专利名称：L－谷氨酰胺在制备防治细胞缺糖损伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种条件必需氨基酸-谷氨酰胺的新用途，具体涉及L-谷氨酰胺在制备防治细胞缺糖损伤药物中的应用。
背景技术：
细胞缺糖损伤是伴随着细胞缺血性损伤和细胞缺氧性损伤而发生的一种常见的、严重的细胞损伤类型，脑缺血、心肌缺血都是临床上常见的以细胞缺糖损伤伴有细胞缺氧性损伤为病理基础的的疾病，严重者导致死亡；文献还报道一些神经退行性病变的疾病如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症等也与缺糖引起的损伤相关。因此研究细胞缺糖性损伤的干预及其分子机制是目前国内外关注的热点之一，特别是寻找有效的干预药物有着重要的理论意义和应用价值。
谷氨酰胺(Glutamine，Gln)为一种条件必需氨基酸，在组织严重损伤和疾病时表现为必需氨基酸，参与损伤组织的修复过程(Byrne TA，RL Persinger，LS Young，TR Ziegler，DW Wilmore，1995，Ann Surg.222(3)243-255；Ziegler，R Thomas，Bazargan，Niloofar，Leader，M Lorraine，Martindale，G Robert，2000，Current Opinion in Clinical Nutrition& Metabo-lic Care.(5)355-362)。近年来Gln作为一个高安全性的药物被越来越多地应用于临床，如谷氨酰胺在肿瘤治疗中的应用、对心功能不全的治疗、对胰岛素抗药性影响、抗疲劳作用等等。近年来有报道都显示谷氨酰胺能通过增强热休克蛋白(heat shock protein，hsp)家族成员的表达而发挥其药理作用。Sanders和Kon发现谷氨酰胺在热应答的条件下可增强hsp70的表达(Sanders MM，C Kon.1991，J Cell Physiol.146180；1992，J Cell Ph.150(3)620-631)，将其直接注射入CHO细胞质，经Northern和Western实验也证实hsp70表达增强(Wischmeyer PE，J Riehm，KD Singleton，H Ren，MW Musch，M Kahana，EB Chang.2003，Glutamine Attenuates TumorNecrosis Factor-_Release and Enhances Heat Shock Protein 72in Human Peripheral BloodMononuclear Cells Nutrition.19(1)1-6；Paul E，MD Wischmeyer.2002，Glutamine and HeatShock Protein ExpressionNutrition 18225-228)。Wischmeyer报道谷氨酰胺也可引起热激后的IEC-18细胞中hsp70和hsp72的表达增强(Wischmeyer PE.Glutamine inducesheat shock protein expression.[J].Nutrition，2002，18225-228.；Musch MW，Hayden D，Sugi K，Straus D，Chang EB.Cell-specific induction ofhsp72-mediated protection by glutamine againstoxidant injury in IEC18 cells.[J].Proc Assoc Am Phys，1998，110136)。