专利名称：包含抗egf受体抗体的药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含对抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体的稳定药物制剂及其制备和应用。
多种体外和体内研究已经证明用抗体封闭EGFR能在不同水平对抗肿瘤，例如抑制癌细胞增殖、减少肿瘤介导的血管生成、诱导癌细胞凋亡和增强放射疗法和常规化疗法的毒性作用。
MAB c225(INN西妥昔单抗)是临床证实可与EGF受体结合的抗体。西妥昔单抗是一种可变区是鼠源而恒定区是人源的嵌合抗体。西妥昔单抗由Naramura等人在Cancer Immunol.Immunotherapy，1993，37343-349和WO 96/40210A1中首次描述。
MAB 425是一种对抗在肿瘤细胞、特别是在A431癌细胞中过表达的EGFR的鼠源抗体。其人源化和嵌合形式已经公开，例如在EP 0531 472 A1；Kettleborough等人，Protein Engineering 1991，4773-783；Bier等人，Cancer Chemother.Pharmacol.2001，47519-524；Bier等人，CancerImmunol.Immunother.1998，46167-173中。EMD 72000(h425)是MAB425的一种形式，其处于I/II期临床阶段，其恒定区由κ链和人γ-1链组成。
人抗-EGFR抗体可由XenoMouse技术提供，如WO 91/10741 A1、WO 94/02602 A1和WO 96/33735 A1中所述。由这项技术生产且目前正在进行临床试验的一种具体抗体是ABX-EGF(Abgenix，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2001，3817-23；Cancer Research 1999，591236-43)。
其它对抗-EGFR的抗体例如在EP 0 586 002 B1和J.Natl.Cancer Inst.1993，8527-33中有描述(MAB 528)。
与其它抗体类似，抗-EGFR抗体也可以作为溶液经胃肠道外应用于治疗用途。含有这些抗体的溶液的一个具体问题是它们倾向于聚合和形成蛋白质多聚体。关于可复原的多聚体，其可归因于通过接近的两部分之间的相互作用而随机形成的分子间二硫桥。疏水作用和随之形成的非复原性多聚体也有可能出现。此外，将随后导致蛋白质降解反应的脱酰胺反应也会出现。会发生所述的变性反应，特别是在高温下贮存或在切应力期间(例如在运输过程中)发生。
作为所述聚集倾向的后果，在抗体溶液的贮存期间发生了产品的沉淀，这意味着从装有该溶液的容器中是否可重现性地取药值得怀疑。此外，含有微粒的溶液在经胃肠道外给药时可能发生栓塞。这使得不能总是保证以可重复的方式使用抗体溶液以必须剂量对患者施用抗-EGFR抗体，而且不能在具备必需可靠性的情况下给药。
尽管在注射前过滤可以去除聚集物，但是这种方法包含了一个额外的步骤而因此变得复杂，并且不是非常适于临床实施。此外，剂量可重现性的问题仍悬而未决，因为在每种情况下从溶液中分离出未知部分的抗体，而且过滤后的颗粒形成仍然代表了安全风险。
用以稳定单克隆抗体的常用方法是把含有抗体和辅料的溶液冻干。但是，冻干法非常消耗时间和能源并因此很昂贵。此外，冻干粉在给药前必须首先重构。
EP 0 073 371描述了用于静脉内给药的含有免疫球蛋白的制剂，为保持稳定其具有3.5至5.0的pH值。但是，如此低的pH值导致在注射处出现不期望的不相容反应。
US 6,171,586 B1公开了在抗体水性制剂中使用pH4.48至5.5的乙酸盐缓冲剂、表面活性剂和多元醇，排除了用于等渗调节的NaCl。由于缺少等渗调节，在注射处同样可能发生不相容反应。
作为含有特定抗体的其它实例，关于这一点可以参考EP 0 280 358、EP 0 170 983和US 5,945,098。
其中，EP 0 280 358描述了向抗体溶液中添加葡聚糖来稳定对抗某些激素，其稳定性超过9个月。
EP 0 170 983描述了通过与水解卵清蛋白共同加热来稳定不耐热的单克隆抗体，结果该抗体在45℃贮存7天后仍然稳定。但是，向用于胃肠道外施用的制剂中加入其它种类的蛋白质由于与之相关的问题、特别是其可能的抗原性而是不期望的。
US 5,945,098公开了使用甘氨酸、聚山梨醇酯80和聚乙二醇来稳定免疫球蛋白G的水性溶液。
