一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法
【专利摘要】本发明公开了一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，包括如下步骤：(1)混合血浆；(2)加入CaCl2溶液搅拌后使用滤芯过滤澄清，得到过滤液；(3)加入吐温-80和磷酸三丁酯混合液，使得过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为(1±0.3)％和(0.3±0.1)％，保持反应液的温度在24±2℃，恒温4-6小时；(4)加入植物油，使得最终植物油的体积百分比为(5±2)％，降低反应液温度至16±2℃；(5)搅拌、静置；(6)抽提，弃除油相，得到的液相。本发明的方法极大提高原料血浆的安全性，降低二次污染的几率。
【专利说明】一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒灭活处理的方法，特别是涉及一种对血液制品的原料血浆进 行病毒灭活处理的方法。
【背景技术】
[0002] 血液制品是一门新兴的生物医药行业，它的起始原料单一，为多人份健康人血浆 混合而成，在我国原料血浆的采集国家有非常严格的管理规定，要求对每一份采集的血浆 必须进行多种病毒筛查检测，合格后方能作为原料进行生产。但是人类对于很多病毒的未 知性和检测手段的第一，加上病毒检测方法本身的局限性，因此不能完全保证原料的绝对 安全。国家食品药品监督管理局在2002年出台的[血液制品去除/灭活病毒技术方法及 验证指导原则]规定：为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病 毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法，且生产过程中应有特定的能去除/灭 活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或多种方法联合去除/灭活病毒。
[0003] 人类已知的通过人血液进行传播的病毒一般有三类，S卩脂包膜病毒（如乙肝病毒 HBV)、非脂包膜病毒（如甲肝病毒HAV)和细小病毒（如B19)，目前国内生产企业生产的人 血白蛋白等主要血液制品，多采用的是半成品后病毒处理且多是采用一次病毒灭活处理工 艺，如巴斯德法（60°C，72小时处理）和低pH法（pH 4.0, 21天放置处理）。因此如果对原 料血浆直接进行病毒处理，将使得血液制品二次污染的几率大大降低，同时结合对半成品 进行后病毒处理方式，将极大的提高血液制品应用安全性。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种极大提高原料血浆的安全性，降低二次污染 的几率，同时结合现有产品原有的病毒灭活工艺（如巴斯德法和低PH法），能极大的保障血 液制品病毒安全性的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法。
[0005] -种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)将多人份血浆在常温下混合；
[0007] (2)混合后的血浆精确计量体积，温度控制在24±2°C，加入CaCl2溶液使得混合 后的血浆中最终CaCl 2为（2±0. 5)mmol/L，搅拌10分钟后使用孔径1 μ m的滤芯过滤澄清， 得到过滤液；
[0008] (3)根据过滤液的体积量，加入30 %的吐温-80 (tween-80)和磷酸三丁酯 (TNBP)混合液，使得过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为（1±0. 3) %和 (0. 3±0. 1) %，保持混合液的温度，控制在24±2°C，恒温4-6小时；
[0009] (4)恒温结束后，根据混合液体积，加入药用级的植物油，使得最终植物油的体积 百分比为（5±2)%，降低反应液温度至16±2°C ;
[0010] (5)快速搅拌15分钟，静止放置30分钟，使得油液相完全分层，得到混合液；
[0011] (6)使用隔离泵从混合液底部进行抽提，弃除油相，得到的液相作为血液制品的原 料进行人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品的制备。
[0012] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述混合后 的血浆中最终CaCl 2为2mmol/L。
[0013] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述过滤液 中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为1 %和0. 3%，
[0014] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述植物油 的体积百分比为5%。
[0015] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述血液制 品的原料中凝血因子II、W、VDI、IX、X均不低于0. 7IU/ml。
[0016] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中采用所述液 相作为血液制品的原料制备得到的人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品中，tween-80残留 量为不高于l〇〇ug/ml，TNBP残留量为不高于10ug/ml。
[0017] 本发明对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法与现有技术不同之处在 于：
[0018] 血液制品是一种采用多人份健康人血浆或经特异性免疫的人血浆，混合后经低温 乙醇或其他批准的工艺进行分级分离、提纯等技术制成的蛋白组分，用于治疗和被动免疫 防治。作为新兴行业，因采用的是多人份混合血浆作为起始原料，虽然采用多种检测手段去 最大限度避免病毒的污染，但因检测本身存在误差和检测手段的限制以及存在未知病毒等 因素，所以血液制剂的使用存在被感染的风险，因此国家也强制要求各生产企业在生产工 艺的应用病毒灭活处理方式已降低风险。