同时也有研究显示外源性谷胺酰胺能增强大鼠肠上皮细胞hsp72的表达，从而对氧化剂和热激引起的肠上皮细胞的损伤起到保护作用(Chow A，Zhang R.Glutamine reduces heatshock-induced cell death on rat intestinal epithelial cells.[J].J Nutr，1998，1281296)。谷氨酰胺这种增强作用较谷氨酸——谷氨酰胺的前体物质和代谢产物要强100倍，以谷氨酰胺的类似物6-重氮-5-氧-左旋正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)代替谷氨酰胺作用于体外培养细胞发现具有同样的效应(Paul E，Wischmeyer，Jacob，Riehm et al.Glutamine attenuates tumor necrosis factor-alpha release and enhances heat shock protein 72 inhuman peripheral blood mononuclear cells.[J].Nutrition，2003，19(1)l-6)，因此证实了谷氨酰胺的这一作用与其代谢过程无关。虽然已有大量的报道显示谷氨酰胺通过上调热休克蛋白的报道而对多种因素引起的细胞损伤有保护作用，但谷氨酰胺对细胞缺糖损伤的保护作用却鲜见报道。
葡萄糖调节蛋白75(grp75)是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，在缺糖、辐射等应激条件下，grp75呈上调表达，尤其是对细胞缺糖的刺激反应最为明显，以起到保护蛋白质，协助蛋白质(特别是线粒体蛋白质)转运，提高细胞对应激反应耐受性的作用(YanLIU，WenLIU，XiaodongSONG，JiZUO.Effect ofgrp75overexpression on intracellular ATP level，mitochondrial membrane potential and ROSaccumulation following glucose deprivation in PC 12 cells[J].Molecular andCellularBiochemistry2005，(268)45-51；Zuo J，Xia Bl，Massa SM，et al.grp75 is upregulated in ischemic brain.[J].J.Neurochem.1996，67S33A.)。grp75的这种生物学特性和对细胞缺糖损伤的保护作用，对于临床上各种以细胞缺糖损伤的病理基础的疾病的治疗提供了一种新的思路。然而诱导grp75上调的因素多为有害因子，如缺氧，变性蛋白，射线等，由此激发的grp75的上调表达而产生的对细胞的保护作用也是很有限的；而就目前的技术，利用转基因实现其临床治疗作用也具有极高的难度，缺乏可操作性。因此寻找一种安全性高的grp75表达增强剂实现其对细胞缺糖损伤的保护将具有相当的医学应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供条件必需氨基酸-谷氨酰胺的新用途，具体涉及L-谷氨酰胺在制备防治细胞缺糖损伤药物中的应用。
grp75是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，其N端1-23位点为线粒体的穿膜信号，可以帮助蛋白正确折叠、协助蛋白质的转运。在细胞能量代谢过程中grp75可以帮助与能量代谢相关的生物大分子穿过线粒体参与能量代谢的各种反应，故而其表达的增强可起到对细胞缺糖损伤的保护作用，由于谷氨酰胺可上调hsp家族成员hsp70、hsp72的表达，如果也能上调grp75的表达，并因此对缺糖损伤的细胞产生保护作用，则可将分子保护机制转变为具有临床可操作性强的手段，对细胞缺糖性损伤的防治具有重要意义本发明进行了谷氨酰胺对grp75的表达的影响，以及因此产生的对细胞缺糖损伤和以细胞缺糖损伤为病理基础的动物缺血性脑损伤的保护、治疗作用实验。
