专利名称：通过测量人或动物的抗凝血液薄膜样品中的特异性吞噬作用来检测其传染病的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于对薄膜抗凝血液样品进行目标分析对象检验的方法，其中， 所述目标分析对象为白血细胞对包被有一种或多种特定抗原的颗粒是否存在特异性吞噬作用和/或结合作用，其中所述血液样品含有存在于该抗凝血液样品中的白血细胞、以及在其表面上包被有一种或多种特定抗原的可检测的第一类颗粒，所述抗原与所限定的病原剂(pathological agent)表达的抗原类似或相同。更具体而言，本发明涉及在人和动物的生物液体(如全血或含有白血细胞的其它液体)中对可检测物质的吞噬作用和/或结合作用进行电子检测、定量和表征，所述表征在薄室内的含有白血细胞的静止薄膜液体样品上进行，所述室具有至少两个平行的平坦壁，其中至少一个壁是透明的。莱姆病(Lyme disease)仅被用作能够通过该方法检测的一种传染病的例子。本发明适用于通过吞噬作用的生物过程对抗的所有传染剂(infectious agent)，一些例子为淋病或肺炎球菌感染，以及其他的传染病。
2.
背景技术：
Krider等人的美国专利No. 5，985，595涉及用于快速检测人或动物的血液中是否存在病原体的诊断测试。将所要检测的血液样品在载波片上铺展、风干、固定、染色并用显微镜检测。该专利的全文通过引用方式并入本文。希望能够以更快速和更简单的方式进行Krider等人所述的是否存在病原体的诊断测试，其中，所述方式不需要技术人员将样品在载玻片上铺展、风干、固定、染色或用显微镜检测，并且能够在护理处进行。发明概述本发明涉及检验抗凝活性全血样品中的白血细胞对所加入的可检测颗粒是否存在特异性吞噬作用的方法，第一类颗粒包被有特异性抗原，例如在伯氏疏螺旋体细菌 (Borrelia burgdorferi bacteria)中存在的那些；第二类颗粒具有与第一颗粒类似的组成和尺寸，但其没有所述特异性抗原，并且可以通过它们的颜色或荧光性将其与第一颗粒区分开。总体而言，柠檬酸钠或肝素被用作该检验的抗凝血剂，但是不损害吞噬作用的任何抗凝血剂均可以使用。用于检测莱姆病的抗原在所引用的Krider等人的专利5，985，595 中有所描述。是否存在对这些颗粒的特异性吞噬作用将确定供血者的血液样品中是否存在新近感染或活性感染(例如莱姆病)。本发明的方法利用对血液样品进行的电子光度显微分析，包括对样品进行电子成像或扫描。该方法包括将已培养的血液样品(如下所述)置于具有预定和固定厚度的测
4试室中，从而在该室中制备该血液样品的薄层。该室的至少一个壁是透明的，使得能够观察室内的样品。在某些情况下，室的上壁和底壁均是透明的。室的厚度可以在3μ至25μ的范围内。当分析抗凝全血时，室的厚度应当优选为4 μ至6μ，从而获得薄膜单层的血液样品，该单层含有白血细胞和红血细胞。使室内的单层血液样品成像，以确定是否存在已经结合或摄取第一可检测颗粒的白血细胞，其中所述第一可检测颗粒包被有特异于目标莱姆病分析物(即，伯氏疏螺旋体细菌)的抗原。血液样品还含有相似数量的第二可检测颗粒，其除了具有可区分的颜色或荧光性外，与第一颗粒具有相同的尺寸和组成，第二可检测颗粒未被莱姆病分析物特异性抗原包被。莱姆病仅用作可以用本方法检测的一种疾病的例子， 当使用术语“莱姆”时，可以将其替换成任何以吞噬作用的改变为特征的传染病过程。第一颗粒和第二颗粒的特征在于具有不同的可检测信号(例如颜色和/或荧光性)，使得它们能够彼此区分开。在其他方面，这些颗粒应当具有相同的尺寸和组成，不同之处仅在于是否存在一种或多种目标抗原，这是因为尺寸和组成能够影响吞噬作用。理想的是，用作第一类颗粒和第二类颗粒的颗粒均具有直径在约1微米至3微米范围内的相同尺寸，该尺寸使得易于检测并且白血细胞达到最佳的吞噬作用。用肝素或柠檬酸钠作为所选的抗凝血剂，最好在体温下，将血液和颗粒的混合物培养预定的时间(从几分钟至一小时的一段时间)，然后将血液样品置于分析室中。