专利名称：包括麻仁球蛋白的用于代替血浆的制剂及它的生产方法
技术领域：
01发明涉及血浆代用品制剂及其生产方法。
背景技术：
02血浆是淡黄色、透明的液体血液组分，除了水外，其含有广谱的蛋白质、糖类、脂肪和矿物质。它在营养成分的运输、新陈代谢过程以及信息传递中起着重要的作用。血浆占血液体积的大约55％。血浆组分的绝大多数在几小时到几天的循环中恢复再生。其全面的结构和其各个组分所起的作用仍然未能精确地知晓。为输血的目的，血浆一旦从供血者抽取后，或在自身抽取过程中，通过所谓的单采血浆术(plasmophoresis)很快地与其它血液组分分离，然后迅速地被冷冻。当被冷冻并保持在大约-25℃时，此种血浆的保存期限可达2年。给予血浆的原因可能包括蛋白质从人体大量损失，如烧伤后大量血液的损失，这是因为蛋白质所起的作用之一是维持血液的渗透性。经常可能的是，代替血浆，给予来自一组灌输液(infusion solution)的制剂，所述灌输液例如是生理溶液、哈特曼溶液、林格-乳酸盐溶液，其具有与血浆相似的或较简单的离子组成；此外还有，基于缩水甘油物质的胶体，所谓的血浆扩张剂(plasmatic expander)，例如葡聚糖、羟乙基淀粉或和清蛋白(albumin)，然而由于其组成的缘故，不能成为任何具有全面价值的血浆代用品。迄今为止使用的血浆代用品(广泛生产的葡聚糖、明胶、羟乙基-淀粉)是与血浆没有任何共同点的大分子药物，其迅速在肝脏内进行生物转化，并且只能用于在存在生命威胁和因例如烧伤或脓毒病引起的休克而开始进行生物体休克治疗的情况下维持血液体积，但是它们不应当用于在蛋白质、水和电解液损失之后维持血浆体积(plasmatic volume)，在发生这些事件时，必须直接应用具有大量清蛋白的血浆或血浆蛋白组分。清蛋白是血浆蛋白之一，在血浆中最丰富，但是它不能刺激生物体的免疫系统。含有的支持免疫系统的球蛋白大约比血浆中球蛋白少三倍，这就是不从球蛋白产生血浆的原因。血浆的组成如下大约91％的水；7％的溶解的有机物质如清蛋白、球蛋白、凝血因子I；1％的溶解的无机物质，具有离子Na+(150mmol/l)、Cl-(100mmol/l)、HCO3(30mmol/l)、K+(5mmol/l)；以及其余的激素和其它被运输的物质。迄今为止，实践中需要用其它展示出相似功能特性的制剂代替使用的人血浆，比较经常考虑的主要原因有两个。目前，同源输血的数量在减少，同源输血即将别人的，但具有相同或相似抗原特性的血液输到外科病人或其它患者中。该输血减少的主要原因是健康的血液和血液衍生品的价格；例如，在美国，每输血一次，费用已升到500美元。可以预期，输送药物的费用也提高，这是由于健康供血者的缺乏以及需要更为频繁地治疗因输液本身或血浆应用而引起的并发症。支持为了替代血液的一种或多种功能而进行实验室、临床前和临床研究努力的另一个原因在于输血和使用血浆后往往出现并发症。在最普遍的可归因于输血的疾病中，有慢性肝炎、肝硬化、对肿瘤的抵抗力减弱以及其它传染病，主要是HIV、BSE、SARS、LYME、包柔螺旋体病、逆转录病毒、朊病毒和其它疾病。据美国疾病控制中心(American disease monitoring centers)估计，在上世纪70年代，每年有3500人死于与输血或输血浆相关的肝炎，同时其它数据也提高了几倍。