抑制人RabJ基因表达的siRNA及其应用的制作方法

专利名称：抑制人RabJ基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及一种针对癌基因RabJ的表达及功能的干扰RNA核苷酸序列，该干扰RNA核苷酸序列具有靶向性抗肿瘤细胞RabJ基因表达及功能、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞的致瘤性和促进肿瘤细胞凋亡的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该干扰RNA核苷酸序列的药物组合物，并公开了将该干扰RNA药物在肿瘤治疗中的用途，特别是在过表达RabJ的恶性肿瘤治疗中的用途。
背景技术：
小G蛋白(small G proteins)是指分子量约20-30kDa的单亚基G蛋白1-5。目前随着人类基因组计划的完成，该类蛋白质的成员已经发现有一百多种，其共有的特征是可以结合三磷酸鸟苷(GTP)和二磷酸鸟苷(GDP)，并且能够水解GTPγ位磷酸成为6DP(即GTP酶活性，GTPase activity)(Wittinghofer和Pai，Trends Biochem Sci.1991，16382-387；Polakis和McCormick，J Biol Chem.1993，2689157-9160；Moodie等，Oncogene.1995，11447-454；Marshall，Trends Biochem Sci.1993，18250-254)。小G蛋白在调控细胞生长、增殖、分化、迁移，以及细胞内蛋白转运等基础生命活动中发挥非常重要的作用。
小G蛋白的功能异常可以引起众多的病理现象和疾病的发生，其中Ras和肿瘤发生以及其在细胞增殖调控中的作用尤为受到关注。在几乎所有类型的肿瘤细胞或者肿瘤组织中，都有H-Ras、K-Ras或者N-Ras基因的突变，而且在肿瘤发生突变的基因中，Ras突变的几率最高(Bos，Cancer Res.1989；494682-4689)。
Rab(大鼠脑Ras样蛋白，Ras-like protein in rat brain)是一类属于Ras超家族的小分子量GTPase，其基本生化特征是可以结合GTP/GDP并水解GTP(Simons和Zerial，Neuron.1993，11789-799；Takai等，Physiol Rev.2001，81153-208；Martinez和Goud，Biochim Biophys Acta.1998；1404101-112；Stenmark和Olkkonen，Genome Biol.2001，2REVIEWS3007)。Rab蛋白及其调控蛋白和效应蛋白的异常也可以引起疾病的发生，如某些出血和色素沉着异常的疾病(Griscelli综合征)、抑郁症、Charcot-Marie-Tooth神经症、肾脏疾病(肾小管硬化)、失明(无脉络膜症)等疾病均与Rab相关蛋白的功能异常相关；在血管、肺、甲状腺疾病的某些病理过程中往往伴随Rab蛋白的高表达(Seabra等，Trends Mol Med.2002，823-30)。
在Griscelli综合征(一种由色素转运异常引起的伴随色素沉着和T淋巴细胞杀伤功能异常的疾病)的研究中发现，Rab27a的突变是该疾病发生的遗传学病因(Menasche等，Blood.2003，1012736-2742；Bahadoran等，J BiolChem.2003；27811386-11392；Barral等，J Clin Invest.2002，110247-257)。Rab7蛋白的异常可以造成脂蛋白的代谢异常，引起高脂血症和血管性疾病；一些胞内细菌，如结核杆菌，可以通过抑制Rab7的功能达到感染宿主和致病的目的(Runz等，J Neurosci.2002，221679-1689；Kim等，Biochem Biophys Res Commun.2000，293375-382；Choudhury等，J ClinInvest.2002，1091541-1550；Via等，J Biol Chem.1997，27213326-13331；Clemens等，Infect Immun.2000，685154-5166；Rupper等，J Cell Sci.2001，1142449-2460)。
