专利名称：体内生物反应器及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种体内生物反应器及其应用。本发明的体内生物反应器(IN-VIVO BIOREACTOR)可维持组织工程化组织器官替代品体内植入早期营养并促进其再血管化。
背景技术：
组织工程是一门新兴的生物医学高科技学科，它的基本定义是通过细胞，支架材料及(或)各种生物活性因子的植入，促进受损伤部位机体组织器官的自身修复。(Tissue engineering is the persuasion of the body to heal itself，through the delivery to the appropriate sites，of molecular signals，cellsand supporting structures.)经典的组织工程治疗过程包括以下几个步骤1)从患者自体或同种异体的供体体内获得各类种子细胞，在体外传代扩增到需要的数量。2)利用各类可降解的支架材料(生物材料或人工合成材料)，按所需修补的组织器官形状进行塑型，制备成多孔的有一定强度的支架。3)将种子细胞接种在支架材料上，构建细胞-支架材料复合物，体外培养皿静态或置于生物反应器中动态培养，促进种子细胞黏附分化。4)将体外构建的细胞-支架材料复合物植入体内，修补受损组织器官。
由上述传统组织工程基本原理和方法可知保证植入物的早期营养及快速再血管化是治疗成败的关键。已有研究证明大于1mm3组织即需要毛细血管长入提供营养及排泄细胞代谢产物。受机体再生能力的限制，植入物的再血管化往往是一个缓慢的过程，并有一定的限度。以气管替代品为例，即使在具有丰富血管再生能力的大网膜包裹下，毛细血管由两端的吻合口长入至少需要两周，并很难超过2cm。组织工程化组织器官替代品是由有活性的种子细胞构建而成，在植入早期缺少血供的环境下很难存活。缓慢的再血管化极大的限制了组织工程产品的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能解决组织工程化替代品早期血供及快速血管化的体内生物反应器。
所述的体内生物反应器由体外动力泵系统和体内导管系统两大部分组成。体外动力泵系统包括输入泵系统和输出泵系统，与此相对应体内导管系统亦分为输入导管系统和输出导管系统。上述输入或输出导管的一端分别插入到组织工程组织器官替代品的内部，另一端与各自对应的输入泵或输出泵动力泵系统连接。
本发明模拟正常人体的动脉系统和静脉系统，输入泵系统及输入导管系统将营养液持续泵入组织工程化器官替代品内，输出泵系统及输出导管系统则持续排除组织工程化器官替代品内的废液，保持局部微环境的稳定。本发明能将既往组织工程治疗方案中完全分离的体外构建细胞-支架材料复合物、体内组织器官的诱导再生，两大步骤有机的结合起来。
所述的输入泵系统选用临床应用的各类输液泵系统，例如美国Deltec公司大容量灌注泵DeltecR300 & Micro 3100；美国Baxter公司的Volumetric InfusionPump；美国B.Braun公司的Vista Basic Infusion Pump；美国Arcomedical Infusion Ltd.公司的VP系列Infusion Pump。
所述的输出泵系统选用目前临床应用的各类引流系统，如美国Tyko公司REDON临床可携带引流系统。
所述的体内导管系统选用目前临床应用的各类可植入导管系统，例如美国Deltec公司可植入导管系统CliniCath PICC(peripherally inserted centralcatheters)。
上述体内导管系统各类导管中的连接端通过各类可植入导入系统埋藏在皮下，例如美国Deltec公司可植入导入系统PORT-A-CATH。
上述输入泵系统通过各类可植入导入系统连接针头，例如美国Deltec公司PORT-A-CATH Needles，与埋藏在皮下的可植入导入系统连接，从而与体内输入导管系统相连通。
上述输出泵系统通过各类可植入导入系统连接针头，例如美国Deltec公司PORT-A-CATH Needles，与埋藏在皮下的可植入导入系统连接，从而与体内输出导管系统相连通。
所述的组织工程化器官替代品包括所有临床应用的组织工程化产品，例如组织工程化骨，组织工程化气管，组织工程化食道，组织工程化肝脏或组织工程化膀胱。
本发明具有下述优点1.通过持续及稳定地泵入细胞营养液维持组织工程化替代品内部种子细胞的存活，保证替代品的功能替代作用。
2.可在营养液中同时加入相应的种子细胞，用以更新替换死亡的种子细胞，保证替代品功能替代的稳定持续性。
3.由于可以随时增加和更新种子细胞，减轻了组织工程替代品体外构建对种子细胞数量的要求。能显著缩短体外构建所需时间，极大地拓展临床应用适应症。如在急诊手术中可先单纯植入支架材料，同时取材培养种子细胞，在急诊术后恢复期间再通过体内生物反应器持续输入和更新种子细胞。
4.可在营养液中同时加入相应的各类生长因子保证和促进种子细胞定向分化。特别是当利用各类干细胞作为种子细胞植入后，由于其自身具有多向分化能力，需要维持适当的微环境保证其向预计的方向分化。传统的方法多利用转基因细胞局部持续分泌相应生长因子，但其技术复杂，成本高，以及受道德争议不定因素的影响。
5.可在营养液中同时加入相应的各类生长因子促进组织工程器官替代品再血管化。再血管化是一个复杂的生理修复过程，需要多种细胞因子持续协调的协同作用。通过体内生物反应器可以精确调控各类生长因子作用频率及强度，更好的模拟正常生理过程。
图1是实施例1的组织工程化骨替代品支架材料结构示意图。
其中A是该组织工程化骨替代品支架材料俯视图，显示为6×6公分的正方形。黄色显示输入和输出导管系统，红色显示替代品内部与输入和输出导管系统相垂直的孔洞，目的是最大限度的扩大输入液灌注范围；B为与输入和输出导管系统平行的，该组织工程化骨替代品支架材料侧面图，显示其厚度为1公分。其右侧箭头所示小图显示了替代品内部是多孔的蜂窝状组织，孔洞直径为200微米；