由于更深入的测试和更仔细地选择供血者，由乙型肝炎病毒引起的污染事件的数量已减少，但新型的丙型肝炎病毒出现了，已侵袭了超过4百万的美国人，并且几十万人在输血或给予血浆后感染了疾病。格外严格的测试可能减少输血后丙型肝炎出现的数量。G型肝炎是最近记述的RNA病毒，其的确通过输液传染，虽然通常地还不知道它的感染风险。因此，应当关注，新的感染危险可能出现，这只有在一些受血者被感染时才可认识到。对于多数受血者，细胞巨化病毒引起的感染(CMV)表面上不需要显示出其本身的存在，但是可能严重到对没有任何CMV解毒剂的免疫抑制的患者(出生体重低的新生婴儿、移植患者)不利。特别要关注的是HIV病毒对血液/血浆的污染，因为在许多国家的儿童和成人都有这种传染病(例如在法国，从1982年到1985年，有六到八千人在输液和给予血浆后感染了HIV)。在非洲，HIV患者也在增加，原因不仅是由于性混乱，而且有大约10％的感染由输血和输血浆造成的。在巴基斯坦，该百分比甚至更高，现在接近所有AIDS发生事件的一半。毫无疑问的是，这与发展中国家供血者血液测试的不够协调紧密相关。上述发现现在提出了一个严重的世界性问题。
03本发明的目的是提供有价值的蛋白质型血浆代用品，其与人球蛋白具有相似的物理和化学特性，能够代替球蛋白；具有足够的渗透响应(osmotic response)和粘度；对病毒为惰性并支持身体的免疫性，能够生物转化为免疫球蛋白。
此外，本发明的目的是提供血浆代用品合适的初始产品及其可靠而有效的生产方法。
发明主题04由植物蛋白质物质麻仁球蛋白形成的血浆代用品制剂(agentfor substitution of the blood plasma)，在很大程度上，克服了现有技术状态的缺陷，并实现了本发明的目的。麻仁球蛋白有利地从大麻仁中产生。有利地，麻仁球蛋白是溶液的一种组分，该溶液组成为重量百分比为5％-40％的麻仁球蛋白、重量百分比为0.5％-7％的无机物质、重量百分比为0.5％-7％的有机物质、激素和其它物质，直到该胶体溶液的重量百分比总和为100％。根据血浆代用品制剂的制造方法，将植物种子或冷榨或磨为粉末，并在压缩气体下进行萃取；分离压出的或萃取的油；通过有机溶剂的作用萃取要除去脂肪和脱色的、压在一起的或被萃取的种子；然后过滤已除去脂肪和脱色的物质，并将它们暴露在水溶液中的无机盐作用下；以及在20℃-60℃的温度下过滤溶液，并将麻仁球蛋白最终从滤液中分离出来。有利地，使大麻种子经受冷榨和磨细过程以及气体-辅助加压萃取(gas-assisted pressing extraction)过程。在压缩的二氧化碳下萃取植物种子。有利地，在20℃-60℃的温度下(有利地，为20℃)，将无机盐的饱和溶液加入到已除去脂肪和脱色的物质中；然后在20℃-60℃的温度下(有利地，为20℃)，搅拌产生的混合物0.01-2.5小时(有利地，为0.5小时)；之后，加入重量百分比为0.1％-30％的无机盐；然后在20℃-60℃的温度下，搅拌形成的混合物0.6-60分钟(有利地，为30分钟)；用化学过滤器进行过滤；将滤液急剧冷却到-50℃至+15℃，以使麻仁球蛋白结晶；将麻仁球蛋白粗晶体倒入蒸馏水中并通过加压过滤进行分离；形成的滤液用于制备含有