平的方法。
背景生物液体，具体说，血液、淋巴、滑液及脑液以及上述液体的无细胞制剂，如血浆，可以在流变学，即粘性-弹性，性质上发生激烈的变化。这些液体可以从一种流变学性质与水相似的液体转变为一种流变学性质与松软干酪更相似的凝胶状物质。上述流变学转变，通常被称为凝固或凝块，可以在生物液体被从其天然环境中取出并收集于某种人造容器中时发生。
为了防止在收集生物液体时发生凝固，应该添加一些具有抗凝特性的物质。被用于抑制凝固的物质，也称抗凝剂，包括草酸盐、EDTA、柠檬酸盐、肝素及水蛭素。这些抗凝剂或是能对参与凝固作用的酯产生特异性抑制作用，或是可以改变生物液体中的条件，从而使凝固过程无法进行。这些条件包括自由钙离子浓度，也称Ca2+活性，以及pH。
根据已有的理论，一些抗凝剂的作用机制是抗凝剂与Ca2+离子形成复合物从而使生物溶液中自由Ca2+的水平，也即Ca2+活性降低到一个无效的水平。因此可以理解，凝固过程需要有一定水平的Ca2+活性才能进行。本发明具体涉及的是后面一种抗凝作用，即当钙活性低于0.8mM或pH值低于7时，凝固作用受到阻碍。
如果是通过降低Ca2+活性来对生物液体进行抗凝处理，那么通过添加Ca2+，如CaCl2溶液，来使钙活性恢复到允许凝固的水平即可使生物溶液恢复到可凝固状态。
以可逆的方式，即以允许液体恢复到可凝固状态的形式，来对生物液体进行抗凝处理的过程是液体凝固活动分析所常用、也是所必需的。草酸盐、EDTA、柠檬酸盐是一些根据已有工艺通过降低生物液体中的Ca2+活性来行使功能的抗凝剂的例子。另外，根据已有工艺，任何能够充分地降低生物液体中的Ca2+活性的物质都可以充当抗凝剂。
根据已有工艺，所有通过降低Ca2+活性而充当抗凝剂的物质形成相对稳定的Ca2+复合物，这些复合物的特征在于其表观解离常数等于或小于0.5mM。例如，柠檬酸盐与EDTA是这类抗凝剂中最常用的，其中的柠檬酸盐所形成的Ca2+复合物在生理状态下的表观解离常数是大约为4mM。Ca2+EDTA复合物及Ca2+草酸盐复合物被认为结合得较紧密。
如上所讨论的，生物液体中凝固分析物的分析通常采用的是经过柠檬酸盐抗凝处理的样品。由于柠檬酸盐对Ca2+的亲和力相对较低，所以使用最少量的柠檬酸盐进行抗凝，从导致生物溶液中蛋白及磷脂-蛋白结构的变性和脱稳定来考虑，用柠檬酸盐进行抗凝是温和的。然而，用柠檬酸盐进行抗凝被认为有一些不利影响。例如，在经过柠檬酸盐处理的血液或血浆中的凝血因子VIII，比起血液循环中的，稳定性就比较差。另外，对经过柠檬酸盐处理的血液或血浆进行激活凝血酶原时间(activated prothrombin time，APTT)分析，结果表明稳定性有限。因此，根据已有工艺，一些凝固分析物显示了一定程度的不稳定性，这需要在临床实验的常规操作给予特别的考虑。这些更加严格的常规操作给医疗实验步骤增加了费用和不便。
当用一种经过抗凝处理的生物液体样品进行各种不同的凝固活性分析时，将样品与包括Ca2+的试剂混合。所添加的Ca2+的数量应该足以使反应混合物中Ca2+的浓度处于0.8至8mM的范围，在上述条件下凝固活性得以表现。
虽然通常都是首先通过降低Ca2+活性来对一生物液体进行抗凝处理，但这一过程在某些方面并不合用。例如，如上所讨论的，一些我们所关心的结构变性了或变得不稳定了。另外，在一个给定的过程中，不可能用添加Ca2+来完全平衡添加抗凝剂的影响。重新被钙化的样品中的Ca2+与天然液体中的很可能会有所不同，而且，在一系列此种液体的样品中，Ca2+活性的变化比起其在原来的天然液体中的变化还要大。被重新钙化的生物液体中的钙活性偏离天然水平，也即生理水平的偏差最可能对凝固化验系统及其结果产生不合需要的影响。
一个与通过Ca2+的减少而造成的抗凝作用产生实际问题相关的医疗领域是血液库存行业。待被用于输血的血液或血浆通常都是经过抗凝处理的。这是因为，凭借目前的技术，天然的血液或血浆在有机体外只能被处理很短的一段时间内而不致凝固。