本发明采用PC12细胞为研究对象，通过DMEM无糖培养液培养建立细胞缺糖损伤模型。用免疫组化、蛋白质印迹法对比正常细胞、缺糖损伤模型和谷胺酰胺作用下的grp75蛋白的表达情况；用RT-PCR法在mRNA水平检测谷氨酰胺对grp75表达的作用。以MTT法检测谷氨酰胺对缺糖损伤细胞的存活率的影响；流式细胞法检测细胞在缺糖条件下和谷氨酰胺保护下细胞凋亡率的变化、线粒体跨膜电位的改变。并以大脑中动脉线栓法制作动物脑缺血模型，观察谷氨酰胺对模型动物的治疗作用。结果表明，谷氨酰胺对应激基因grp75表达有调控作用；谷胺酰胺可以通过增强grp75的表达对细胞缺糖损伤产生保护作用；谷氨酰胺对动物缺血性损伤也具有治疗作用。本发明为寻找细胞缺糖损伤保护性药物、为临床上缺血性疾病的治疗提供了依据；也为进一步分析grp75表达调控的机制奠定了基础。
本发明通过下述方法和步骤实现1、细胞培养PC12细胞常规培养，PC12细胞无糖培养(建立细胞缺糖损伤模型)，不同浓度谷氨酰胺分别作用于常规培养细胞和无糖培养细胞；2、免疫细胞化学法检测细胞内grp75的表达细胞培养与分组，免疫细胞化学检测；3、蛋白质印迹(Western blot)检测细胞内grp75的表达细胞培养与分组，蛋白质免疫印迹实验分别检测谷氨酰胺对常规培养细胞和无糖培养细胞中grp75的表达的影响，检测不同浓度谷氨酰胺对常规培养细胞的grp75的表达的影响，检测谷氨酰胺不同作用时间下对常规培养细胞grp75表达的影响；4、逆转录聚合酶链法(RT-PCR)检测细胞内grp75mRNA含量细胞培养与分组，设计引物grp75基因的扩增引物sense5′-TCAACTGATGCCTTGCA-3′antisense5′-AACCGTACATACGACCT-3′产物片段为406bp，β-actin基因的扩增引物sense5′-AACCGTGAAAAGATGACCCAG-3′antisense5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′产物片段为741bp；RT-PCR实验；5、反义grp75转染PC12细胞pcDNA3/antigrp75表达载体构建，带有EcoR I和BamH I酶切位点的目的基因PCR扩增引物sense5’AGTGAATTCaggtgccagaactacccctt3’antisense5’GATTAagctttacttggggctctg3’，表达载体质粒扩增、提取与鉴定，antigrp75的细胞转染和鉴定；6、MTT检测细胞活率细胞培养与分组，MTT检测谷氨酰胺对细胞活率的影响检测谷氨酰胺对常规培养细胞的活率的影响，检测谷氨酰胺对无糖培养细胞活率的影响，检测氨酰胺对无糖培养grp75失表达细胞活率的影响；7、细胞亚二倍体率检测细胞分组与培养，流式细胞法检测谷氨酰胺作用下细胞凋亡率的变化；8、线粒体跨膜电位检测细胞培养与分组，流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位的变化；9、动物脑缺血模型(MCAO)制作MCAO大鼠模型建立，谷氨酰胺对模型动物的治疗；10、谷氨酰胺治疗作用观察手术后连续进行实验动物的神经功能缺损评分，动物脑组织切片观察，脑片焦油紫染色后计算梗死灶面积。
