专利名称：使用缀合的生物聚合物表面对抗原特异性记忆b细胞的分离的制作方法
使用缀合的生物聚合物表面对抗原特异性记忆B细胞的分
离
相关申请的交叉引用本专利申请主张2009年3月9日提交的美国临时专利申请No. 61/158，649的优先权，该专利申请的全部内容作为参考具体地并入本文。
背景技术：
病毒(例如痘病毒、丝状病毒)作为生物武器的潜在应用受到越来越多的关注，特别是对于目前尚无有效对策的人类疾病。治疗性抗体的施用是对暴露于或感染对军事和反生物恐怖工作具有意义的病毒疾病物质的个体进行治疗和/或预防的合适策略。目前，痘苗病毒(vaccina virus, VACV)免疫球蛋白(vaccinia virus immune globulin，VIG)(人血液来源的多克隆Ig产品)是治疗由不良天花接种事件引起的播散性VACV感染的“首选” 疗法。另外，交叉反应性mAb制剂可以用作由其它致病性正痘病毒(如猴痘病毒和天花病毒(天花的病原体))所引起感染的治疗剂或预防剂，从而减轻使用这些病毒剂的生物恐怖的威胁。在VACV基因组中所含的约200个基因中，仅有少量基因编码已知引起中和抗体应答的蛋白质，包括H3、A17、A27、D8、Ll和B51。第七基因A33R编码引起非中和性抗体应答但仍是保护性的蛋白质。基于历史和初步数据，在动物模型中显示出保护效力的VACV抗原特异性mAb的组合将有可能对人疾病的治疗有效。用于鉴定针对A33R、B5R和LlR的Fab 的一个方法是PC0MB3噬菌体展示系统(Scripps Institute)。该方法可能存在问题，例如， 由于低文库大小/多样性、低效率克隆以及与第一代PC0MB3系统有关的稳定性问题。随着2003年对阿达木单抗(Humira)的批准，工业界看到了从嵌合到人源化再到完全人序列的新型抗体治疗的全面变化。工业界的目标是生产与人体中所产生的抗体相同的药物。目前可用的方法具有多种问题，例如，发现和生产基于抗体之药物的成本较高，以及在速度、稳定性、保真度、法规顺应性和产品表达方面的困难。如单克隆抗体的免疫治疗剂已证明是挽救生命的医用产品并且是诊断和研究工具的重要试剂。在本领域中，仍需要用于鉴定和生产具有所需特异性的完全人源化单克隆抗体的改进的方法和设备。由于将利用人B细胞，因此本发明特别适合于该任务。这些细胞独特地被设计用于表达和分泌抗体。来源于人B细胞的细胞系的遗传学、生物化学以及细胞器组成将精确地并且忠实地产生大多数可能的人治疗性分子。本发明还提供了用于提取(isolation)抗原特异性记忆B细胞的设备。该设备可用于发现和生产新一代免疫治疗齐U，以满足如传染病学、肿瘤学、公共卫生和生物防御等领域中的重大需求。
发明内容
可利用提取的抗原特异性克隆来鉴定和生产高效人治疗性单克隆抗体，所述抗原特异性克隆通过使用在缀合了抗原的生物聚合物表面上差异性粘附介导的细胞分离来源于人供体的循环中记忆B细胞池。使用间接亲合磁珠法，可以从接种疫苗的供体人外周血单个核细胞(peripheral blood m ononuclear cell, PBMC)中提取外源(病毒)抗原特异性记忆B细胞。在一个实施方案中，本发明提供了通过免疫细胞的受体与配体之间的相互作用分离所述免疫细胞的设备。通常，所述配体固定于设备的功能化表面上，并且该设备适于使免疫细胞流动通过功能化表面。可以使用任何类型的配体，例如，与免疫细胞上存在的受体结合的配体。适合的实例包括(但不限于)免疫细胞特异性的抗原。在一些实施方案中，本发明的设备可以是流通池和/或微流体设备。本发明的设备可以用于提取任何类型的免疫细胞，例如，中性粒细胞、嗜酸细胞、 嗜碱细胞、淋巴细胞和/或单核细胞。在一些实施方案中，使用本发明设备提取的细胞可以是淋巴细胞，例如B细胞、T细胞和/或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，提取的细胞可以是B细胞。在免疫细胞表面上表达的任何受体可用于通过与功能化表面上的受体所结合的一种或多种配体相连接来提取细胞。适合的受体包括B细胞受体，其适合的配体包括(但不限于)具有B细胞表位的抗原。在另一个实施方案中，所述免疫细胞受体可以是T细胞受体，其适合的配体包括(但不限于)具有T细胞表位的抗原。