[0019] 本发明涉及一种对原料混合血浆进行病毒灭活处理的方法，其目的是为了提供一 种成本低、操作简便的病毒灭活处理方式，从源头上把控，极大的降低药品病毒感染风险， 同时使用该种病毒灭活后的血浆，仍能保持各种蛋白、因子及酶的活性。本发明包括：血浆 合并后，加入保护剂和病毒灭活剂，经病毒灭活处理后，去除灭活剂，得到符合《中华人民共 和国药典》2010年版三部规定的原料血浆。
[0020] 本发明对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法采用有机溶剂和去污剂 联合应用，能有效去除脂包膜病毒，该病毒处理方式使用方便，简单易操作，采用有机溶剂 和去污剂对原料混合血浆进行的初步病毒灭活处理，不仅降低血液制品二次污染的几率， 同时能有效保持各种蛋白、凝血因子及酶的活性。
[0021] 本发明还具有如下优点：
[0022] 1、有机溶剂和去污剂联合应用，能快速有效去除部分病毒，且该病毒处理方式使 用方便，简单易操作；
[0023] 2、本工艺中通过药用级植物油的萃取方法能简便而有效的对有机溶剂和去污剂 残留进行除去处理，达到《中国药典》2010版对这两种试剂残留量的要求；
[0024] 3、使用该方式处理后的原料血浆，不仅降低血液制品二次污染的几率，提高安全 性，同时能有效保持各种蛋白、凝血因子及酶的活性，不影响后续生产工艺提取各种蛋白及 酶类制品。
[0025] 下面结合附图对本发明的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法作进 一步说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明方法中原料血浆经有机溶剂和去污剂混匀液处理后的中间品灭活 PRV效果动力学曲线图；
[0027] 图2为本发明方法中原料血浆经有机溶剂和去污剂混匀液处理后的中间品灭活 Sindbis病毒效果动力学曲线图。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 采用有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆进行病毒处理。
[0030] (1)血浆融化
[0031] 从冷库领取符合《中国药典》2010版三部中"血液制品生产用人血浆"规定、并经 复检合格且符合检疫期的血浆1668人份（净重：1002. 34公斤），血浆融化在D级洁净区内 进行。采用自然融化法或者水浴融化法。水浴融化法的水温应控制在37°C以下。
[0032] (2)血浆合并
[0033] 合并血浆，血浆合并在D级洁净区内进行，合并之前，应对血浆袋进行消毒处理， 即用75%酒精浸泡三分钟以上，用干净纱布将血浆袋外部酒精擦净后才能合并。合并血浆 时,应注意点滴回收,合并后混合血浆体积为965. 5升。
[0034] ⑶将混合血浆温度控制在24±2°C，加入250mmol/L的CaCl2溶液7. 8毫升，搅 拌10分钟后使用孔径Ium的滤芯过滤澄清；
[0035] (4)收集滤液963升，按体积比30:1加入浓度为30%的吐温-80(tween-80)和9% 磷酸三丁酯（TNBP)混合液32. 1升。保持反应液的温度，控制在24±2°C，恒温4-6小时。
[0036] (5)恒温时间结束后，根据反应液体积，加入药用级的植物油49. 8升，降低反应液 温度至16 ±2 °C。
[0037] (6)快速搅拌15分钟，静止放置30分钟，使得油液相完全分层；
[0038] (7)使用隔离泵从混合液底部进行抽提，弃除油相。得到经病毒处理后的原料血浆 990 升。
[0039] 病毒处理后的血浆质量标准
[0040] 1、所用血浆原料应符合《中国药典》2010版三部中"血液制品生产用人血浆"规 定；
[0041] 2、蛋白含量
[0042] 可采用双缩脲法（《中国药典附录》附录VIB第三法）测定，应不低于5.0%。
[0043] 3、因子效价测定
[0044] 3. 1人凝血因子IX效价测定
[0045] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录X L)，每Iml人凝血因子IX效价不低 于 0. 7IU。
[0046] 3. 2人凝血因子II效价测定
[0047] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录X J)，每Iml人凝血因子IX效价不低 于 0. 5IU。
[0048] 3· 3人凝血因子W效价测定
[0049] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录X Κ)，每Iml人凝血因子IX效价不低于 0· 5IU。
[0050] 3. 4人凝血因子X效价测定
[0051] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录X Μ)，每Iml人凝血因子IX效价不低于 0· 7IU。
[0052] 3. 5人凝血因子VDI效价测定
[0053] 依法测定（(2010年版《中国药典》三部附录X Ν)，每Iml人凝血因子IX效价不低 于 0. 7IU。
[0054] 4、HBsAg
[0055] 用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
[0056] 5、HIV-1/HIV_2 抗体
[0057] 用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
[0058] 6、HCV 抗体
[0059] 用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
[0060] 7、无菌试验
[0061] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录XII A)检定，应符合规定。
[0062] 8、磷酸三丁酯残留量
[0063] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录VI J)，应不高于10 μ g/ml。
[0064] 9、聚山梨酯80残留量