早先的研究认为，Rab蛋白与肿瘤发生的关系不是很密切，但是目前的研究提示Rab蛋白可能参与肿瘤的发生。首先，在某些肿瘤细胞或肿瘤类型中发现有Rab蛋白的表达异常。Rab25在前列腺癌中表达比较高，而且其表达水平与前列腺癌的分化、临床分期等密切相关(He等，Gene Expr.2002，10231-242)；Rab38在黑色素瘤细胞系内的表达也明显升高(Jager等，CancerRes.2000，603584-3591；Loftus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000，994471-4476)；Rab3在垂体腺癌中的表达也很高(Culine等，Cancer.1992，702552-2556)；在造血系肿瘤和实体瘤病人外周血单个核细胞中，Rab2的表达明显增高；在小鼠肾上腺癌和小鼠肺癌中，Rab2的表达也表现为异常(Culine等，Cancer Res.1992，523083-3088)。其次，在肿瘤中发现有Rab基因的缺失突变。在恶性横纹肌肉瘤中发现有染色体1622q11.2区域的缺失，该区域包含Rab36的编码区(Mori等，Biochem Biophys Res Commun.1999，254594-600；Zhou等，Gene.2000，241133-141)。另外，在肿瘤中也有Rab调控蛋白的异常。在神经母细胞瘤和造血系肿瘤中，一个Rab蛋白的调控蛋白RabGDI的表达升高明显。PRC17(前列腺癌基因17，prostate cancer gene 17)是一个RabGTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)，它可调控Rab5蛋白的GTP水解，其在前列腺癌中的表达增高，从而影响肿瘤的生长特性(Pei等，CancerRes.2002，625420-5424)。
人RabJ是来源于健康成年人外周血单核细胞来源的树突状细胞一个新的小G蛋白家族成员，其特征是在其蛋白质组成中包含三类功能域N端(1-18氨基酸)和中间(210-216氨基酸)的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)、中间的Rab样功能域(19-209氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并与Ras家族分子有较高同源性。三类功能域分别介导RabJ的核定位；与细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)激酶(ERK kinase，MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的P85亚基、P53亚基相互作用；与HSC70和Raf(Ras相关因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核苷酸序列和氨基酸序列以及制法公开于中国专利申请CN01126826.3中。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它采用与目的基因同源的21-23核苷酸长的干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)转染至靶细胞，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体(RISC)，RISC以siRNA为模板特异的识别其同源基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，细胞表现特定基因的缺陷表型。该策略可以将癌症基因关闭，而仅有一个碱基突变则丧失RNA干扰作用，对正常细胞影响甚微，特异性强。
在目前的技术领域中，以下列出的几种基因序列的给药方法，均可用于干扰RNA的给药1.直接裸DNA注射法(1)新喷气注射系统释放裸DNA治疗序列，可以采用一种新的喷气注射系统，将裸DNA释放到体内的肺肿瘤中。沃尔瑟(W.Walter)博士和同事开发了一种便携的“高速喷气注射器”系统，在病毒媒介和脂质体基因释放系统之外提供了又一选择。研究者使用这种系统注射3段裸DNA到小鼠的Lewis肺肿瘤中，第一个质粒表达β-半乳糖激酶基因(LacZ)，第二个表达绿荧光(GFP)基因，第三个表达人类肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。每个小鼠都接受5次注射，压力为3Pa，释放3～5微升质粒DNA。沃尔瑟博士等在《基因治疗》(Gene Therpapy)报告说，注射后肿瘤上的基因呈广泛表达。LacZ和GFP基因表达在注射后48小时变得明显，在72～96小时达到峰值；LacZ表达和TNF-α分泌在24～120小时出现。他们认为，“这些发现证明了喷气注射的适用性，即在体内传送基因到肿瘤时使用最小剂量的裸DNA进行癌症基因治疗。”；(2)裸DNA直接注射将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内、瘤体内。这种方法简单易行；2.脂质体包裹DNA直接注射法包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径同裸DNA直接注射；3.金包被DNA基因枪轰击法将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞；4.繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转为细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放质粒DNA。即可口服的减毒沙门氏菌；5.复制缺陷腺病毒携带目的DNA法选择一种容易进入某组织器官的复制缺陷型腺病毒，携带目的RNA干扰序列，可以通过肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内、瘤体内等途径在宿主体内表达目的RNA干扰序列。