本领域已知的任何适合的方法可用于对在其上提取免疫细胞的设备表面进行功能化。在一些实施方案中，可通过在表面上沉积聚合物使该表面功能化。在沉积前后，可以将一种或多种配体与聚合物缀合。本发明提供了通过将包含免疫细胞的溶液与本发明设备相接触来提取免疫细胞的方法。在一些实施方案中，本发明的方法可包括在功能化表面上捕获(即固定)免疫细胞。可通过诱导活化来使得这些免疫细胞增殖。此活化可导致形成免疫细胞集落。在一些方法中，从设备中回收有活力的经活化增殖中免疫细胞集落。可使用本领域已知的任何方法回收集落，例如，可以通过从聚合物上释放配体回收集落和/或可以机械性移除(例如吸取)集落。在一些实施方案中，本发明可用于通过间接亲合磁珠法从来源于接种疫苗供体的人外周血单个核细胞(PBMC)中分离病毒抗原特异性记忆B细胞。本发明的材料和方法可包括缀合了抗原的生物聚合物表面，其可用于通过差异性滚动粘附介导抗原特异性B细胞分离。在一些实施方案中，本发明提供了用于抗原特异性B细胞分离的缀合了抗原的生物聚合物表面。在用B细胞进行实验之前，使用缀合了抗体的微球进行实验来评价表面梯度、 剪切速率和流通池设计。在一些实施方案中，可以原位活化使用本发明提取的B细胞以用于克隆提取 (clone isolation)。例如，可以原位活化生物聚合物表面捕获的抗原特异性B细胞以用于克隆提取。在一些实施方案中，本发明可用于提取抗原特异性B细胞，然后可以在生物聚合物表面上将其活化，诱导分化为抗体分泌细胞(antibody secreting cell, ASC)并诱导扩增和形成集落。可以从生物聚合物表面上提取活化的抗原特异性记忆B细胞集落以产生 IgG分泌细胞系。因此，本发明提供了可以用于提取、扩增和表征来源于经活化抗原特异性 B细胞集落的IgG表达细胞系以及产生克隆抗体分泌细胞系的材料和方法。
图 1 是 pcdna3. lzeo:VACV_B5R、pcdna3. lzeo:VACV_A33R 和 pcdna3. lzeo:VACV_ LlR的质粒图。图2A和2B是循环 中VACV特异性抗体和B细胞的抗体效价图。图3显示了来自Dryvax (LB, DS)或ACAM2000 (AM)接种供体的人血清样品对于具有免疫相关性的重组表达VACV蛋白的ELISA测定结果。图4显示了以1 1(上图)或1 5 (下图)的载体插入物比例的IOXL-Iblue/ pC0MB:HC+LCK文库克隆中克隆的人LC KcDNA插入物存在性的PCR集落分析结果。图5显示了对Ll和MBP不同轮次淘选的噬菌体ELISA结果。图6是显示轻链和重链盒的两种可能取向的琼脂糖凝胶图照片以及 pcDNA Δ dhfr VL VH 质粒图。图7显示了放射性标记的VACV蛋白与VACV免疫人血清或与哺乳动物细胞表达的全长人HlAb的免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。图8显示了单克隆抗体对BALB/c小鼠的保护。图9显示了用2 X IO6或2 X IO5PFU痘苗病毒IHD-J株进行i/n攻击后的体重变化。显示了每个处理组的平均体重(η = 5)。图10显示了 12个区的微流体表面设计。每个区可包含矩形金电极以允许对功能化缀合的壳聚糖混合物进行位点特异性寻址。图11显示了微流体流动室的设计，其详细地示出了用于生物功能化表面电沉积的电极位置以及流路。图12显示了缀合抗原介导的记忆B细胞分离和可溶性配体活化策略的示意图。图13显示了来自PBMC解冻物的FACS数据(左图为仅PBS而右图为PBS加PI)。图14显示了具有多个N和C末端标签的VACV Ll变体。图15显示了下列项的琼脂糖凝胶(A) LlR胞外域的PCR产物和(B) LlR的六个末端标签变体的PCR产物。图16显示了 Hind III和Not I限制性酶切哺乳动物表达质粒 pcdna3. 1+zeo: intA:VACVsLlR+His#l 的琼脂糖凝胶。图17显示了含六个Ll末端标签变体的Hind III和Not I限制性酶切哺乳动物表达质粒的琼脂糖凝胶。图18显示了瞬时表达的纯化的Ll变体的SDS-PAGE凝胶。图19显示了瞬时表达的纯化的Ll变体的ELISA分析结果。