由于柠檬酸盐毒性低、新陈代谢快而且具有良好的抗凝特性，所以它是血液库存行业通常使用的抗凝剂。在许多情形中，在输血用血液或血浆中柠檬酸的含量并不致给受血的患者造成不利影响。但在一些情形中，特别是当患者肝功能失调时，用柠檬酸盐抗凝的血液及血浆就不能很好地被耐受。由于柠檬酸盐在这些患者中代谢缓慢，所以它会使Ca2+活性显著降低从而导致痉挛和肠胃不适。
需要有一种对血液、血浆及滑液制品进行抗凝处理的改善的方法，用以改善这些制品被用于运输和贮存、输血、止血及凝血特性分析时的特性。
本发明的描述本发明提供了一种对血液、血浆及滑液制品进行抗凝处理的方法。该方法包括异柠檬酸盐，以及供选的可溶性钙盐的添加。
本发明的方法对于完成，例如，如下过程是有用的1)增加经过抗凝处理的制品中的凝固分析物的稳定性并减少其变性，2)使凝固分析物的化验系统中的Ca2+活性更接近生理水平并减小Ca2+活性的偏差，3)当经过柠檬酸盐抗凝处理的血液或血浆被输注给患者时，减少Ca2+的降低效果。
因此，本发明的一个方面涉及的是一种对血液、血浆或滑液制品进行抗凝处理的方法。它包括把有效剂量的异柠檬酸盐加入到制品中的步骤。
在本发明这一方面的一个实施例中，这一方法另外还包括用一可溶性钙盐把经过抗凝处理的制品中钙离子的活性调节到生理水平的步骤。
在本上下文中所提及的是，可以通过添加柠檬酸盐或其它与钙结合的物质来降低本发明的经过抗凝处理的制品中钙离子的活性，而且也可根据特定的目的对pH进行调整。
在本发明这一方面的一个优选实施例中，异柠檬酸盐的有效用量是每升血液制品含5-50mmol或者每升血浆或滑液制品含7-70mmol，而在一个最优选的实施例中，异柠檬酸盐的用量是每升血液制品含15-25mmol，或者每升血浆或滑液制品含25-35mmol。
本发明的另一方面涉及的是一种含有抗凝剂量的由异柠檬酸盐组成的抗凝剂的血液、血浆或胃液制品。
在本发明这一方面的一个实施例中，抗凝剂除了包含异柠檬酸盐以外，还包含有柠檬酸盐。
在本发明这一方面的一个优选实施例中，异柠檬酸盐的抗凝剂量是每升血液样品含5-50mmol或者每升血浆或滑液制品含7-70mmol，而在一个最优选的实施例中，异柠檬酸盐的抗凝数量是每升血液制品含15-25mmol或者每升血浆或滑液制品含25-35mmol。
本发明的另一方面涉及的是把根据本发明的血液、血浆或滑液制品用于运输及贮存。被运输及贮存的血液、血浆或滑液制品随后可以被直接用于输注给患者。
本发明的另外一个方面涉及的是把根据本发明的血液、血浆或滑液制品用于这些制品的止血或凝固特性的分析，即用于诊断目的。
本发明的另一方面涉及的是一个含有一等渗或轻微高渗的异柠檬酸盐溶液的血样采样容器。
本发明的血液采样容器的另外一个实施例包含有一个十分之一容器体积的0.1-0.5M的异柠檬酸盐溶液。
根据本发明的血液采样容器除了含有异柠檬酸盐之外，另外还可以包含使钙离子的最终活性达到大约1mM的有效剂量的氯化钙。
本发明的血液采样容器优选地是常规的，任意地是抽真空的，用于处理血液及血浆制品的试管、注射器或塑料袋，它们随时可被送到负责血液采样及分析的实验室。
本发明的另外一个方面涉及的是用于对包含有异柠檬酸盐的血液、血浆或滑液制品进行分析的试剂。这些试剂应被放置于带有标签和使用说明的容器中。
附图的描述
图1.在凝血酶原复合物(Prothrombin Complex，PK)系统中加入柠檬酸盐，不加柠檬酸盐(实心圆)，5mmol/L柠檬酸盐(空心圆)，10mmol/L柠檬酸盐(实心三角形)以及20mmol/L柠檬酸盐(空心三角形)后的凝血酶原复合物(PK)时间。通过电位来确定每一数据点的钙活性。所有的实验点代表合并的血浆。图2.在凝血酶原复合物(Prothrombin Complex，PK)系统中加入异柠檬酸盐，不加异柠檬酸盐(实心圆)，5mmol/L异柠檬酸盐(空心圆)，10mmol/L异柠檬酸盐(实心三角形)以及20mmol/L异柠檬酸盐(空心三角形)后的凝血酶原复合物(PK)时间。通过电位来确定每一数据点的钙活性。所有的实验点代表合并的血浆。图3.在凝血酶原复合物(PK)系统中加入配体，柠檬酸盐(实心圆)，异柠檬酸盐(空心圆)后的凝血酶原复合物(PK)时间。