DE 10133394 A1公开了使用pH6至pH8的磷酸盐缓冲剂和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯来稳定西妥昔单抗的水性溶液。尽管这样可以显著减少肉眼可见的聚集体的形成，但是其化学稳定性、特别是在应激条件下的化学稳定性显著削弱。此外，该制剂在(极端)热应激条件下(例如在40℃下长期贮存)未显示出稳定性。
本发明的目的是找到适于经胃肠道外给药的特别用于抗-EGFR抗体的水性剂型，其具有良好的耐受性并在室温下贮存时稳定至少24个月以上。在运输过程中切应力作用下和改变的气候条件下，特别是在升高的温度和大气湿度下也应当保持贮存稳定。此外，该制剂应当具有简单的结构，并不应包含任何毒理学观点认为可疑的辅料。
令人吃惊的是，已经发现满足这些要求的溶液形式的制剂，它除了对抗表皮生长因子的抗体(抗-EGFR抗体)外，还包含缓冲剂、氨基酸和表面活性剂。因此，本发明涉及这样的水性药物制剂，它除了抗-EGFR抗体外，还包含缓冲剂、氨基酸和表面活性剂。
为了本发明的目的，水性制剂是其中至少一些存在的溶剂由水组成的制剂。可能存在的其它溶剂组成全都是适于胃肠道外使用的溶剂，特别是醇类，例如乙醇、丙醇、丙二醇或甘油。水性制剂优选包含水或乙醇/水混合物作为溶剂；溶剂特别优选由水组成。
所存在的抗体可以是任何抗-EGFR抗体，特别是开篇提到的鼠源、人源或嵌合抗体和已经并能够通过所述的XenoMouse技术制备的人抗-EGFR抗体。优选抗-EGFR抗体西妥昔单抗或EMD 72000或其相应的鼠源、人源或嵌合抗体类似物之一。特别优选包含西妥昔单抗或EMD 72000作为抗体的水性制剂。
抗-EGFR抗体可以以0.1mg/ml至50mg/ml、优选2mg/ml至10mg/ml、特别优选约5mg/ml的浓度存在于本发明的制剂中。
可采用的缓冲剂基本上都是生理学可接受的物质，它们适于设定预期pH，例如柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、磷酸盐或乳酸盐，和/或其各自的游离酸或碱，以及不同盐和/或其酸或碱的混合物。缓冲剂优选由一种或多种柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、磷酸盐或乳酸盐和/或其各自的游离酸或碱或者一种或多种不同盐和/或其酸或碱的混合物组成。术语“混合物”在此处涵盖了同一种酸的不同盐的混合物(例如不同柠檬酸盐的混合物)和不同酸的盐的混合物(例如柠檬酸盐和乙酸盐的混合物)。缓冲剂优选由一种或多种柠檬酸盐和/或其游离酸(例如柠檬酸、一水合柠檬酸、二水合柠檬酸三钠、一水合柠檬酸三钾)、乙酸盐和/或其游离酸(例如乙酸、乙酸钠、三水合乙酸钠)或者L-组氨酸和/或其酸加成盐(例如一水合L-组氨酸单盐酸盐)组成。本发明的制剂有利地包含浓度为10至100mmol/l、优选2至20mmol/l、特别优选约10mmol/l的缓冲剂。
该制剂的pH范围是5.0至6.0，优选5.2至5.8，特别优选是约5.5。
本发明的制剂具有良好的生理耐受性，易于制备，能精确配药，并且就在储存、反复冻融加工和机械应激过程中对分解产物和聚集物的分析而言是稳定的。其在冰箱温度(2-8℃)下贮存超过至少3个月至4年的时间保持稳定。令人吃惊的是，本发明的制剂在升高温度和较高大气湿度水平(例如25℃和60％相对大气湿度)下贮存直至2年以上保持稳定，或者在40℃和75％相对大气湿度下贮存3个月以上保持稳定。
该制剂中存在的氨基酸可以是碱性氨基酸(例如精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸)或中性氨基酸(例如甘氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸)或芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)。优选采用无机盐形式的碱性氨基酸(盐酸盐形式即作为氨基酸盐酸盐形式是有利的)。所用的氨基酸在每种情况下优选为L-形式。本发明的制剂中存在的氨基酸特别优选为L-精氨酸、甘氨酸和L-蛋氨酸。
该制剂包含浓度为2至200mmol/l、优选50至150mmol/l、特别优选约100mmol/l的氨基酸。