本发明所采用的材料为大鼠嗜铬瘤细胞系(PC12细胞系)购自中国科学院上海细胞所；大肠杆菌JM109株；Taq DNA聚合酶(上海生工生物工程公司)；4×dNTPs(上海生工生物工程公司)；pcDNA3pcDNA3表达载体够自美国Invitrofen公司；HindIII限制性内切酶及反应缓冲液(华美生物工程公司)；EcoR I限制性内切酶及反应缓冲液(华美生物工程公司)；T4 DNA连接酶及缓冲液(Promega公司)；DNA回收试剂盒(Clontech公司)；.lipofectamine 2000(invitrogen公司)；G418(Lnvitrogen公司)DMEM高糖培养基和DMEM无糖培养基(GiBco公司)，胎牛血清、马血清(GiBco公司)；谷氨酰胺(Sigma公司)；羊抗鼠grp75多克隆抗体(Santa Craz公司)；免疫细胞化学试剂盒(博士德公司)；HRP-驴抗羊二抗、ECL试剂盒(普飞公司)；逆转录酶M-MLVRT，10×M-MLVRT Buffer(Promega公司)、TRIZOL(华舜试剂公司)、Oligo d(T)16、10×PCR反应缓冲液(上海生工生物工程公司)；MTT、DMSO DiOC6(3)(Sigma公司)；焦油紫(Sigma公司)。
图1是谷氨酰胺作用下PC12细胞中grp75表达的变化免疫细胞化学染色结果(200×)其中APC12经常规培养液作用24h，BPC12细胞无糖培养24h，胞质中棕色颗粒为grp75蛋白，CPC12细胞经谷氨酰胺常规培养液作用24h，DPC12经含谷氨酰胺无糖培养基作用24h。
图2是免疫印迹法检测谷氨酰胺作用下PC12细胞中grp75表达其中A无糖培养24h，B、C常规培养24h，DPC12经谷氨酰胺常规培养液作用24h，EPC12经含谷氨酰胺无糖培养基作用24h。
图3是不同浓度谷氨酰胺作用下PC12细胞内grp75的表达其中A0.2mmol/LB0.4mmol/LC4mmol/LD8mmol/L。
图4是谷氨酰胺不同作用时间下PC12细胞内grp75的表达其中A6hB12hC18hD24h。
图5是谷氨酰胺作用下PC12细胞中grp75mRNA水平的变化其中APC12经含谷氨酰胺无糖培养基作用24h，BPC12经谷氨酰胺常规培养液作用24h CPC12经常规培养液作用24h，DPC12经无糖培养基作用24h正常细胞，图6是谷氨酰胺对grp75低表达细胞缺糖损伤活率的影响图7是谷氨酰胺对缺糖损伤细胞线粒体跨膜电位的影响其中APC12细胞常规培养24h，BPC12细胞无糖培养24h，C、DPC12细胞含谷氨酰胺无糖培养液培养24h。
图8是各组大鼠神经功能缺损评分图9是各组大鼠脑组织切片显示梗死面积其中A正常脑组织皮层，B缺血14d皮层，C谷氨酰胺处理后皮层，D正常脑组织海马，E缺血14d海马，F谷氨酰胺处理后海马。
具体实施例方式
实施例1离体细胞实验谷氨酰胺调节培养细胞grp75表达实验；谷氨酰胺对细胞缺糖损伤保护作用实验1细胞培养PC12细胞的正常培养10ml培养瓶或培养板用0.1mg/ml多聚赖氨酸，PC12细胞培养于DMEM高糖培养基，置37℃，5％CO2培养箱适时换液、传代。
PC12细胞的无糖培养待细胞生长到1×105密度，吸去正常培养基，以DMEM无糖培养液洗细胞两次，加入DMEM无糖培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养。
谷氨酰胺作用PC12细胞培养于DMEM高糖培养基，待细胞铺满后，分别换入含不同浓度谷氨酰胺的DMEM高糖培养基，和含不同浓度谷氨酰胺的DMEM无糖培养基。
2免疫细胞化学法检测细胞内grp75的表达细胞培养与分组细胞培养于96孔板，分为阴性对照组，正常对照组，无糖培养组，谷氨酰胺组(4mmol/L)，谷氨酰胺无糖(4mmol/L)组各4个复孔。各组细胞培养24h后进行免疫细胞化学实验。