每一数据点的钙活性是大约2mmol/L。所有的实验点代表合并的血浆。图4.在一个用于凝固分析的系统中Ca2+的缓冲能力。在1至4mm的Ca2+活性范围确定其缓冲能力。所得的是最终加入5mM柠檬酸盐或异柠檬酸盐的结果。图5.在一个用于凝固分析的系统中Ca2+的缓冲能力。在1至4mM的Ca2+活性范围确定其缓冲能力。所得的是最终加入10mM柠檬酸盐或异柠檬酸盐的结果。图6.被收集于混合物中的血液中凝血因子VIII复合物的稳定性，其中上述的混合物含有0.05mol/L的柠檬酸盐及0.08mol/L异柠檬酸盐(实心圆)，0.20mol/L异柠檬酸盐(空心圆)以及0.13mol/L柠檬酸(三角形)。把血液于室温下分别贮存0.5小时，6小时，1天及2天后把血浆分离出来并确定其中的凝血因子VIII复合物的活性。所有的实验点代表的都是从5个受试者收集的血样的平均结果。图7.被收集于混合物中的血液中激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)的稳定性，其中上述的混合物分别含有0.05mol/L的柠檬酸盐及0.08mol/L异柠檬酸盐(实心圆)，0.20mol/L异柠檬酸盐(空心圆)以及0.13mol/L柠檬酸盐(三角形)。把血液于室温下分别贮存0.5小时、6小时、1天及2天后把血浆分离出来并确定其中的APTT。所有的实验点代表的都是从5个受试者收集的血样的平均结果。图8.被收集于混合物中的血液中凝血酶原时间，PT，的稳定性，其中上述的混合物分别含有0.05mol/L的柠檬酸盐及0.08mol/L的异柠檬酸盐(实心圆)，0.20mol/L异柠檬酸盐(空心圆)以及0.13mol/L柠檬酸盐(三角形)。把血液于室温下分别贮存0.5小时、6小时、1天及2天后把血浆分离出来并确定其中的PT。所有的实验点代表的都是从5个受试者收集的血样的平均结果。
实验的描述材料及方法遵从生产商的建议使用以下试剂来确定激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶原复合物(PK)化验、凝血因子VIII及血纤蛋白D-二聚体PTT Automate，DiagnosticaStago，Asnieres-sur-Seine，France；ThromborelS，Behring DiagnosticsGmbH，Marburg，Germany；PK-reagent GHI 129，Global HemostasisInstitute MGR，Linkoping，Sweden；and CoamaticFactor VIII，Chromogenix，Molndal，Sweden。试验是在-Automated CoagulationLaboratory instrument，ACL，model 810 (Instrumentation Laboratory，Milan，Italy)上进行的。
用一内含0.5mL抗凝剂的Monovette(Sarstedt，Numbrect，Germany)管从肘前静脉抽取4.5mL血液。Monovette管含有根据已有工艺的抗凝剂。当用根据本发明的抗凝剂进行各种不种的实验时，把Monovette管打开并把原来的抗凝剂去除，然后用0.15M NaCl漂洗管子，并装入0.5mL选定的抗凝剂。把2mL经过抗凝处理的血液于8000xg离心3分钟获得血浆，然后把血浆转移到一个塑料管中。在一些实验中，上述血浆将在-70℃被保存20天以上，然后再被用于分析。例7中经过柠檬酸盐抗凝处理的血浆来源于22个健康个人及120个患者，其显示身份的标签已被除去，是蒙Tomas Lindahl允许由Department ofClinical Chemistry and Laboratory of Clinical Chemistry，University Hospital，Linkoping，慷慨馈赠的礼物。来源于健康个人的血浆在分析前于-70℃贮存了大约六个月的时间。来源于患者的血浆则在收集后6个小时内即被分析。