可以使用的表面活性剂是在药物制剂中常用的所有表面活性剂，优选聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯还已知商品名为吐温。适宜的聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯有聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯和聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯。优选聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯和聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯，特别优选聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯。聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物还已知商品名为泊洛沙姆。特别优选的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物为泊洛沙姆407(CAS 9003-11-6)。
表面活性剂可以以0.001％至1.0％重量的浓度存在于制剂中。如果聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯作为表面活性剂存在，优选以0.005％至0.1％重量、特别优选以约0.01％重量的量存在。如果存在聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，优选以0.01％至0.5％重量、特别优选以约0.1％重量的量存在。
为了提高胃肠道外给药的耐受性，渗透压优选为等渗范围，即约250至350mOsmol/kg的渗透压。该制剂从而可以基本无痛地直接经静脉内、动脉内以及还有皮下给药。
根据有利的实施方案，本发明的制剂因此额外包含等渗调节所必需浓度的等渗调节剂，优选生理可耐受的盐(例如氯化钠或氯化钾)或生理可耐受的多元醇(例如葡萄糖或甘油)。因此，本发明还涉及这样的水性制剂，其包含抗-EGFR抗体、缓冲剂、氨基酸、表面活性剂和等渗调节所必需浓度的等渗调节剂。氯化钠特别优选作为等渗调节剂存在。
此外，本发明的溶液可以包含其它生理可耐受的辅料，例如抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)、防腐剂(例如苯酚、m-甲酚、尼泊金甲酯或丙酯、氯代丁醇、硫柳汞或苯扎氯胺)、聚乙二醇(PEG)(例如PEG 400、PEG3000、3350、4000或6000)、二糖类(例如海藻糖或蔗糖)或环糊精(例如羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、α-环糊精或γ-环糊精)。
根据本发明特别有利的实施方案，该水性制剂包含约5mg/ml的西妥昔单抗或EMD 72000，约10mmol/l的具有pH值约5.5的柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂，约100mmol/l的甘氨酸、精氨酸或L-蛋氨酸，约100mmol/l的氯化钠和约0.01％的聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯。
该水性制剂可以通过将所述辅料加入含有抗-EGFR抗体的溶液中来制备。为此目的，将包含规定浓度的所述其它辅料的规定体积的储备液有利地加入含有规定浓度的抗-EGFR抗体的溶液(如从其制剂获得)中，并酌情将该混合物用水或缓冲液稀释成预先计算好的浓度。或者，辅料可以作为固体加入含有抗-EGFR抗体的起始溶液中。如果抗-EGFR抗体是固体形式，例如冻干物的形式，则本发明的制剂可以如下制备首先将各抗体溶于含有一种或多种其它辅料的水或水性溶液中，随后加入所需量的包含其它辅料的各储备液、固体形式的其它辅料和/或水。抗-EGFR抗体也可以有利地直接溶于含有所有其它辅料的溶液中。
存在于本发明的制剂中的一种或多种辅料可以有利地已经在制备特定EGFR抗体的过程中或结束后加入。这可优选如下进行在其制备后所进行的纯化的最后一步中，将抗-EGFR抗体直接溶于含有一种、多种或全部其它辅料的水性溶液中。为了制备该制剂，则各种其它一种或多种成分在各种情况下仅需以较小的量加入和/或根本无需加入。特别优选将各种成分在其制备后所进行的纯化的最后一步中直接溶解于包含所有其它辅料的水溶液中。
如果含有各抗体和辅料的溶液还未具备预期pH，可以通过加入酸或碱来设定，优选使用已经存在于缓冲系统中的酸或碱。随后进行无菌过滤。
本发明的水性制剂可以有利地用于治疗肿瘤疾病。
这些实施例解释本发明，但并不局限于此。
实施例1(对比实施例1)水性溶液包含2mg/ml西妥昔单抗10mmol/l磷酸钠缓冲剂pH7.2145mmol/l氯化钠通过将规定体积的包含规定浓度的各辅料的水性溶液混合来进行制备。使用如下溶液溶液A(活性成分溶液)，包含18mg/ml西妥昔单抗10mmol/l磷酸钠缓冲剂pH7.2(由2.07g/l磷酸氢二钠7水合物和0.31g/l磷酸二氢钠一水合物组成)