麻仁球蛋白或已除去脂肪和脱色的物质的水溶液，一旦加入水后，被用于在20℃-60℃(有利地，为5℃)时制备该水溶液；将无机盐，例如有利地为氯化钠，加入到水溶液中，得到1％-20％的溶液(有利地，为5％的溶液)；然后剧烈搅拌混合物1-60分钟(有利地，为30分钟)；之后，使其静止沉降并沉淀，以分离蛋白质沉淀物；过滤蛋白质沉淀物；在滤液中，通过盐的作用(有利地，为硫酸铵)，以溶液的形式分离出麻仁球蛋白；以及在两种情况下，通过渗析或柱层析，将麻仁球蛋白进一步提纯到大于95％的纯度水平(有利地，为99.9％)。
05就其性质而言，麻仁球蛋白是一种植物来源的球蛋白(中等尺寸的蛋白质)，由特定的一级氨基酸序列组成，其组成和氨基酸的结构与天然的人球蛋白很相似、很接近。球蛋白是一种蛋白质，其与清蛋白一起，组成血浆单纯蛋白质的最大部分。大多数抗体(免疫球蛋白类型)都包含在人血浆的球蛋白组分中。麻仁球蛋白由氨基酸组成(以C、O、H为其基本的构造单元)。作为蛋白质中一种，根据本发明的麻仁球蛋白替代作为人源蛋白质的球蛋白。植物的麻仁球蛋白似乎是免疫球蛋白合成的方便的前体(前身)(为进行该合成而排列；因此，生物体将得到半成品的人特异性免疫球蛋白，而不需要在复杂而消耗能量的过程中制造其本身)。人血浆包括三种类型的血浆蛋白球蛋白系列、清蛋白系列和一类凝血因子I。麻仁球蛋白可用于代替球蛋白。血浆蛋白大部分来源于肝脏，人体自身在肝脏中产生球蛋白，在淋巴细胞、白血细胞中产生免疫球蛋白(抗体)。根据本发明，所述溶液将植物来源的、与球蛋白基物质最紧密相关的天然物质提供给生物体，以使生物体(主要在遭受疾病或衰弱时)不需要自己产生球蛋白，从而节省其资源。在物理和化学特性方面，麻仁球蛋白像人球蛋白，从而使得可能替代人球蛋白(一种蛋白质被另一种代替)。可以使用初始产品以物理替代人血浆，这是因为它具有相同的必需的粘度和渗透响应，而且与影响人体的病毒接触时是惰性的，不会被例如HIV粘附。当被分裂(split)时，麻仁球蛋白自身转化为完全有价值的人免疫球蛋白形式，从而支持免疫性。麻仁球蛋白溶液的渗透参数和粘性参数对于构造血浆扩张剂(仿造品)是最佳的。由于其分于量，麻仁球蛋白在肾脏中不会立刻通过肾小球过滤而排出(这和其它当前的代用品-葡聚糖、葡萄糖和其它母液(parent solution)不一样)，而是它通过主要在肝脏中进行的身体代谢过程的作用，逐渐地生物转化为免疫球蛋白。上述的生物转化，例如转化为特异性免疫球蛋白形式的生物转化，对于麻仁球蛋白的免疫增强效果是有益的。当在合适的浓度时，麻仁球蛋白满足胶体-渗透血浆压力的界限。以本发明的形式，麻仁球蛋白可以储存在下述条件下干燥、阴暗和低温环境(约+5℃的温度)，并与吸收周围环境的气候或大气冷凝湿度的试剂放在一起。作为血浆仿造品，本发明是有价值的，按照本发明，其组分具有与人球蛋白相似的物理和化学性质，能够替代人球蛋白，具有必需的渗透响应和粘度，对病毒为惰性，支持身体的免疫性，以及能够生物转化为免疫球蛋白。血浆代用品的初始产品是广泛可得的，可以容易而可靠地制备并长期储存，而不必将它冷冻。