DL-异柠檬酸三钠，邻苯二甲酸、2，6-二氨基嘌呤(半硫酸盐)，反乌头酸、均丙三羧酸、以及膘嘌呤分别是Sigma Chemical Co.StLouis，MO的产品I-1252，P-2944，D-3289，A-7376，T-9251，以及A-8626；CaCl2柠檬酸及草酸分别是Merck，Darmstadt，Germany的产品2382，244及495；柠檬酸三钠是Riedel-de Haen，Seelze，Germany的产品32320；乙酸乙酯是BDH，England的产品10108；甲基丙二酸是Fluka AG，Buchs SG，Switzerland的产品1750343；二甲基丙二酸是Aldrich-Chemie，Steinheim，Germany的产品D16800-9。亚氨基二乙酸盐是Ega-Chemie KG，Steinhein beiHeidenheim，Germany产品号120-0。
把异柠檬酸三钠溶于最少量的稀释盐酸中以36％的产率制备异柠檬酸，其pH值介于0至1之间，用乙酸乙酯重复提取5次并干燥。缺乏维生素K依赖型凝血因子的牛血清及兔脑促凝血酶原激酶是来源于上面所详细描述的PK-试剂GHI 129的相应组份。血浆中Ca2+活性及pH是用一ICA2(Radiometer，Copenhagen，Denmark)装置通过电位确定的。例1为了鉴定可以充当生理水平Ca2+，即大约1.3mM的Ca2+，的缓冲液的化合物，通过实验试验了已报导的解离常数介于0.5至5mM之间或者引起兴趣的水溶性化合物。下面把这些化合物称为Ca2+配体或简单地称为配体，进行下面所描述的实验以推断在与生理相似的条件以及在对Ca2+缓冲有用的配体浓度下的表观解离常数。
把含有20mM Hepes的200mM的配体溶液调到pH7.4并把它与等体积的100mM CaCl2溶液相混合。用0.15mM的NaCl把这些混合物按1∶2，1∶4，1∶8，及1∶16稀释。通过电位确定所有的Ca2+活性低于10mM且pH介于7.0至7.6之间的混合液及稀释液的Ca2+活性及pH。根据通过实验确定的Ca2+活性以及配体和Ca2+的化学当量水平可以确定出Ca*配体复合物的推定的表观解离常数(取所有可供数据的平均值)。在表1中给出了每一个配体的平均值及标准偏差(SD)、被平均的测定次数(n)以及已发表的估计值。表1配体 kd±S.D. n 已发表的估计值(mM) (mM)甲基丙二酸盐 22±3 3 22.4(于0.1M NaClO4中)草酸盐(沉淀) 5.0(于0.1M KNO3中)亚氨基二乙酸盐 29±12 2 8.1(于1M KNO3中)二甲基丙二酸盐 25±7330.2(于0.1M NaClO4中)邻苯二甲酸盐 26±733.9(于0.1M KCl中)2，6-二氨基嘌呤 50±24 2 1.6(于0.1M KNO3中)腺嘌呤 70±40 2 1.1(于0.1M KNO3中)反乌头酸盐 29±53均丙三羧酸盐 22±53异柠檬酸盐 4.5±0.6 5柠檬酸盐 0.5±0.05 4 0.58实验表明，在我们所选择的化合物中，只有柠檬酸盐和异柠檬酸盐这两种化合物能够形成表观解离常数接近生理Ca2+活性水平，即大约1.5mM的复合物。随后把这两种配体充当Ca2+缓冲物质及抗凝剂进一步进行试验。然而，完全可以找到具有所要求亲和力的其他配体。具体地，对上述物质的比如，甲基化、卤化、硝化及羟基化衍生物进行试验是属于本发明的范围之内的。更具体地，带着亲电基团的柠檬酸盐衍生物，即在其三羧基碳骨架上附带有氟基、氯基或硝基的衍生物，可能会具有所要求的特性。其推理是亲电基团可以减少羧基的电子密度从而削弱它们与Ca2+相互作用的能力。