[0065] 依法测定（2010年版《中国药典》三部附录VI H)应不高于100 μ g/ml。
[0066] 一、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆病毒处理效果验证
[0067] 根据《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》（国药监注〔2002〕160 号）文件的精神，我公司对三批人原料血浆的病毒灭活处理工艺进行了验证，验证的结果 如下：
[0068] 1、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活PRV(伪狂犬病毒） 验证结果见表1及图1，由表1可以看出，三批中间品，经过该灭活处理方法（0.3% TNBP+1. 0 % Tween-80, 25± I °C，6小时）病毒灭活后，残余PRV滴度均低于本试验 最低检测限（_〇. 5LgTCID50/0. Iml) ·可灭活所加指示病毒PRV分别为：20140301 批 > 4.87LgTCID50/0.1ml，20140302 批 > 4.75LgTCID50/0.1ml，20140303 批 彡4. 81LgTCID50/0. lml。取4小时、6小时最低稀释度孔中的上清用于PK - 15细胞盲传 三代，未见特异性细胞病变（CPE)。
[0069] 2、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活Sindbis (辛巴氏病 毒）验证结果见表2及图2,由表2可以看出，三批中间品，经过该灭活处理方法（0.3% TNBP+1.0% Tween-80, 25土 1°C，6小时）病毒灭活后，对Sindbis病毒发生了显著灭活作 用·可灭活所加指示病毒Sindbis病毒分别为：20140301批彡4. 95LgPFU/ml，20140302 批彡4. 81LgPFU/ml，20140303批彡4. 87LgPFU/ml。取4小时、6小时最低稀释度样品用于 BHK - 21细胞盲传三代，未见特异性细胞病变（CPE)。
[0070] 二、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活PRV病毒效果验证报告
[0071] 制品名称：多人份混合原料人血浆
[0072] 验证用样品：原料血楽病毒处理后的中间品
[0073] 样品批号：20140301 ;20140302 ;20140303。
[0074] 生产单位：同路生物制药有限公司
[0075] 验证依据：《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》
[0076] (国药监注〔2002〕160 号）
[0077] (一）、PRV病毒灭活效果验证试验方案
[0078] 1、验证目的：
[0079] 验证有机溶剂和去污剂混匀液（0· 3% TNBP+1. 0% Tween_80,25±l°C，6小时）对 多人份混合原料人血浆中指示病毒PRV病毒的灭活效果。
[0080] 2、验证样品
[0081] 病毒处理后的中间品取自生产过程中有机溶剂和去污剂混匀液处理之前一步， 于-20°C保存。样品的主要质量参数见表3。
[0082] 表3.样品的主要参数
【权利要求】
1. 一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：包括如下步 骤： (1) 将多人份血浆在常温下混合； (2) 混合后的血浆精确计量体积，温度控制在24±2°C，加入CaCl2溶液使得混合后的 血浆中最终CaCl2为（2±0. 5)mmol/L，搅拌10分钟后使用孔径1 y m的滤芯过滤澄清，得到 过滤液； (3) 根据过滤液的体积量，加入30 %的吐温-80 (tween-80)和磷酸三丁酯（TNBP) 混合液，使得过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为（1 ±0. 3) %和 (0. 3±0. 1) %，保持混合液的温度，控制在24±2°C，恒温4-6小时； (4) 恒温结束后，根据混合液体积，加入药用级的植物油，使得最终植物油的体积百分 比为（5±2)%，降低反应液温度至16±2°C ; (5) 快速搅拌15分钟，静止放置30分钟，使得油液相完全分层，得到混合液； (6) 使用隔离泵从混合液底部进行抽提，弃除油相，得到的液相作为血液制品的原料进 行人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品的制备。
2. 根据权利要求1所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在 于：所述混合后的血楽中最终CaCl2为2mmol/L。
3. 根据权利要求2所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在 于：所述过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为1 %和0. 3%。
4. 根据权利要求3所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在 于：所述植物油的体积百分比为5%。
5. 根据权利要求4所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在 于：所述血液制品的原料中凝血因子II、Vn、W、IX、X均不低于0. 7IU/ml。
6. 根据权利要求5所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征 在于：采用所述液相作为血液制品的原料制备得到的人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品 中，tween-80残留量为不高于100ug/ml，TNBP残留量为不高于10ug/ml。
【文档编号】A61K47/34GK104367591SQ201410553174
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】胡辉恒, 邓坤, 董海军 申请人:同路生物制药有限公司