近年来，虽然在临床试验及应用中，RNA干扰在治疗某些肿瘤和病毒性感染方面取得了一些进展，但是所取得的结果尚不十分令人满意。因此，本领域迫切需要进一步开发特异性、高效性、可有效抑制肿瘤的RNA干扰药物。

发明内容
本发明所要解决的技术问题正是提供一种抗肿瘤的siRNA，所述的siRNA特异性地在mRNA水平靶向癌基因样分子RabJ基因，对表达RabJ的肿瘤细胞的生物学行为进行干预，从而有效抑制RabJ的表达，达到抗肿瘤效果。
在本发明的第一方面中，提供了一种针对带有J功能域的人Rab GTP酶RabJ的小分子干扰RNA，所述的小分子干扰RNA与人RabJ基因mRNA反向互补，其长度为16-30bp，且所述的小分子干扰RNA可使HeLa细胞的生长降低50％以上。
更佳的，所述的小分子干扰RNA的长度为18-25bp。
在另一优选例中，所述的小分子干扰RNA结合于RabJ的以下区域的对应的核苷酸序列核定位信号、Rab功能域、J功能域、或其组合。
在另一优选例中，所述的小分子干扰RNA含有选自SEQ ID NO1或SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
较佳的，所述的小分子干扰RNA选自下组si-RabJ15’-GAUUCGUGUCUAAAUACCU-3’3’-CUAAGCACAGAUUUAUGGA-5’；si-RabJ25’-UAGCAGUGCUAGUUUCACC-3’3’-AUCGUCACGAUCAAAGUGG-5’。
更佳的，所述小分子干扰RNA的3’端还含有2-4个dT或含有2-6个U的延伸结构。
本发明的第二方面涉及一种组合物，其含有0.001-99.99wt％如前所述的小分子干扰RNA以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
较佳地，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的第三方面中，提供了如前所述的小分子干扰RNA的用途，所述小分子干扰RNA用于制备抑制肿瘤细胞生长组合物或治疗肿瘤的药物组合物。更佳地，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达RabJ蛋白，并且选自下组子宫颈癌、乳腺癌、结肠癌。


图1RabJ siRNA干扰RabJ表达后，RabJ在mRNA及蛋白水平的表达分析，图中，mock为仅仅加入转染试剂的阴性对照；图2RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞的生长抑制；图3RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞细胞周期进程的抑制，图中，U0126是一种已经进入临床的能够抑制肿瘤细胞周期进程的抗肿瘤药物，作为阳性对照(购买自Sigma公司)；图4RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞体外致瘤性的抑制；图5RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞体内致瘤性的抑制。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现肿瘤细胞内RabJ的表达往往升高，抑制RabJ的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤活性。本发明人还进一步合成和测试了多种RabJ的siRNA，筛选出了可强烈抑制RabJ的表达进而抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤性的siRNA序列。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人的研究表明，RabJ在睾丸组织中主要分布于初级和次级精母细胞(spermatocyte)、早期精子细胞中(spermatids)，在间质细胞和支持细胞中无表达，与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D1在小鼠睾丸中的表达模式类似，提示RabJ可能与细胞周期调控相关。
在NIH3T3细胞系内，RabJ的过表达可以促进细胞周期蛋白表达、促进细胞增殖、推动细胞周期进程，且可促进该细胞系在软琼脂上形成克隆，并在裸鼠体内也可以形成成纤维肉瘤，提示其可能是一个癌基因样的小G蛋白。