免疫细胞化学检测培养细胞以甲醇固定15min，PBS浸洗。.正常兔血清37℃封闭30min，grp75抗体以(1∶50)37℃孵育1h，PBS浸洗15min，阴性对照组以PBS代替一抗。生物素化二抗、SABC混合液，37℃各孵育1h；DAB显色、镜检。
3、蛋白质印迹(Western blot)检测细胞内grp75的表达细胞培养与分组细胞培养于10ml培养瓶，分为阴性对照组，正常对照组，无糖培养组，谷氨酰胺组(4mmol/L)，谷氨酰胺无糖(4mmol/L)组37℃二氧化碳培养箱培养24h。
细胞培养于10ml培养瓶，待生长至一定密度后，换入含不同浓度的谷氨酰胺DMEM培养液，37℃CO2培养箱培养24h。
细胞培养于10ml培养瓶，待生长至一定密度后，换入含4mmol/L谷氨酰胺DMEM培养液，37℃CO2培养箱分别培养6h、12h、18h和24h。
蛋白质免疫印迹实验上述各组细胞提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，半干式转膜仪转膜15min(电源电流≤0.8mA/cm2)。grp75的抗体以pBS按1∶100稀释，37℃平缓摇动孵育1h。4℃过夜。TTBS洗膜后加入二抗工作液(1∶1000)，室温摇动孵育45min。按ECL试剂盒说明书曝光显影。
4、逆转录聚合酶链法(RT-PCR)检测细胞内grp75mRNA含量细胞培养与分组细胞培养于10ml培养瓶，分为阴性对照组，正常对照组，无糖培养组，谷氨酰胺组(4mmol/L)和谷氨酰胺无糖组(4mmol/L)，37℃CO2培养箱培养24h。
引物设计grp75基因的扩增引物sense5′-TCAACTGATGCCTTGCA-3′antisense5′-AACCGTACATACGACCT-3′产物片段为406bp，β-actin基因的扩增引物sense5′-AACCGTGAAAAGATGACCCAG-3′antisense5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′产物片段为741bp，RT-PCR实验Trizol抽提细胞内总RNA，测定OD260和OD280值以计算纯度。4ugRNA加oligdT1μl，加DEPC水至13μl，70℃加热10min，冰浴1min。加入5×缓冲液5μl、dNTPS 5ul、M-MLVRT1μl、Rasin(inhibitor)1μl，混匀37℃恒温水浴1h，90℃2-3min合成cDNA第一链的合成。50ulPCR反应体系，包括cDNA、grp75引物、Actin引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、水。设置PCR循环参数预变性94℃7min，变性94℃60s，复性55℃60s，延伸72℃60s，35个循环后延伸，72℃5min。琼脂糖电泳，Eagle Eye凝胶成像仪检测结果。
5、反义grp75转染PC12细胞grp75反义表达载体构建反义表达载体的构建通过扩增grp75编码区的一段986bp的片断，再将其反向插入pcDNA3载体。
扩增引物sense5’AGTGAATTCaggtgccagaactacccctt3’antisense5’GATTAagctttacttggggctctg3’PCR反应体系包括引物、grp75plasmid、10×buffer、dNTPs、Taq酶等。PCR循环参数为预变性94℃90s、变性94℃45s、退火60℃45s、延伸72℃60s、再延伸72℃300s，循环次数为32次。PCR产物与pCDNA3载体以EcoR I和BamH I酶切，DNA回收试剂盒回收DNA；2μl5×反应缓冲液，1μlT4连接酶，20ng PCR酶切回收产物和60ngpCDNA3酶切产物，加ddH2O至10μl，4℃过夜，以将目的基因与pCDNA3酶切产物连接。