145mmol/l氯化钠(在活性成分制备后进行的纯化的最后一步，借助于正切流动过滤，通过将不含活性成分的溶液B再缓冲来获得。)溶液B(缓冲剂/盐溶液)与溶液A一致，但不包含活性成分。
为制备对比溶液1，将1.11份体积的溶液A和8.89份体积的溶液B彼此混合。
在转移前将制备的溶液用无菌滤器过滤，转移至注射小瓶中。随即将注射小瓶用塞子密封并压边。
实施例2(对比实施例2)水性溶液包含2mg/ml西妥昔单抗10mmol/l磷酸钠缓冲剂pH7.2145mmol/l氯化钠0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯通过将规定体积的包含规定浓度的各成分的水性溶液混合来进行制备。除溶液A外，还使用如下溶液溶液C(缓冲剂/盐溶液，包含聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯)与溶液B一致，但额外包含0.0125％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯。
为制备对比溶液2，将1.11份体积的溶液A和8.89份体积的溶液C彼此混合。
在转移前将制备的溶液用无菌滤器过滤，转移至注射小瓶中。随即将注射小瓶用塞子密封并压边。
实施例3(本发明的制剂)5mg/ml西妥昔单抗10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5100mmol/l甘氨酸100mmol/l氯化钠0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯通过将规定体积的包含规定浓度的各成分的水性溶液混合来进行制备。
溶液D(活性成分在柠檬酸缓冲剂中的溶液)16mg/ml西要昔单抗10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.1014g/l柠檬酸单水合物组成)(在活性成分制备后进行的纯化的最后一步，借助于正切流动过滤，通过将不含活性成分的溶液E再缓冲来获得。)溶液E(缓冲溶液)与溶液D一致，但不包含活性成分。
溶液F(缓冲剂/盐溶液)与溶液E一致，但包含145.5mmol/l甘氨酸145.5mmol/l氯化钠和0.015％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯为制备本发明的制剂，将3.125份体积的溶液D和6.875份体积的溶液F彼此混合。
在转移前将制备的溶液用无菌滤器过滤，转移至注射小瓶中。随即将注射小瓶用塞子密封并压边。
实施例4下列溶液的制备与上述实施例的方法类似实施例4.1，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l甘氨酸0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.9410g/l柠檬酸三钠二水合物组成)实施例4.2，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l甘氨酸100mmol/l氯化钠0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.1014g/l柠檬酸单水合物组成)实施例4.3，溶液，包含5mg/ml EMD 72000100mmol/l甘氨酸100mmol/l氯化钠0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.1014g/l柠檬酸单水合物组成)实施例4.4，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l L-蛋氨酸0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.1014g/l柠檬酸单水合物组成)