实施例06基于新构思的、合适的血浆代用品，并依赖于已有的人血浆所含蛋白质的结构和特性知识，根据本发明的血浆代用品制剂表明，完全消除了与给予污染血浆相关的上述并发症和风险。在植物的世界中，存在其组成独特并与称为球蛋白的人蛋白质几乎相同的蛋白质，即麻仁球蛋白。在人血浆中存在三种类型的血浆蛋白球蛋白系列、清蛋白系列和凝血因子I。根据本发明，植物蛋白质麻仁球蛋白可以替代人球蛋白，以使人体不用以其自身的方法产生球蛋白，否则身体会因进行这些过程而消耗能量，尤其是当遭受疾病或生理衰弱时。血浆蛋白大部分在肝脏中形成，免疫球蛋白(抗体)在淋巴细胞(白细胞)中产生。麻仁球蛋白是球形的六聚体蛋白质(hexametric protein)，具有300,000D(道尔顿)的分子量，由六个相同的蛋白质亚基组成，高度稳定(在pH为5.8到7.8时)，以及和人血浆所含的类似球蛋白几乎相同。在其一级结构中，麻仁球蛋白由各种有价值的氨基酸组成，主要是精氨酸和tryptogam。与人血浆比较，它含有80％多的这些有价值的物质。一旦为了注射和静脉内应用而溶解在NaCl生理溶液或水中之后，麻仁球蛋白盐酸盐在试验的哺乳动物中具有最小、直至零的抗原应答。从预实验知识显而易见的是，麻仁球蛋白没有引起任何不利的免疫应答，而是相反地，它增强了其免疫应答的效力，这可以解释为其能够迅速用于合成抗体，尤其是γ-球蛋白系列的蛋白质。在细胞免疫的情况下，它可以作为结构上与γ-球蛋白相像的麻仁球蛋白代谢产物结合在各个淋巴细胞群的表面受体上的基础，而这就是为什么用麻仁球蛋白或其片段作为免疫增强制剂似乎是显而易见的原因。由于其分子量，麻仁球蛋白不会通过肾脏中任何直接的肾小球过滤而被排出身体，而是在肝脏组织中非常彻底地代谢(通过分子分裂而分解)为必需氨基酸。稳定的麻仁球蛋白溶液将基本上消除血浆应用的所有广为人知的缺陷(过敏性休克的风险、被人HIV病毒、肝炎、BSE、SARS、莱姆包柔螺旋体病、逆转录病毒、朊病毒等攻击的风险)以及目前广泛采用的基于葡聚糖、凝胶聚合物或淀粉衍生物的血浆代用品的缺陷，其易于通过肾脏迅速排泄掉。迄今为止所用的代用品(广泛生产的葡聚糖、凝胶、羟乙基淀粉)都是大分子药物，其与血浆没有共同点，与麻仁球蛋白相比，容易进行生物转化，并且只能在患者遭受如烧伤或脓毒病之后，在生命危险的状况或在对身体进行休克治疗时用于努力维持血液体积。一旦在蛋白质、水和电解液损失后，用它们力求维持血液体积是不好的；在这些情况下，必须直接使用血浆或具有大量清蛋白的血浆蛋白质组分，但存在所有与该应用相关的风险。本发明的主题是用好得多的蛋白质(球蛋白类型)代替低质量的蛋白质，而在进行该过程中，没有这些待解决的危险，这是因为麻仁球蛋白作为植物蛋白质在接触所有已知的通过血浆感染的病毒时是惰性的。根据我们现有的研究，富含麻仁球蛋白-基本成分(edestin-base)的代用品在占绝大多数的临床需求中将远胜于血浆。麻仁球蛋白的理想来源可得自名称为cannabis sativa的大麻的种子，其含有最大量的麻仁球蛋白。可以从这些种子中萃取粗麻仁球蛋白，并以其结晶和悬浮液的形式，精炼为高纯度水平。麻仁球蛋白基的血浆代用品可以根据用于获得作为本发明主题的血浆代用品初始产品的过程制备，纯度可达99.9％，其中它几乎具有无限期的保存期限。本发明主题消除了主要由清蛋白和矿物质组成的供血者血浆的缺陷(包括所有传染的危险，例如HIV、肝炎、BSE、SARS、莱姆包柔螺旋体病、逆转录病毒、朊病毒等)，并用好得多的蛋白质类和植物来源的制剂替代之。由于其球蛋白性质的缘故，麻仁球蛋白基的制剂(与主要由低分子量清蛋白组成的、只维持血液渗透压而没有任何维持免疫系统能力的人血浆比较)不仅维持血液渗透响应，而且当被分裂时麻仁球蛋白基的球蛋白刺激身体的免疫系统。麻仁球蛋白的低的或零抗原作用以及高含量的必需氨基酸似乎预先注定了麻仁球蛋白可作为制造人血浆代用品的基础。