由于吞噬作用已经完成，因此稍微挤压白血细胞的较薄的室会使得已被吞噬的颗粒更易于分辨。 对人而言，高度为4至6微米的室可以发挥良好的作用。或者，可以将血液直接添加到其中已经存在抗凝血剂和颗粒的室内，并且在原位进行培养步骤，然后读取样品。在这种情况下，该室应具有足够的尺寸，以便白血细胞能够在没有显著机械阻碍的情况下进行它们的吞噬作用。所选的室高度取决于要测试的物种及其活性吞噬细胞的尺寸。然后对室进行成像，以确定是否有任何第一可检测颗粒已经被摄取到样品中的白血细胞中或已经附连到样品中的白血细胞的表面上。成像还将确定是否有任何第二可检测颗粒已经被样品中的白血细胞吞噬或结合。将所结合和/或摄取的各种类型颗粒的量进行比较，以指示血液的供源是否被目标病原体新近感染或活性感染。为了能够确保检验的功能性，必须进行试验，以确定在待检测物种的未接触莱姆病的健康群体中每个白血细胞所摄取的各类型颗粒数目的正常范围。如果第一类颗粒和第二类颗粒中没有任何颗粒被吞噬或吞噬的颗粒太少(定义为低于限定正常范围的使用者的数值)，那么测试是无效的，并且该无效性可能是因为白血细胞已经死亡或不能起到吞噬作用，或者是培育条件不充分。如果发现白血细胞吞噬了正常数量的第一可检测颗粒和第二可检测颗粒，那么这表明没有莱姆病或没有其他目标抗原体。如果相对于第二类颗粒，白细胞结合或摄取了大于正常数量的第一类颗粒，那么，这表明其是存在活性感染或新近感染莱姆病的阳性测试。如果第一类颗粒的摄取量大于第二类颗粒的摄取量，但两种颗粒的摄取量均在正常范围内，则该测试没有确定的结论。如果发现白血细胞吞噬的第一可检测颗粒和第二可检测颗粒均小于正常数量，那么这表明该测试是无效的。如果发现白血细胞吞噬的第一可检测颗粒和第二可检测颗粒的数量均大于正常范围，那么，这是不确定的结果，表明由于未知原因导致吞噬作用增加。这样的结果可具有重要的临床实用性，但是有可能不能用于指示是否存在要检测的特定疾病过程。
图1是根据本发明形成的测试样品室的一部分的平面图，所述测试样品室含有经培育的抗凝全血样品，该全血样品含有用于进行本发明的测试方法的第一和第二可检测颗粒。发明详述现参照图1，其在平面图中示出了样品室40的一部分，该样品室含有已经与检测颗粒一起培育过的抗凝全血的单层薄膜样品。在这种情况下，室40具有透明的上表面，使得能够对血液样品进行电子成像或光照成像。薄膜血液样品被容纳在设有珠42的样品室内，珠42提供室40所需的厚度(在这种情况下，其厚度为约6μ)。血液薄膜包含红血细胞 44、红血细胞块或钱串46、无血浆细胞的腔隙48以及白血细胞13。该血液样品还包含两种可检测的颗粒8和9。颗粒8包被有特异于目标莱姆病的一种或多种抗原，而颗粒9没有被目标分析物特异性抗原包被。在成像时，颗粒8和9在样品中是可区分检测的。图1示出在所测血液样品中存在莱姆病的阳性测试结果。应当注意，该血液样品中大多数白细胞13已经吞噬了莱姆病特异性颗粒8，并且没有任何非特异性颗粒9被任何白细胞13吞噬。如果测试是阴性的，则没有或相对较少的白细胞吞噬了颗粒8，这是因为血液样品中不存在莱姆病细菌分析物，而如果测试没有确定的结论，那么，颗粒8和9均以相似的程度被白血细胞13吞噬。用含有被吞噬的两类颗粒的细胞的百分比或绝对数之比来定义检验的阳性和阴性以及有效性。含有这两类颗粒的细胞的这些比值和/或百分比可以进一步以细胞类型来进行亚表征，例如嗜中性粒细胞和单核细胞，这两种细胞均能进行吞噬作用。所摄取的每种颗粒的百分比和/或数量的比值还可以用于计算结果来定义检验的阳性和阴性以及有效性。应当理解的是，虽然使用本发明方法的具体例子涉及在个体血液中检测莱姆病，但该方法还可以用于检测是否存在其他传染性病原体，例如引起肺炎的肺炎链球菌 (S. pneumoniae)禾口弓I起淋病的淋球菌(Neisseria gonorrhoea)。这些病原体禾口其他病原体也容易被白血细胞吞噬。在不脱离本发明构思的情况下，可以对本发明所公开的实施方案进行许多改变和更改，但这并非旨在限制本发明，本发明的范围通过所附的权利要求书来限定。
权利要求