本发明的研究还发现，在肿瘤细胞内RabJ的表达往往升高，抑制RabJ的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤活性。由于RabJ可以和多种蛋白形成复合体，因此用激酶抑制剂抑制各个激酶的活性，发现MEK/ERK抑制剂可以完全抑制RabJ的体外致瘤能力，提示ERK1/2依赖的信号传导机制可能是RabJ的致瘤机理。
共聚焦显微镜的试验结果还提示，RabJ是一个MEK1/2的核锚着蛋白，通过增加细胞核的磷酸化MEK1/2的水平，在胞核局部形成ERK1/2的持续活化，引起肿瘤的发生。
因此，本发明人的研究表明，RabJ在细胞周期调控、细胞增殖、肿瘤发生等过程中发挥重要的作用，其机理可能是通过核锚着磷酸化的MEK1/2促进ERK1/2介导的效应，促进细胞增殖和肿瘤的发生。因此，RabJ是一个癌基因样的小G蛋白，在临床肿瘤的诊断和治疗中可作为潜在的候选靶标。
活性成分在本发明中，活性成分是RabJ的siRNA序列。如本文所用，术语“活性成分”指这样的RabJ的siRNA序列所述的siRNA与人RabJ基因mRNA反向互补，其长度通常为16-30bp，更佳地为18-25bp，且所述的siRNA可使HeLa细胞的生长降低50％以上。
RabJ的cDNA序列如SEQ ID NO9所示，编码RabJ蛋白质(如SEQ ID NO10所示)。SEQ ID NO9全长为1787bp，包括24bp的5’端非编码区和316bp的3’端非编码区，编码含273个氨基酸的多肽。
如本文所用，“RabJ的siRNA”是指与RabJ基因同源的小片段干扰RNA，其长度通常为16-30bp，更佳地为18-25bp。siRNA可转染至肿瘤细胞中，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体(RISC)，RISC以该siRNA为模板特异的识别RabJ基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，使肿瘤细胞表现RabJ基因的缺陷表型，从而抑制肿瘤细胞和肿瘤的生长。
针对癌基因进行特定基因沉默时肿瘤治疗的热点之一，RNA干扰技术是目前高特异性的有效技术，因此无论是在功能基因组研究，还是肿瘤地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。本发明人根据已知的siRNA设计原则(如Cenix等人的设计原则)，针对RabJ基因不同靶位点设计了多条siRNA。其中，2条干扰siRNA序列(si-RabJ1和si-RabJ2)可有效地抑制癌基因样分子RabJ的表达。这证实RabJ的siRNA可望成为治疗肿瘤的有效手段。本发明的siRNA可以单独使用或几条siRNA联合，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于恶性肿瘤的治疗。
本发明所选用的RNA干扰序列si-RabJ1和si-RabJ2可以通过直接的化学合成、体外转录、质粒扩增、病毒复制等方式获得，因此本发明应包括包含该序列的前述应用形式。
本发明的RabJ的siRNA序列能有效封闭RabJ基因，从而抑制肿瘤细胞的增殖。具体地，本发明的RabJsiRNA序列在mRNA水平针对RabJ基因，对阳性表达RabJ的肿瘤细胞的生物学行为进行逆转。实验证明(1)抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞的增殖；(2)体内抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞的体外致瘤性；(3)抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞体内的生长；(4)抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞周期进程。
药物组合物及给药方法本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99wt％)的本发明的RabJ的siRNA序列以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。
使用药物组合物时，是将安全有效量的RabJ的siRNA序列施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
在制各药物组合物时，通常，可将这些本发明的siRNA序列配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
优选的本发明的siRNA序列药物的给药方式包括但不限于(1)直接裸DNA注射法，如利用喷气注射系统释放裸DNA治疗序列、裸DNA直接注射；(2)脂质体包裹DNA直接注射法；(3)金包被DNA基因枪轰击法；(4)繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法；(5)复制缺陷腺病毒携带目的DNA法。