具体实施方案本发明人已开发出了用于预防性和治疗性治疗人病原性正痘病毒感染的单克隆抗体混合物。这些感染可来源于不良疫苗接种事件(例如痘苗病毒(VACV)感染)或暴露于其它正痘病毒(如作为天花病原体的天花病毒(variola virus, VARV)或猴痘病毒 (monkeypox virus, MPXV)。在生物恐怖和生物战威胁以及公共卫生问题的背景下，这些适应症的有效治疗剂的开发满足了重大而未获满足的医学和国家安全的需求。工作集中在发现对VACV B5R、A33R和LlR蛋白(其已知能够引起中和应答)具有特异性的mAb克隆上。在pcdna3. Izeo质粒背景中改造得到具有这些VACV基因的质粒以用于产生表达这些锚定在细胞表面上的蛋白的NSO和293T/17细胞系(图1)。另外，构建了编码下列VACV蛋白的带HIS标签的可溶性版本的表达载体A27L、D8L、A33R、B5L、A17L、 A4L、A10L、H3L、F13L和L1R。本领域的技术人员将理解可以在本发明的实践中使用其它抗原，例如中和抗体所识别的抗原。制备了 VACV株WR感染的Vero细胞的TRIzol提取物，以用于总RNA提取和cDNA合成。 这些cDNA用于扩增如上所述的所有10个病毒基因。改造得到每个基因的可溶性版本，以仅包含带有聚组氨酸标签的胞外域并且由VACV B5信号肽序列所驱动。在 CHO-S 和 293-F FreeStyle 细胞(Invitrogen)中尝试了 VACV 蛋白 A33、B5 和Ll的带HIS标签可溶性版本的表达。根据生产商的说明书转染细胞，并且使之在生长条件下继续生长96小时。对于初始纯化来说，将上清液上样到平衡过的HIS Spin柱(Sigma) 上，清洗，然后用IOOmL含有咪唑的缓冲盐水缓冲液洗脱。如图3所示，CHO-S和293-F细胞均表达SB5-HIS和s-Ll-HIS，但两个细胞系表达的sA33_HIS的水平均不显著。sB5_HIS 和s-Ll-HIS的产量在0. 5至34μ g/mL上清液的范围内。因此，我们使用CHO-S和/或 293-F细胞来产生SB5-HIS和sLl_HIS，使用在含血清培养基中生长的293T/17细胞来产生 sA33-HIS。图 1 显示了 pcdna3. lzeo:VACV_B5R、pcdna3. lzeo:VACV_A33R 禾口 pcdna3. lzeo:VACV_LlR的质粒图。将包含大部分pCMV启动子的NheI-NotI片段(包含内含子A)和VACV A33R、B5R或LlR的完整开放读码框克隆到由相同核酸内切酶酶切的 pcdna3. Izeo质粒片段中。将所得构建体用于转染293T/17细胞以确认表达，随后产生在细胞表面上表达这些病毒基因的稳定系。用由VACV免疫的人供体的外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocate，PBL) 所产生的cDNA构建人Fab噬菌体文库。在与体液免疫应答峰值有关的疫苗接种后的第18 天从经过加强免疫的供体中提取PBL(参见图2)。用经许可的纽约卫生局(New York Board of Health) VACV疫苗对VACV免疫志愿者进行加强免疫。在接种疫苗后的多个时间，通过 ELISA测量循环抗VACV IgG。用埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrn virus)转化B细胞并将有限稀释液加入到96孔板中。通过对含有细胞克隆的孔进行ELISA，评价了循环中B细胞分泌抗VACV抗体的频率。在从供体DS构建第一人Fab噬菌体展示文库期间，平行地进行了重组VACV蛋白靶标的表达和纯化。对于这些试剂的可用性，确定了来自供体DS的血清对VACV Ll的反应性(重要的特异性)较差。用ACAM2000 (Acambis)对第二供体AM进行疫苗接种，并提取了 PBL0通过ELISA分析了来自两个供体的血清对一系列重组VACV蛋白靶标的反应性。如下图3所示，所有血清和阳性对照(抗HIS mAb)对sH3-HIS蛋白的反应性均较差。目前，尚不了解缺少显著反应性的原因。有一种可能是尽管纯化并定量了蛋白，但是该蛋白是错误折叠的并且是非反应性的。