对于几种配体，如甲基丙二酸盐、二甲基丙二酸盐及柠檬酸盐，我们所估计的解离常数值与已发表的值是相似的。对于其它的配体，具体是邻苯二甲酸盐、2，6-二氨基嘌呤及腺嘌呤，已发表的值与我们所观察到的值有一个量级甚至更大的偏差。可能较高浓度的配体形成的复合物与Ca2+的亲和力降低了，不管如何在本发明中它们是无用的。例2在例6中所描述的实验中显然可以发现，柠檬酸盐及异柠檬酸盐除了通过它们与Ca2+的结合来抑制血液凝固以外，它们本身也具抗凝作用(其中异柠檬酸盐抑制能力弱于此)。这就引发了一个思想，而这些物质甚至在Ca2+活性接近生理水平的情况下也可以充当抗凝剂。因此，把CaCl2加入到柠檬酸盐或异柠檬酸盐溶液中以使这些Ca2+结合物质溶液中含有生理水平的Ca2+。这对于异柠檬酸盐是可行的，对于柠檬酸盐则不可行。同时含有柠檬酸盐和CaCl2的溶液会产生沉淀。因此，以下仅描述使用异柠檬酸盐的实验。
在四个分别含有一份抗凝剂(0.5mL)的真空塑料容器中分别加入抽自一个人的九份血液(4.5mL)。抗凝剂分别是溶有使Ca2+活性达到大约1mM的CaCl2剂量的0.3、0.4、0.6或0.8M的异柠檬酸三钠。在表II及III中，经过抗凝处理的血样由它们各自的抗凝剂含量来表示，即标识为30、40、60及80mM的异柠檬酸盐。
在收集的15分钟内，用一细的皮下注射器针头刺过每一容器的弹性膜并抽出2mL的经过抗凝处理的血液以尽量减少与周围环境的气体交换。立即把血液于10,000xg离心3分钟以使血细胞沉淀并保持大约0.8mL的血浆。血浆除了少量被用于确定Ca2+活性及pH(参见表II及III)之外，剩余的都被转移到一只聚苯乙烯管中。在表格II及III中，各种不同的血浆及血液制品由血液中抗凝剂的剂量来表示，即标识为30、40、60或80mM柠檬酸盐，(根据来源于经过柠檬酸盐抗凝处理的血液的血浆中柠檬酸盐含量的报告可以推定，在血浆制品中抗凝剂的实际水平大约比血液制品中的高出1.4倍)。
把保存于原来容器中的血液制品及保存于封盖的3mL聚苯乙烯管中的相应的血浆制品保存于室温并定期检查凝固物的存在。在表II及III中，有凝固物形成就表示为大写字母C，没有凝固物就标示为NC。表中给出的时间间隔表示的是所使观察的时间阶段。血液中及血浆中的结果分别在表II及III中给出。表II.血液异柠檬酸盐 Ca2+/pH 0-1小时1-5小时 5-24小时 24-48小时(mM)30 1.00/7.37 C C C C40 0.95/7.35 NC C C C60 0.98/7.33 NC NCNC NC80 0.97/7.33 NC NCNC NC表III.血浆异柠檬酸盐 Ca2+/pH 0-1小时1-5小时 5-24小时 24-48小时(mM)30 1.00/7.37 NC NC C C40 0.95/7.35 NC NC NCNC60 0.98/7.33 NC NC NCNC80 0.97/7.33 NC NC NCNC上面所描述的用异柠檬酸盐进行的实验所得的结果显示根据本发明可以用象异柠檬酸盐这类与Ca2+的亲和力有限的物质来对生物液体，具体是血液及血浆，进行抗凝处理而同时又不降低该种液体的Ca2+活性。细胞外生物液体典型的生理Ca2+活性大约为1.2mM。具有中等Ca2+亲和力的物质被定义为那些Ca2+与其形成的复合物在生理条件，即大概37℃的温度、7.3的pH及150mM的离子强度下解离常数为0.8至8mM的物质。
结果表明，具有中等Ca2+亲和力的物质，非常可能还包括具有更强Ca2+亲和力的物质，具有一种至今仍未被描述过的，或者至少没有被很好地认识到的作用机制。这一抗凝机制通过直接作用于生物液体中参与凝固过程的物质，而不是通过降低Ca2+活性来起作用。Ca2+活性的降低通常被认为是具有钙结合抗凝作用的一组物质的抗凝作用机制。由上面所示的结果显然可以发现，当Ca2+活性接近生理水平时，具有中等Ca2+亲和力的物质对血浆的抗凝效果比对血液的更强，即对血浆进行抗凝处理需要较少的抗凝物质。例3以与例2类似的方式进行实验。在含有一份抗凝剂溶液的真空塑料容器中收集九份的血液。抗凝剂分别是溶解于水中的50至300mM范围内的异柠檬酸三钠，这使得到收集的血液中异柠檬酸盐的水平最终达到5至30mM的范围。在收集后不久，从各个容器中分别抽取少量的经过抗凝处理的血液并确定其Ca2+活性及pH。把装着经过抗凝处理的血液的原来的容器保存在室温下并定期检查凝固物，即凝固的材料或血块，的存在。标识与例2中的一样，即“C”代表有凝固物而“NC”代表没有凝固物，等等。结果示于表IV中。