此外，本发明的siRNA序列可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如TNF-α、TGF-β、IFN-α、Angiostatin、Endostatin、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。
本发明的主要优点在于(a)本发明针对RabJ基因不同靶位点所设计的siRNA序列，可有效抑制癌基因样分子RabJ的表达，从而用于癌症治疗；(b)本发明的siRNA序列可以单独使用或几个siRNA序列联合，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于恶性肿瘤的治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCo1d Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法(a)siRNARabJ的siRNA序列如下所示si-RabJ15’-GAUUCGUGUCUAAAUACCU-3’3’-CUAAGCACAGAUUUAUGGA-5’(+119-+137位)(SEQ ID NO1)；Si-RabJ25’-UAGCAGUGCUAGUUUCACC-3’3’-AUCGUCACGAUCAAAGUGG-5’(+588-+606位)(SEQ ID N02)。
RabJ的siRNA序列的突变阴性对照序列如下所示Scon si-RabJl (SEQ ID NO3)(+119-+137序列阴性对照)；Scon si-RabJ 3’-AUCCUCACGAUCAUAGUGG-5’(SEQ ID NO4)(+588-+606序列阴性对照)。
所有siRNA序列均由上海吉凯生物工程公司合成。
(b)细胞系HeLa细胞系ATCCCCL-2(购自ATCC)，这是一种阳性表达RabJ的宫颈癌肿瘤细胞系。
MCF-7细胞系ATCCHTB-22(购自ATCC)，这是一种阳性表达RabJ的乳腺癌肿瘤细胞系。
SW480细胞系ATCCCCL-28(购自ATCC)，这是一种阳性表达RabJ的结肠癌肿瘤细胞系。
细胞的培养和处理方法如下将细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培养液中，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。优化转染条件，分别以200nmol的终浓度将si-RabJ1(SEQ ID NO1)、si-RabJ2(SEQ ID NO2)、Scon si-RabJ1(SEQID NO3)和Scon si-RabJ2(SEQ ID NO4)加入细胞培养液，于孵育24～48h后收获细胞进行检测。
实施例1RabJ siRNA干扰RabJ表达后RabJ在mRNA及蛋白水平的表达分析分别将si-RabJ1(SEQ ID NO1)、si-RabJ2(SEQ ID NO2)、突变阴性对照Scon si-RabJ1(SEQ ID NO3)和Scon si-RabJ2(SEQ ID NO4)以转染试剂lipofectAMINE(Invitrogen公司)瞬时转染HeLa、MCF-7、SW480细胞，48h后收取细胞进行检测。
本实施例从mRNA和蛋白质水平二个层次来检测si-RabJ1和si-RabJ2对癌基因样分子RabJ基因表达的抑制。
(a)RT-PCR和PCR产物定量分析法检测mRNA(1)RT-PCR按TRIzol总RNA提抽试剂盒提取总RNA。电泳鉴定RNA的质量，紫外光分光光度计定量。取总RNA2.5μg，加入50μl逆转录反应体系，用SuperScriptTMII逆转录置试剂盒(购自于Invitrogen公司)，按说明书操作进行逆转录。
(2)PCR扩增PCR反应体系按常规(试剂购自Invitrogen公司)。
RabJ引物15’-ATG CCG AAG AGG AAG GAG CCC-3’(SEQ ID NO5)；RabJ引物25’-GTT TCA CCA AAG AAC AAG CAG-3’(SEQ ID NO6)。
β-actin引物15’-GCATCGTGATGGACTCCG-3’(SEQ ID NO7)；β-actin引物25’-TCGGAAGGTGGACAGCGA-3’(SEQ ID NO8)。
以上序列均由上海生工生物工程公司合成。
循环条件94℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后延伸10分钟。另以β-actin的扩增产物为内参对照。