相反，用抗HIS阳性对照mAb明确地建立了对所有其它蛋白的反应性。另外，如所预期的，7D11仅与sLl-HIS反应，而10F10仅与sA33_HIS反应。来自供体AM的血清对所有抗原均表现出最佳反应性，随后从该供体PBL提取的RNA用于人Fab文库的构建。由于在之前的实验中发现以1 100的稀释度使用时DS供体血清的反应性较差，因此在VACVsLlR-HIS板上，以1 10的稀释度使用来自供体“DS sera post”的血清。使用来源于供体AM的PBMC，用pC0MB3系统(Scripps Institute)产生了 κ和XFab噬菌体展示文库2。对细胞进行TRIzol (Invitrogen)处理以提取总RNA。使用 RT-PCR(Invitrogen，superscript III)将 TRIzol 制备物用于产生来源于 mRNA 的 cDNA 文库。将所得的cDNA文库用作模板以使用广泛覆盖的引物组来通过PCR扩增可变重链(VH) 和轻链(VLk和VLX)区。为了在开始大规模转化前优化VL κ小规模连接进pC0MB3:VH的效率，汇集来自9个独立VL κ cDNA特异性物质的PCR产物，然后用SacI和XbaI酶切。将所得片段克隆到含有人VH的类似酶切的噬粒载体pC0MB3(表示为pC0MB3:VH)中。为了确定文库大小和小规模转化效率，进行了测试连接，然后电穿孔到电感受态大肠杆菌(E. coli) XL-IBlue细胞(Stratagene)中。为了确定pC0MB3 VH载体与VL κ插入物之间的最优比值， 使用250ng载体以下列载体插入物比例(1)1 1、⑵1 5、(3)1 10和(4)1 15 进行了四次转化。表1列出了每次转化的效价计算和所得的文库大小。表1.PC0MB3:VH+VLk小规模文库效价计算
权利要求
1.用于通过免疫细胞受体与配体的相互作用分离所述免疫细胞的设备，其中所述配体固定在所述设备的功能化表面上并且所述设备适于使所述免疫细胞流动通过所述功能化表面。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述设备是流通池或微流体设备。
3.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞是B细胞。
4.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞受体是B细胞受体。
5.根据权利要求1所述的设备，其中所述配体是具有B细胞表位的抗原。
6.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞是T细胞。
7.根据权利要求1所述的设备，其中所述免疫细胞受体是T细胞受体。
8.根据权利要求1所述的设备，其中所述配体是具有T细胞表位的抗原。
9.根据权利要求1所述的设备，其中所述功能化表面是与所述配体缀合的聚合物。
10.用于提取免疫细胞的方法，其包括将包含所述免疫细胞的溶液与根据权利要求1的设备相接触。
11.根据权利要求10的方法，其中所述免疫细胞被捕获在所述功能化表面上，并且通过诱导活化使其增殖。
12.根据权利要求11的方法，其中从所述设备回收有活力的经活化且增殖中的免疫细胞集落。
13.根据权利要求12的方法，其中通过从所述聚合物上释放所述配体来回收集落。
14.根据权利要求12的方法，其中机械性移除所述集落。
全文摘要
本发明提供了用于提取免疫细胞的材料和方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于提取和分离抗原特异性记忆B细胞的设备。通过使细胞沿缀合了配体的生物聚合物表面流过来分离免疫细胞。配体可沿生物聚合物表面的z轴以浓度梯度分布。展示出对生物聚合物上配体具有特异性的受体的细胞将与所述配体相互作用并且以白细胞滚动的方式沿所述表面滚动。附加的粘附相互作用将导致差异性细胞分离以及最终固定化。
文档编号C12M1/00GK102439127SQ201080015280
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者达里尔·B·桑佩 申请人:拜奥法克图拉公司