表IV.血液异柠檬酸盐 Ca2+pH 0-1小时 1-5小时 5-24小时 24-48小时(mM)50.43*7.64*C C C C10 0.27*7.64*C C C C13 0.21*7.65*C C C C15 0.20 7.60 NC C C C20 0.18 7.46 NC NCNCNC25 0.15 7.46 NC NCNCNC30 0.12 7.45 NC NCNCNC*在血清中测定的数值由上面的结果可以发现，20mM的异柠檬酸盐是长时间抗血液凝固所需的最少的剂量。在经过抗凝处理的血液中Ca2+活性是0.18mM，这比含有13mM柠檬酸三钠的血液，即根据已有工艺收集在含有1/9体积0.13M柠檬酸三钠的容器中的血液中的Ca2+活性大约高10倍。从例2的结果可以推定，对血浆进行抗凝处理所需的异柠檬酸盐抗凝剂将会较少。
在本发明的范围之内，期望异柠檬酸盐的抗凝效果可以通过添加柠檬酸盐或降低pH来得以增强。可以通过用异柠檬酸或柠檬酸代替其钠盐、钾盐或锂盐来降低pH。根据如上所述进行实验，所不同的是抗凝剂是(Na+)异柠檬酸盐、(Na+)柠檬酸盐、(H+)异柠檬酸及/或(H+)柠檬酸的混合物，其结果都概括于表V，VI及VII中。
表V.血液用(Na+)异柠檬酸盐及(Na+)柠檬酸盐的混合物进行抗凝处理。它们在血液中浓度的总和为13mM。柠檬酸盐的比例以百分比表示。柠檬酸盐Ca2+pH 0-1小时 1-5小时 5-24小时 24-48小时(％)20 0.14 7.48NCNCNC NC40 0.09 7.47NCNCNC NC表VI用13mM的(H+)异柠檬酸及(H+)柠檬酸的混合物进行抗凝处理柠檬酸Ca2+pH 0-1小时 1-5小时 5-24小时 24-48小时(％)00.27 6.54NC NC NC NC2.5 0.25 6.39NC NC NC NC50.23 6.47NC NC NC NC10 0.20 6.47NC NC NC NC表VII用11mM的(H+)异柠檬酸和(H+)柠檬酸的混合物进行抗凝处理柠檬酸Ca2+pH 0-1小时 1-5小时 5-24小时 24-48小时(％)0 0.34 6.91 NC C C C2.5 0.29 6.63 NC C C C5 0.27 6.68 NC C C C100.22 6.61 NC C C C200.16 6.65 NC NC NCNC400.09 6.59 NC NC NCNC例4下面将论证根据本发明进行抗凝处理的血液就凝固反应而言更具稳定性。因此，根据本发明进行抗凝处理的血液及血浆比起根据已有工艺的方法进行抗凝处理的血液更适合用于凝固分析。
准备三种不同类型的血液收集管，每管分别抽取4.5mL的血液。把这三种类型的血液收集管分别标识为“柠檬酸盐”“异柠檬酸盐”及“柠檬酸盐/异柠檬酸盐混合物”。“柠檬酸盐”管是根据已有工艺的，它含有0.5mL 0.13M的柠檬酸三钠。“异柠檬酸盐”管是根据本发明的，它含有0.5mL 0.2M的异柠檬酸三钠。“柠檬酸盐/异柠檬酸盐混合物”管也是根据本发明的，它含有0.5mL 0.078M的异柠檬酸三钠及0.052M的柠檬酸三钠的混合物。
在少于5分钟的时间间隔内，把血从同一个人抽到每一个血液收集管“柠檬酸盐”管、“异柠檬酸盐”管及“柠檬酸盐/异柠檬酸盐混合物”管之中。
尽量不耽误时间，从三个血液收集管中每管抽出1mL经过抗凝处理的血液。把血液于5000xg离心3分钟。尽可能快地保护0.4mL的血浆并把其用于凝血因子VIII凝血活性、激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)及凝血酶原时间(PT)分析。这些分析结果是在血液收集后的20分钟内获得的，在下面及在图1、2及3中，它们被当作初始值。
剩下的血液在室温下被贮存于三个血液收集管中。把管子封闭以防止蒸发损失。在血液收集后5小时、24小时及48小时，以如上所述的方法抽取血液，保护血浆并对血浆进行分析。这些分析的结果，以与初始值的关系表示，被示于图1、2及3中。