07为了制备完全有价值的血浆代用品，需要重量百分比为5％-40％的麻仁球蛋白(有利地重量百分比为7.2％)、重量百分比为0.5％-7％的无机物质、重量百分比为0.5％-7％的有机物质、激素和将胶体溶液补足为100％的其它物质，同时它们的含量必须平衡，以使该溶液的胶体渗透值与血浆的相应值匹配。例如，胶体溶液包含重量百分比为7.2％的麻仁球蛋白、重量百分比为4％的无机物质、重量百分比为4％的有机物质，直到胶体溶液的重量百分比为100％。另一个例子是，胶体溶液具有重量百分比为40％的麻仁球蛋白、重量百分比为7％的无机物质和重量百分比为7％的有机物质以及作为平衡的激素，直到胶体溶液的重量百分比为100％。根据需要，可以形成任何的浓度。
08根据生产方法，为了生产本发明的人血浆代用品初始产品，或者采用普遍使用的技术设备，在它们的冷榨后，将大麻种子粉碎、磨碎，或者将它们粉碎并采用超临界流体萃取法，在液体CO2的惰性气氛中通过CO2萃取法进行萃取。由结晶形式的麻仁球蛋白制备人血浆代用品通过基于CO2方法，压紧或萃取大麻油而完成，同时磨成粉形式的废料被从残余的油和叶绿素天然染料中除去，采用的方式是在一些有机溶剂如醚、氯仿等的作用下，通过萃取进行脂肪的消除和脱色。假如是基于结晶形式的麻仁球蛋白凝结物的生产方法，必须通过剧烈搅拌在10％到30％生理溶液中的麻仁球蛋白晶体，制备麻仁球蛋白的悬浮液。将浓盐酸加入该悬浮液中，同时剧烈搅拌，直到该溶液彻底稀薄化(变为一种白色溶液)。对溶液进行冷冻干燥(在-80℃真空蒸发或冻干)，形成可溶形式的麻仁球蛋白盐酸盐疏松物质，当再次溶解在注射用水或生理溶液中时，将得到透明溶液，可用于静脉内应用。麻仁球蛋白疏松物质的保存期限可达几年，其稳定状态得以保持。假如是在盐的作用下通过从滤液中分离而生产麻仁球蛋白的方法，则在将水或水溶液加入到已去除脂肪和已脱色的物质时，需要使用较低温度的溶液，以抑制可能分裂麻仁球蛋白的蛋白酶的活性。蛋白质沉淀物滤液为白色和灰色。必须基于多糖聚集体，即一定不转移入滤液的淀粉，选择过滤器级别(filer grade)。当麻仁球蛋白要以其悬浮液形式，作为血浆代用品制剂而用于实践中时，必须通过将浓盐酸加入到麻仁球蛋白悬浮液中，同时剧烈搅拌，直到溶液变得完全清亮(透明溶液)，来制备盐酸盐形式的麻仁球蛋白疏松物质。对溶液进行冷冻干燥(在-80℃真空蒸发和/或冻干)，可形成可溶形式的麻仁球蛋白盐酸盐疏松物质，当再次溶解在注射用水或生理溶液中时，将得到透明溶液，可用于静脉内应用。麻仁球蛋白疏松物质的保存期限可达几年，其稳定状态得以保持。
权利要求
1.血浆代用品制剂，其特征在于它是由植物蛋白质物质麻仁球蛋白形成的。
2.根据权利要求1所述的血浆代用品制剂，其特征在于它是大麻种子的产物。