表达载体质粒扩增、提取与鉴定制备大肠杆菌感受态细胞，使质粒pcDNA/antigrp75穿过细菌细胞膜进入大肠杆菌，并在选择性培养基中生长成菌落。挑取单个菌落，接种至含氨苄青霉素60μg/ml的LB液体培养基中，质粒扩增、提取后以HindIII限制酶和EcoRI限制酶进行酶切鉴定。
antigrp75的细胞转染和鉴定PC12培养于24孔板内，至生长密度为80％，将脂质体(.lipofectamine 2000)-目的DNA复合物缓慢滴加入培养板中。培养6h后换新鲜培养液，继续培养细胞48h，换液并加入G418至终浓度为400μg/ml筛选，至获得细胞克隆。蛋白质印迹法鉴定低表达grp75细胞克隆的。
6、MTT检测谷氨酰胺对无胞活率的影响细胞培养与分组PC12细胞培养于96孔板，接种密度为1×105个/ml；待细胞密度到70％左右，分别换以DMEM高糖培养液、DMEM无糖培养液以及含不同浓度谷氨酰胺的DMEM无糖培养液，每组各6个复孔。grp75低表达细胞每组6个复孔，共5组以同样密度接种于96孔板，待细胞密度到70％左右，换以含不同浓度谷氨酰胺(0.2mM、0.4mM、4mM、8mM和40mM)的DMEM无糖培养液(0.2mM、0.4mM、4mM、8mM和40mM)。
MTT检测细胞活率上述各孔细胞培养24h，每孔加10μlMTT染料溶液，37℃5％CO2培养箱中培养4h。吸弃上述溶液后，加100μl DMSO溶解沉淀，室温30min。酶标仪上570nm处测定OD值。
7、细胞亚二倍体率检测PC12细胞培养于10ml培养瓶，生长密度为106个/ml。分别换以DMEM高糖培养液、DMEM无糖培养液以及含谷氨酰胺(4mM)的DMEM无糖培养液，作用24h，流式细胞法检测细胞凋亡率。
8、线粒体跨膜电位检测细胞培养与处理同细胞亚二倍体率检测，胰酶消化细胞，0.25ml相应的培养液吹打细胞成细胞悬液，加入DiOC6(3)，至细胞终浓度为2nM，37℃避光孵育15min，流式细胞仪检测DiOC6(3)的荧光强度，激发波长484nm，发射波长501nm。
结果显示免疫化学染色显示谷氨酰胺上调grp75表达细胞在缺糖损伤24h后活细胞数量减少，胞体变小、变圆，细胞皱缩。而在含有谷氨酰胺的无糖培养液中生长24h后细胞数量和性状与正常细胞相似。
细胞免疫化学结果显示grp75蛋白主要分布在细胞质中，grp75在缺糖刺激后呈上调表达(与对照组比P＜0.05＝；经谷氨酰胺作用后grp75蛋白表达量较高，结果显示无论在正常培养液或无糖培养液中生长的细胞经谷氨酰胺的作用，grp75均呈上调表达，经灰度分析，并以SPSS软件统计P＜0.01。在无糖培养液中生长的细胞经谷氨酰胺的作用后上调表达更明显(图1)，表1是谷氨酰胺作用下PC12细胞中grp75表达免疫细胞化学结果灰度值分析。
表1
*与对照组比P＜0.05**与对照组比P＜0.01
蛋白质免疫印迹显示谷氨酰胺上调grp75表达PC12细胞分别经DMEM、DMEM无糖培养基、含谷氨酰胺的DMEM及DMEM无糖培养基培养24h后，提取蛋白质经蛋白质免疫印迹实验检测细胞中grp75的表达情况。结果显示grp75蛋白在无糖培养24h(模型组)后，表达明显升高；而经谷氨酰胺作用后，grp75呈明显的上调表达，且这种上调表达对缺糖损伤的细胞更为明显(图2)。
PC12细胞分别以不同浓度的谷氨酰胺无糖培养基培养24h，提取蛋白质进行免疫印迹检测，观察谷氨酰胺的剂量与其上调grp75的作用之间的关系。蛋白质印迹显示谷氨酰胺浓度为4mmol/L和8mmol/L时grp75表达条带明显较浓度较低时明显(图3)。
以含4mmol/L浓度谷氨酰胺的DMEM培养PC12细胞，分别于换入谷氨酰胺培养液后6h、12h、18h、24h后收获细胞提取细胞蛋白质，通过蛋白质印迹法鉴定谷氨酰胺作用时间不同，细胞内grp75表达情况。实验结果显示细胞内的grp75的表达并不随着谷氨酰胺作用时间的延长也增强(图4)。