实施例4.5，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l甘氨酸0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l乙酸盐缓冲剂pH5.5(由1.3608g/l乙酸钠三水合物组成)实施例4.6，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l甘氨酸0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l组氨酸缓冲剂pH5.5(由2.069g/l L-组氨酸单盐酸盐单水合物组成)实施例4.7，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l甘氨酸0.01％重量聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.1014g/l柠檬酸单水合物组成)实施例4.8，溶液，包含5mg/ml西妥昔单抗100mmol/l甘氨酸0.01％重量聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物407(泊洛沙姆407)10mmol/l柠檬酸盐缓冲剂pH5.5(由2.1014g/l柠檬酸单水合物组成)实施例5本发明制剂的稳定性通过应激试验来检测。为此目的，将装有实施例3溶液的小瓶和用作对比目的的装有实施例1和2溶液的小瓶在25℃和60％相对大气湿度及40℃和75％相对大气湿度下贮存。此外，将装有实施例1、2和3溶液的小瓶在震荡器上以150min-1的频率于室温震荡五天，并连续在-20℃冷冻和随即在+5℃解冻三次。贮存前和限定贮存时间后，使用冷光源直接照明对小瓶进行目测，确定用以代表浊度度量的溶液于350nm的吸收度。为了说明贮存或处理的影响，计算各自相对于起始值的相对浊度。此外，采用HPLC凝胶过滤就西妥昔单抗、聚集物和分解产物的含量对小瓶进行了分析。
稳定性研究结果见表1。
表1本发明制剂(实施例3)和两种对比溶液(实施例1和2)的稳定性数据概述结果清楚表明，本发明的制剂与现有技术的对比溶液相比稳定性显著提高。
权利要求
1.水性制剂，包含抗-EGFR抗体、缓冲剂、氨基酸和表面活性剂。
2.权利要求1的制剂，其特征在于抗体是西妥昔单抗或EMD 72000或其相应的鼠源、人源或嵌合抗体类似物之一。
3.权利要求2的制剂，其特征在于抗体是西妥昔单抗或EMD 72000。
4.权利要求1至3中一项或多项所述的制剂，其特征在于缓冲剂由一种或多种柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、磷酸盐或乳酸盐和/或各自的游离酸或碱或者一种或多种不同盐和/或其酸或碱的混合物组成。
5.权利要求4的制剂，其特征在于缓冲剂由一种或多种柠檬酸盐和/或其游离酸、乙酸盐和/或其游离酸或L-组氨酸和/或其酸加成盐组成。
6.权利要求1至5中一项或多项所述的制剂，其特征在于氨基酸是L-精氨酸、甘氨酸或L-蛋氨酸。
7.权利要求1至6中一项或多项所述的制剂，其特征在于表面活性剂是聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
8.权利要求7的制剂，其特征在于聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂是聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯或聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯。
9.权利要求7的制剂，其特征在于表面活性剂是泊洛沙姆407。
10.权利要求1至9中一项或多项所述的制剂，其特征在于还存在等渗调节所必需浓度的等渗调节剂。
11.权利要求10的制剂，其特征在于等渗调节剂是氯化钠。
12.权利要求1至11中一项或多项所述的制剂，其特征在于它具有5-7的pH值，优选pH5.2至pH6.0。
13.权利要求12的制剂，其特征在于它具有约5.5的pH值。
14.权利要求1至13中一项或多项所述的制剂，其特征在于它包含约5mg/ml西妥昔单抗或EMD 72000，约10mmol/l柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂，约100mmol/l甘氨酸、L-精氨酸或L-蛋氨酸，约100mmol/l氯化钠和约0.01％聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯，并具有约5.5的pH值。
15.权利要求1至14中一项或多项所述的药物制剂的制备方法，其特征在于将包含抗-EGFR抗体的水性制剂加入所述辅料之一中。
16.权利要求1至14中一项或多项所述的制剂用于治疗肿瘤疾病的用途。
全文摘要
本发明涉及包含对抗内皮生长因子受体(EGF受体)的抗体的水性药物制剂。该制剂具有提高的贮存稳定性，即使在高温下仍如此，并可用于治疗肿瘤。
文档编号A61K9/00GK1886158SQ200480034706
公开日2006年12月27日 申请日期2004年10月26日 优先权日2003年11月26日
发明者H-C·马勒, R·米勒 申请人:默克专利有限公司