图1显示，因子VIII的凝血活性在根据本发明进行抗凝处理的血液中更加稳定。特别是，在标识为“异柠檬酸盐”的管中，根据本发明收集的血液在室温48小时的贮存期间显示了良好的稳定性，而且因子VIII的凝血活性保持在初始值的10％之内。在标识为“柠檬酸盐”的管中，根据已有工艺进行抗凝处理的血液在前5个小时迅速下降到初始活性的75％，而且随后继续下降，在第48小时下降到55％。在标识为“异柠檬酸盐/柠檬酸盐混合物”的管中，根据本发明进行抗凝处理的血液与根据已有工艺进行抗凝处理的血液相比较，其因子VIII的稳定性在贮存的前15个小时更好，此后则大致相同。
图2显示，在根据本发明进行抗凝处理的血液中的APTT比在根据已有工艺进行抗凝处理的血液中的更加稳定。在室温下的前48小时，贮存于“异柠檬酸盐”管中的血液的APTT保持在其初始值的5％以内。贮存于“柠檬酸盐”管中的血液的APTT上升到113％。贮存于“异柠檬酸盐/柠檬酸盐混合物”管中的血液的APTT稳定性介于两者之间。
图3显示，PT在根据本发明进行抗凝处理的血液中更为稳定。在“异柠檬酸盐”管中，PT保持在初始值的2％之内，在“异柠檬酸盐/柠檬酸盐混合物”管中，在4％之内，在“柠檬酸盐”管中，在7％之内。例5以许多不同的方法来对血液及血浆进行凝固分析。大部分此类分析都具有以下相同点。根据已有工艺用柠檬酸盐，或者根据本发明用异柠檬酸盐，对血液或血浆样品进行抗凝处理。把经过抗凝处理的血液或血浆与含有Ca2+的试剂相混合，上述试剂可以还原或抵消样品中抗凝剂降低Ca2+浓度的效果。由于Ca2+活性强烈影响凝固反应从而最终影响分析的结果，因此，尽可能精确地确定Ca2+活性是很重要的，即应使样品和试剂的混合物中Ca2+活性的变化尽可能地小。这一变化的大小将取决于样品中Ca2+的缓冲能力。缓冲能力是把每升溶液中Ca2+化学当量的变化除以Ca2+活性的变化所得的值。这一Ca2+缓冲能力是在一个包括样品、缺乏维生素K依赖型凝血因子的牛血清以及兔脑促凝血酶原激酶的系统中确定的。由于这类系统对其中的凝血因子VII，X及II(凝血酶原复合物因子)的联合活性敏感，所以它被用于测量凝血酶原复合物的活性(PK活性)。在本例中，通过添加柠檬酸盐或异柠檬酸盐对这一系统进行了改进。可通过添加终浓度为5或10mM的钙离子结合物质来改进这一系统。每一添加的水平都决定了该分析系统的钙离子缓冲能力。缓冲能力是在Ca2+活性为1至4mM之间时被确定的。最终添加了5mM柠檬酸盐或异柠檬酸盐所得的结果示于图4，添加了10mM的示于图5。
图4和5显示，异柠檬酸盐对于增强一个用于凝固分析的系统的Ca2+缓冲能力而言，其效果比柠檬酸盐更好。当Ca2+活性高于1mM(这包括了Ca2+活性的一个重要水平，即生理水平1.3mM)时，所增加的Ca2+缓冲能力最为明显。例6研究了例5中所描述的系统的化验反应。把样品、试剂及CaCl2溶液相混合。记录凝固时间，于10,000xg离心3分钟把凝固物压实，然后确定Ca2+活性。往试剂中加入一定量的柠檬酸盐或异柠檬酸盐，并使所加入的物质的最终浓度达到5、10或20mM。在几个CaCl2水平上进行实验以使系统中Ca2+活性水平阶梯式地达到0.7至9mM之间的不同数值。
图6显示了凝固时间(KT)是如何依赖于Ca2+活性的。图中示出了分别添加有0、5、10及20mM的柠檬酸盐的情况。添加有0、5、10及20mM的异柠檬酸盐的同样的实验示于图7中。
检查图6及7可以发现，在任何一个Ca2+活性水平，柠檬酸盐及异柠檬酸盐都可以抑制凝固。然而，异柠檬酸盐的抑制效果比柠檬酸的差。如果把某一Ca2+活性水平的凝固时间对应着所添加剂的柠檬酸盐或异柠檬酸盐的最终浓度作图，上述情况就会变得非常清楚。图8所示的是Ca2+活性为1.5时的情况。图8表明，每摩尔单位的柠檬酸盐的抑制效果是异柠檬酸盐的大致2倍。例7分两步来进行APTT分析。第一步，把一个体积的经过柠檬酸盐抗凝处理的血浆与一个体积的激活剂/脑磷脂溶液相混合并把混合液保温5分钟。第二步，加入一个体积的25mM CaCl2溶液并记录凝固时间。根据本发明对这一化验进行改进，使用了同时还含有30mM异柠檬酸盐的25mM的CaCl2溶液。下面，激活物/脑高磷脂溶液及25mM CaCl2溶液将被称为原始的APTT试剂，而激活物/脑磷脂溶液及含有30mM异柠檬酸盐的25mM CaCl2溶液则被称为改进的APTT试剂。