RT-PCR测定谷氨酰胺提高grp75mRNA水平本发明以逆转录聚合酶链法在mRNA水平检测细胞在谷氨酰胺作用下grp75表达的，验证了谷氨酰胺对grp75的表达影响。用β-actin作为内参照，结果显示谷氨酰胺作用下细胞内grp75mRNA量明显增高，这种增高作用在无糖条件下更为显著(图5)。
反义grp75表达载体转染降低PC12细胞内grp75表达grp75的反义表达载体经HindIII和EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳后出现符合5.4kb和986bp的条带，反义载体的序列和插入方向都符合要求。
将反义grp75转染细胞后，提取蛋白质进行蛋白质免疫印迹实验，可见细胞内的grp75表达量降低。
MTT法检测谷氨酰胺对缺糖损伤细胞活率的影响为观察谷氨酰胺对细胞是否具有毒性，以含不同浓度的谷氨酰胺的DMEM高糖培养基处理细胞24h，以MTT法检测了不同浓度谷氨酰胺对正常细胞活率的影响。结果各浓度组的OD与对照组相比P＞0.05，表明谷氨酰胺对正常细胞的生长没有影响，显示了谷氨酰胺作为药物的高安全性。表2是谷氨酰胺对细胞活率的影响。
表2
*与对照组比P＞0.05 无糖组比P＜0.01细胞经无糖培养24h后，MTT值仅为正常培养细胞的26％，而经谷氨酰胺作用的细胞其MTT值明显高于模型细胞，而且在浓度仅为0.2mmol/L时即出现了一定程度的保护作用，并随着谷氨酰胺的浓度上升而增强。表3是谷氨酰胺对缺糖细胞活率的影响。
表3
△与正常对照组比P＜0.01*与模型组比P＜0.01本发明以MTT法检测grp75低表达的细胞在含不同浓度的谷氨酰胺的无糖培养液中的活率。结果显示grp75的低表达与对照组细胞相比，经谷氨酰胺作用下两组细胞的存活率均有所提高，但是与对照组相比，grp75失表达后，谷氨酰胺对细胞的保护作用明显降低(图6)，证实谷氨酰胺对缺糖损伤细胞的保护效应确实是通过调节grp75的表达所起作用的。
细胞亚二倍体率检测结果本发明中，细胞缺糖24h，培养细胞凋亡率达到33.42％，而细胞在含4mM的无糖培养液中生长同样的时间，凋亡率仅为7.97％(图7)。
线粒体跨膜电位检测结果细胞在缺糖24h后，线粒体的跨膜电位明显降低，而在含谷氨酰胺(4mM)无糖培养液中生长的细胞则未见这种线粒体跨膜电位崩溃的情况(图7)。
实施例2整体动物实验谷氨酰胺对大鼠缺血性脑损伤的保护作用实验1、建立大鼠脑缺血模型(MCAO)动物分组实验用大鼠均饲养于室温22℃，相对湿度55％的动物房，12h昼夜节律，自由进食及饮水，适应环境1周后开始实验。术前所有实验动物均禁食12h，大鼠随机分为对照组、模型组(MCAO)和谷氨酰胺处理组。
建立MCAO模型；模型组和谷氨酰胺处理组大鼠，均选择左侧大脑中动脉(MCA)区作为梗死侧，10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉.；正中切开颈部皮肤，暴露颈总动脉并向上分离出颈内动脉和颈外动脉主干及其分支，双极射频电凝器电凝并剪断颈外动脉分出的枕动脉和甲状腺上动脉，在舌动脉和颌动脉分叉处结扎颈外动脉，动脉夹夹闭颈外动脉和颈内动脉的分叉处。颈外动脉远端结扎处附近剪一小口，插入尼龙线并疏松结扎，2h后缓慢退出尼龙线，缝合皮肤。
2、谷氨酰胺治疗谷氨酰胺处理组动物于手前24h后开始处理，按动物体重以0.75g/kg剂量腹腔注射，每天一次至动物处死。
3、谷氨酰胺治疗后动物的神经功能缺损评分手术后连续评定实验动物的神经功能缺损评分，每天一次至动物处死。动物于手术后14天处死。