1.一种用于对抗凝活性全血的薄膜单层样品进行检验、以确定供血者是否在近期接触过限定的病原剂或被限定的病原剂活性感染的方法，其中目标分析对象为所述血液样品中含有的白血细胞对包被有一种或多种特定抗原的颗粒是否存在特异性吞噬作用和/或结合作用，所述方法包括以下步骤将所述血液样品与第一可检测的颗粒和第二独立可检测的颗粒混合并且进行培养，从而产生所述血液样品与所述第一颗粒和所述第二颗粒的经培养的混合物，其中所述第一可检测的颗粒包被有特异于所述目标分析对象的抗原，所述第二独立可检测的颗粒未被所述抗原包被；提供样品室，其贯通平面厚度在3 μ和25μ之间；用所述血液样品混合物填充所述室；对所述室进行光学扫描或成像，以检测和记录已经被单个白血细胞吞噬的任何所述第一颗粒和所述第二颗粒的平均量；以及确定所述扫描或成像步骤是否指示了提供所述血液样品的供血者表现出被所述限定的病原剂感染的迹象。
2.权利要求1所述的方法，其还包括确定所述检验的有效性的步骤。
3.权利要求1所述的方法，其中所述限定的病原剂为指示莱姆病存在的伯氏疏螺旋体细菌。
4.权利要求1所述的方法，其中所述室的贯通平面厚度为约4μ至5μ。
5.一种用于对抗凝活性全血的薄膜单层样品进行检验、以确定供血者是否在近期接触过限定的病原剂或被限定的病原剂活性感染的方法，其中目标分析对象为所述血液样品中含有的白血细胞对包被有一种或多种特定抗原的颗粒是否存在特异性吞噬作用和/或结合作用，所述方法包括以下步骤将所述血液样品与第一可检测的颗粒混合并且进行培养，从而产生所述血液样品与所述第一颗粒的经培养的混合物，其中所述第一可检测的颗粒包被有特异于所述目标分析对象的抗原；提供样品室，其贯通平面厚度在3 μ和12μ之间；用所述血液样品混合物填充所述室；对所述室进行光学扫描或成像，以检测和记录已经被单个白血细胞吞噬的任何所述第一颗粒的平均量；以及确定所述扫描或成像步骤是否指示了提供所述血液样品的供血者表现出被所述限定的病原剂感染的迹象。
6.权利要求5所述的方法，还包括下列步骤将第二独立可检测的颗粒引入到所述经培养的混合物中，从而产生所述血液样品与所述第一颗粒和所述第二颗粒的经培养的混合物，其中所述第二独立可检测的颗粒未被所述抗原包被。
7.权利要求6所述的方法，还包括确定所述检验的有效性的步骤。
8.权利要求5所述的方法，其中，所述限定的病原剂为指示莱姆病存在的伯氏疏螺旋体细菌。
9.权利要求5所述的方法，其中所述室的贯通平面厚度为约6μ。
10.一种用于对薄膜单层的抗凝活性全血样品进行检验、以确定是否在近期接触过病原剂或被病原剂活性感染的方法，所述方法包括以下步骤提供样品室，该样品室的贯通平面厚度在约3 μ和25μ之间，并且包含一个或多个第一颗粒以及一个或多个第二颗粒，所述第一颗粒包被有至少一种特异于目标分析对象的特定抗原，所述第二颗粒未被所述特定抗原包被；将血液样品混合物置于所述室中并培养所述血液样品混合物，从而产生所述血液样品与所述第一颗粒和所述第二颗粒的经培养的混合物；对所述室进行光学扫描或成像，以检测和记录已经被所述样品中的单个白血细胞吞噬的任何所述第一颗粒和所述第二颗粒的平均量，并且生成在所述室中的所述样品和颗粒的图像；以及用所述室中的所述样品和颗粒的所述图像确定所述血液样品是否显示出被所限定的病原剂新近感染或活性感染的迹象。
11.权利要求10所述的方法，其还包括确定所述检验的有效性的步骤。
12.权利要求11所述的方法，其中，所述室的贯通平面厚度为约6μ至12μ。
全文摘要
本发明涉及一种对薄膜抗凝血液样品进行目标分析对象检验的方法，其中所述目标分析对象为所述抗凝血液样品中存在的白血细胞对包被有一种或多种特定抗原的颗粒是否存在特异性吞噬作用和/或结合作用，其中所述颗粒包被有一种或多种这样的特定抗原，所述抗原与被关注而限定的病原传染剂表达的抗原相似或相同。
文档编号C12Q1/04GK102388146SQ201080015735
公开日2012年3月21日 申请日期2010年4月1日 优先权日2009年4月2日
发明者斯蒂芬·C·沃德洛, 罗伯特·A·莱文 申请人:艾博特健康公司