在所述两步溶液中钙离子的活性，即钙离子的最终活性，当使用的是原始的APTT试剂时，为2.7±0.20mM，当使用的是改进的APTT试剂时，则为1.60±0.70mM。
用原始的及改进的APTT试剂分别对来源于22个正常人及120个患者的经过柠檬酸盐抗凝处理的血液进行了分析。健康个体的平均凝固时间及标准偏差(SD)，当使用的是原始的APTT试剂时，为32.5±3.0秒，当使用的是改进的APTT试剂时，为4.4±4.6秒。用这些平均值及标准偏差来计算患者跟正常人的偏差，即把患者的APTT减去正常人平均的APTT，然后再把这一差别除以正常人的标准偏差。
当使用原始的APTT试剂时，患者跟正常人的平均偏差及其标准偏差为3.6±5.0，当使用改进的APTT试剂时，相应值为4.3±5.7。根据两组斯氏t-试验的分析，运一差别在统计学上非常显著，p＜0.006。因此，当使用的是根据本发明的APTT试剂时，患者APTT跟正常值的偏离值比使用根据已有工艺的APTT试剂时的更大。
权利要求
1.对血液、血浆或滑液制品进行抗凝处理的方法，包括把有效剂量的异柠檬酸盐加入到制品中的步骤。
2.根据权利要求1的方法，另外还包括用一种可溶性钙盐把经过抗凝处理的制品中钙离子的活性调节到生理水平的步骤。
3.根据权利要求1或2的方法，其中的异柠檬酸盐的有效剂量是每升血液制品含5-50mmol或者每升血浆或滑液制品含7-70mmol。
4.根据权利要求3的方法，其中异柠檬酸盐的剂量是每升血液制品含15-25mmol或者每升血浆或滑液制品含25-35mmol。
5.含有抗凝剂量的包含异柠檬酸盐的抗凝剂的血液、血浆或滑液制品。
6.根据权利要求5的血液、血浆或滑液制品，其中的抗凝剂除了含有异柠檬酸盐之外，还含有柠檬酸盐。
7.根据权利要求6的血液、血浆或滑液制品，其中异柠檬酸盐的剂量是每升血液制品含5-50mmol或者每升血浆或滑液制品含7-70mmol。
8.根据权利要求7的血液、血浆或滑液制品，其中异柠檬酸盐的剂量是每升血液制品含15-25mmol或每升血浆或滑液制品含25-35mmol。
9.把根据权利要求4-8中任一项所述的血液、血浆或滑液制品用于运输及贮存的用途。
10.把根据权利要求4-8中任一项所述的血液、血浆或滑液制品用于该种制品止血或凝固特性的分析的用途。
11.含有等渗或轻微高渗的异柠檬酸盐溶液的血液采样容器。
12.内含十分之一容器体积的0.1-0.5M异柠檬酸盐溶液的血液采样容器。
13.根据权利要求11或12的血液采样容器，它除了含有异柠檬酸盐之外，还另外含有可以使钙离子活性最终达到1mM的有效剂量的氯化钙。
14.用于分析含有异柠檬酸盐的血液、血浆或滑液制品的试剂。
全文摘要
本发明披露了一种在血液、血浆或滑液制品中添加异柠檬酸盐以对其进行抗凝处理的方法。本发明的方法还可进而包括用一种可溶性钙盐把经过抗凝处理的制品中的钙离子活性调节到生理水平的步骤。本发明公开了含有抗凝剂量的由异柠檬酸盐,以及柠檬酸盐(供选),组成的抗凝剂的血液、血浆或滑液制品。这些经过抗凝处理的制品被用于运输及贮存,以及/或者被用于这些制品止血或凝固特性的分析。另外,本发明还公开了一种含有等渗或轻微高渗的异柠檬酸盐溶液的血样采样容器、一种含有十分之一容器体积的0.1—0.5M异柠檬酸盐溶液,以及供选的足以使钙离子最终活性达到大约1mM的有效剂量的氯化钙的血液采样容器。本发明最后还披露了用于对含有异柠檬酸盐的血液、血浆或滑液制品进行分析的试样。
文档编号A61K38/14GK1265036SQ9880757
公开日2000年8月30日 申请日期1998年5月29日 优先权日1997年6月5日
发明者M·龙比 申请人:全球止血协会有限公司