3.根据权利要求1或2所述的血浆代用品制剂，其特征在于它是溶液组分，所述溶液包括重量百分比为5％-40％的麻仁球蛋白、重量百分比为0.5％-7％的无机物质、重量百分比为0.5％-7％的有机物质、激素和其它物质，直到该胶体溶液的重量百分比为100％。
4.根据权利要求1所述的血浆代用品制剂的生产方法，其特征在于将植物种子冷榨或磨碎为粉末，并在压缩的气体下萃取；分离出压榨或萃取出的油；在有机溶剂的作用下，萃取压榨在一起的或萃取出的种子，以除去脂肪和颜色；然后过滤已除去脂肪和脱色的物质，并暴露于在水溶液中的无机盐的作用下；以及在20℃-60℃的温度时，过滤溶液，最终从滤液中分离麻仁球蛋白。
5.根据权利要求4所述的血浆代用品制剂的生产方法，其特征在于使所述大麻种子经受冷榨和磨碎过程以及经受气体-辅助加压萃取。
6.根据权利要求4或5所述的血浆代用品制剂的生产方法，其特征在于所述植物种子在压缩的二氧化碳下被萃取。
7.根据权利要求4-6中的其中一项所述的血浆代用品制剂的生产方法，其特征在于-将20℃-60℃温度，有利地为20℃时的所述无机盐的饱和溶液加入到所述已除去脂肪和脱色的物质中；-然后在20℃-60℃温度，有利地为20℃时，搅拌产生的混合物0.01-2.5小时，有利地为0.5小时；-加入重量百分比为0.1％-30％的无机盐；-然后在20℃-60℃温度时，搅拌产生的混合物0.6-60分钟，有利地为30分钟；-使用化学过滤器进行过滤；-将滤液急剧冷却到-50℃至+15℃，以使麻仁球蛋白凝结为晶体形式；-将麻仁球蛋白粗晶体倒入蒸馏水中，并通过加压过滤进行分离；-产生的滤液用于制备具有麻仁球蛋白或已除去脂肪和脱色的物质的水溶液，或者-通过加入水到所述已除去脂肪和脱色的物质中，形成温度为20℃-60℃、有利地为5℃的水溶液；-将无机盐，有利地例如氯化钠加入到所述水溶液中，得到1％-20％的溶液，有利地为5％的溶液；-剧烈搅拌所述混合物1-60分钟，有利地为30分钟；-静置沉降并沉淀，以分离蛋白质沉淀物；-过滤所述蛋白质沉淀物；-通过盐的作用，有利地为硫酸铵，分离滤液中溶液形式的麻仁球蛋白；以及在两种情况下，通过渗析或柱层析，进一步纯化麻仁球蛋白，达到95％以上的纯度水平，有利地为99.9％。
全文摘要
由植物蛋白质物质麻仁球蛋白，有利地由来自大麻种子的产物制造血浆代用品制剂。有利地，麻仁球蛋白是一种溶液组分，所述溶液包括重量百分比为5％－40％的麻仁球蛋白、重量百分比为0.5％－7％的无机物质、重量百分比为0.5％－7％的有机物质、激素和其它物质，直到该胶体溶液的重量百分比为100％。根据血浆代用品制剂的制造方法，将植物种子或者冷榨或者磨碎为粉末，并在压缩的气体下萃取；分离压榨出的或萃取出的植物油；在有机溶剂的作用下，萃取压在一起的或萃取的种子，除去脂肪和颜色；然后过滤已除去脂肪和脱色的物质，并暴露于在水溶液中的无机盐的作用下；以及在20℃－60℃的温度时，过滤溶液，最终从滤液中分离麻仁球蛋白。有利地，使大麻种子经受冷榨和磨碎过程以及经受气体－辅助加压萃取。有利地，植物种子在压缩的二氧化碳下被萃取。
文档编号A61P7/08GK1972699SQ200480037601
公开日2007年5月30日 申请日期2004年12月16日 优先权日2003年12月16日
发明者I·霍尔斯卡 申请人:帕伦特拉公司