评分标准0分正常；1分对侧肢体屈曲2分拖住尾巴后拉时，对侧肢体无力；3分拉住鼠尾，向病侧转圈；4分自发向病侧转圈；5分不能自发运动(Zea-longa E，Weinstein PR，Carlson，et al.[J].Stroke，1989，20(1)84-91)。
4、脑组织切片梗死灶面积计算脑片制作分别于手术后4、7、14天处死动物。0.9％的生理盐水心内灌注冲洗，4％多聚甲醛固定约30min，断头取脑，4％多聚甲醛固定液过夜，取脑做连续冠状切片，切片自大鼠前囟嘴侧1.4mm开始，切至前囟尾侧4.8mm，每片厚度为40um。并观察脑组织损伤情况。
脑片焦油紫染色后计算梗死灶面积连续切片后每隔10片取一张作焦油紫染色，计算脑缺血梗死体积，照片扫描后用Leica图像处理系统测定切片的脑梗塞面积，利用公式(Ekdahl CT，MohapelP，Elmer E，et al.Eur J Neurosci，2001；14(6)937-45)算出梗塞区及缺血对侧脑片体积，利用梗塞体积百分比(梗塞体积/对侧脑片体积×100％)表示损伤程度。
结果显示谷氨酰胺治疗后动物的神经功能缺损评分正常对照组动物未见神经功能缺损。手术组大鼠术后出现一定程度的神经功能缺损，随着时间的推移大鼠神经功能缺损程度逐渐降低，第7天后的神经功能症状较第1天明显减轻，但始终存在一定程度的神经功能缺损，第14天的神经功能缺损评分依然为1分。谷氨酰胺处理组大鼠的神经功能症状在术后第2天起即有明显地减轻，第2-6天其功能缺损评分均低于比模型组；第7天起即降低至0分(图8)。
谷氨酰胺对MCAO大鼠脑梗死体积的影响正常脑组织的切片相比，缺血14天的脑组织缺血部位损伤严重，缺血14天的组织脑组织切片中前脑缺血区域的皮层、纹状体均明显坏死；损伤侧海马区破损严重，海马呈空泡状。注射谷氨酰胺后14天后脑组织缺血与缺血相同时间模型组相比脑组织切片中前脑缺血区域的皮层仅有少部分坏死，纹状体损伤程度较轻，海马区损伤侧皮尺边界模糊，出现破损但损伤程度明显减轻；而海马形态基本完整(图9)。
焦油紫染色可见损伤组织的神经元数量减少，形态改变，尼氏小体减少，而谷氨酰胺保护下，形态类似正常皮层；焦油紫染色显示脑缺血大鼠左侧大脑出现梗死灶。手术后14天，谷氨酰胺治疗组的脑梗死体积明显小于模型组。表4是Gln对MCAO大鼠脑梗死体积的影响(％)。
表4
权利要求
1.L-谷氨酰胺在制备防治缺糖损伤细胞药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的谷胺酰胺通过增强grp75蛋白的表达防治缺糖损伤细胞。
3.L-谷氨酰胺在制备grp75表达增强剂中的应用。
4.L-谷氨酰胺在制备防治缺血性疾病药物中的应用。
5.L-谷氨酰胺在制备防治缺血性脑损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种条件必需氨基酸－谷氨酰胺的新用途，具体涉及L－谷氨酰胺在制备防治细胞缺糖损伤药物中的应用。本发明采用PC12细胞，通过建立细胞缺糖损伤模型，对比正常细胞、缺糖损伤模型和谷胺酰胺作用下的grp75蛋白的表达情况；检测谷氨酰胺对grp75表达的作用、对缺糖损伤细胞的存活率的影响和在缺糖条件下、谷氨酰胺保护下细胞凋亡率的变化、线粒体跨膜电位的改变以及对动物脑缺血模型治疗实验。结果表明，谷氨酰胺对应激基因grp75表达有调控作用、可通过增强grp75的表达对细胞缺糖损伤产生保护作用、对动物缺血性损伤具有治疗作用。本发明为制备细胞缺糖损伤保护性药物、为临床缺血性疾病的治疗提供了依据。
文档编号A61P25/28GK1947711SQ20051003043
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者刘雯, 左伋, 刘晓宇, 杨玲 申请人:复旦大学