C为与输入和输出导管系统垂直的，该组织工程化骨替代品支架材料侧面图；D是45度角侧视图，绿色显示输入和输出导管系统与可植入导入系统连接的部分。
具体实施例方式
实施例1组织工程化骨连接体内生物反应器本发明通过下述实施例进一步说明本发明的技术方案和效果，但并不因此限定本发明的技术方案和效果。
1.构建体内生物反应器选用美国Deltec公司大容量灌注泵DeltecR300 & Micro 3100作为体外动力泵系统中的输入泵系统。
选用美国Tyko公司REDON临床可携带引流系统作为体外动力泵系统中的输出泵系统。
选用美国Deltec公司CliniCathR PolyFlowR单管腔聚亚安酯导管作为体内导管系统。一端埋入已植入患者体内的组织工程骨替代品内部，另一端与埋藏在皮下的美国Deltec公司可植入导入系统PORT-A-CATH相连。
美国Deltec公司的可植入导入系统连接针头PORT-A-CATH Needles，将体外动力泵系统与体内导管系统相连。
2、构建组织工程化骨按已知方法提取并在体外扩增骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cellsMSCs)，制成种子细胞；(LangeC，Schroeder J.High-potential humanmesenchymal stem cells.Stem Cell Dev.2005 Feb；14(1)70-80)按图(1)所示构建组织工程化骨支架材料。该支架由可降解材料构成，模拟正常人骨结构，外层材料孔隙率较小，因此刚性较大近似于骨皮质，内层材料孔隙率较大，刚性小，但有利于种子细胞黏附生长，模拟正常松质骨特征，在内部松质骨区为体内导管系统预留管状空间。
按文献所述方法接种种子细胞至可降解支架材料，构建组织工程化骨替代品。(Takahashi Y，Yamamoto M.Osteogenic differentia-tion of mesenchymal stemcells in biodegradable sponges composed of gelatin and beta-tricalciumphosphate.Biomaterials.2005 Jun；26(17)3587-96)3、将输入导管系统和输出导管系统一端分别插入组织工程化骨替代品内部，另一端游离。
按文献所述方法植入组织工程化骨替代品。将输入导管系统和输出导管系统游离端与可植入导入系统PORT-A-CATH(美国Deltec公司)连接埋藏皮下。(WarnkePH，Springer IN.The mechanical integrity of in vivo engineered heterotopicbone.Biomaterials.2005 Aug 22)通过可植入导入系统连接针头PORT-A-CATH Needles(美国Deltec公司)将输入导管系统和输出导管系统连接至输入泵系统和输出泵系统。
将培养液DMEM，其内含有受体自体血清，种子细胞，骨形成蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cellgrowth factor，VEGF)，成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，通过输入泵系统经输入导管系统持续泵入体内组织工程化骨替代品。其中各生长因子浓度根据实际需要调整。
体内组织工程化骨替代品内含有细胞代谢产物，及支架材料降解产物的废液经输出导管系统由输出泵系统持续泵出。
三个月后，组织工程化骨替代品再血管化基本完成，可停止体外动力泵系统，小切口取出可植入导入系统PORT-A-CATH并拔出体内导管系统。
权利要求
1.一种体内生物反应器，其特征在于由体外动力泵系统和体内导管系统组成，所述的体外动力泵系统包括输入泵系统和输出泵系统，所述的体内导管系统包含输入导管系统和输出导管系统，上述输入或输出导管的一端分别插入到组织工程组织器官替代品的内部，另一端与对应的输入泵或输出泵动力泵系统连接。
2.根据权利要求1所述的体内生物反应器，其特征是所述的输入泵系统选用临床应用的各类输液泵系统，包括美国Deltec公司的大容量灌注泵DeltecR300 & Micro 3100；美国Baxter公司的Volumetric Infusion Pump；美国B.Braun公司的Vista Basic Infusion Pump和美国ArcomedicalInfusion Ltd.公司的VP系列Infusion Pump。
3.根据权利要求1所述的体内生物反应器，其特征是所述的输出泵系统是REDON临床可携带引流系统。
4.根据权利要求1所述的体内生物反应器，其特征是所述的体内导管系统与埋藏在皮下的可植入导入系统相连接。
5.根据权利要求1或2或4所述的体内生物反应器，其特征是所述的输入泵系统通过各类可植入导入系统连接针头，与埋藏在皮下的可植入导入系统连接，从而与体内输入导管系统相连通。
6.根据权利要求1或2或4所述的体内生物反应器，其特征是所述的输出泵系统通过各类可植入导入系统连接针头，与埋藏在皮下的可植入导入系统连接，从而与体内输出导管系统相连通。
7.根据权利要求1所述的体内生物反应器，其特征是所述的组织工程化器官替代品是组织工程化骨，组织工程化气管，组织工程化食道，组织工程化肝脏或组织工程化膀胱。
全文摘要
本发明属生物医学工程领域，涉及一种体内生物反应器及其应用。所述的体内生物反应器由体外动力泵系统和体内导管系统组成。本发明利用体内生物反应器泵入包含受体自体血清，各类种子细胞，各类生长因子的细胞培养液，用以维持组织工程化组织器官替代品体内植入早期营养，更新种子细胞，诱导种子细胞定向分化，并促进其再血管化。本发明将既往组织工程治疗方案中完全分离的两大步骤有机的结合起来。解决了快速血管化的难题，使组织工程化组织器官大规模临床应用成为可能。
文档编号A61B17/00GK1947666SQ20051003043
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者谭强 申请人:谭强