(3)PCR产物定量取10μl的扩增产物在15g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，以PCR mark(华美公司)作为分子质量标准，电压100V，20分钟。溴化乙锭染色，紫外反射仪上显象、照相。用扫描分析进行目的基因的半定量(以RabJ/β-actin cDNA的比值反映RabJ mRNA的表达水平)。
(b)Western blot技术检测RabJ蛋白表达的表达水平收集48h的各组细胞，制备细胞裂解液，用RabJ多抗(按CN01126826.3中实施例6的方法制备)进行Western blot检测。也可以采用免疫荧光标记和免疫组织化学技术等方法检测RabJ蛋白水平的表达。
结果结果显示，细胞经siRNA处理48h后检测，与阴性对照组相比，si-RabJ1和si-RabJ2组的RabJ mRNA和蛋白表达明显下降，表明si-RabJ1和si-RabJ2转染成功阻抑了RabJ的表达，而阴性对照siRNA寡核苷酸(Scon si-RabJ1和Scon si-RabJ2)对RabJ的表达没有影响(见图1)。
实施例2RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞生长的抑制本实施例采用了[3H]-胸腺嘧啶掺入法。
将实施例1中所述RabJ siRNA转染的HeLa、MCF-7、SW480细胞以5×104个细胞/孔接种于24孔培养板(Falcon公司)中，每种细胞接种三个孔。培养6h后，在无血清培养基中继续培养24-48h，在最后4h，每孔加入0.5μCi(1Ci＝37GBq)的[3H]-胸腺嘧啶(Amersham公司)。然后，用PBS洗三遍，细胞溶于含1％Triton X-100的PBS中，用玻璃纤维滤膜收集，放射性用液闪仪进行测定。或者在血清饥饿24h后，加入含10％FCS的正常培养基，继续培养24h，最后4h加入[3H]-胸腺嘧啶，然后进行放射测定。
结果显示，RabJ siRNA能够明显抑制HeLa、MCF-7、SW480肿瘤细胞体外的生长能力，而阴性对照siRNA寡核苷酸(Scon si-RabJ1和Scon si-RabJ2)对细胞生长没有影响。其中，对HeLa、MCF-7、SW480细胞的抑制效果见图2。
实施例3RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞细胞周期进程的抑制本实施例采用了碘化丙锭(PI)标记DNA含量的检测方法。
将实施例1中所述RabJ siRNA转染的HeLa、MCF-7、SW480细胞(5×106)用0.25％胰酶进行消化后用PBS洗两遍，缓慢加入70％冰乙醇，4℃固定过夜。1,000g离心，收集细胞，用含1％BSA、10％FCS的PBS洗一遍并重悬细胞。加入50μg/mlPI和100mg/ml RNA酶A，37℃标记30min，在流式细胞仪(FACS，BectonDickinson公司)上监测并用CELLQUEST软件进行分析，细胞在各周期的分布用百分数表示。
结果显示，RabJ siRNA能够明显抑制HeLa、MCF-7、SW480细胞肿瘤细胞体外的细胞周期进程，而阴性对照siRNA寡核苷酸(Scon si-RabJ)对细胞周期进程没有影响。RabJ siRNA1对HeLa、MCF-7细胞的细胞周期进程的影响如图3所示。
实施例4RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞体外致瘤性的抑制本实施例采用了软琼脂克隆形成法。
为了检测细胞接触非依赖生长的能力，将实施例1中所述RabJ siRNA转染的HeLa、MCF-7、SW480细胞(5×104)混悬于0.5％软琼脂，铺于底层含1％软琼脂的6孔板中。培养3周后，光镜下观察，多于50个细胞的克隆记为阳性。
结果显示，RabJ siRNA能够明显抑制HeLa、MCF-7、SW480肿瘤细胞体外致瘤性，而阴性对照siRNA寡核苷酸(Scon si-RabJ1和Scon si-RabJ2)对肿瘤细胞致瘤性没有影响(见图4)。
实施例5RabJ siRNA干扰RabJ表达后，对肿瘤细胞体内致瘤性的抑制将实施例1中所述RabJ siRNA转染以及si-RabJ1和si-RabJ2联用(终浓度各为200nmol)转染的HeLa、MCF-7、SW480(1×106)皮下注射到Balb/C裸鼠(除联用组为2只外，其余各组均为5只/组，购自上海必凯实验动物公司)的右下侧腹部，然后观察六周，计算肿瘤的发生率(出现肿瘤的小鼠个数/注射细胞的裸鼠个数)。
结果显示，RabJ siRNA能够明显抑制HeLa、MCF-7、SW480肿瘤细胞在动物体内的致瘤性，而阴性对照siRNA寡核苷酸(Scon si-RabJ1和Scon si-RabJ2)对肿瘤细胞体内致瘤性没有影响。其中，RabJ siRNA对HeLa、SW480细胞的体内致瘤性的影响如图5所示。
此外，联用si-RabJ1和si-RabJ2后，HeLa、MCF-7、SW480肿瘤细胞在动物体内的致瘤性受抑制程度高于单用si-RabJ1或si-RabJ2，这表明联用RabJ的siRNA可获得更好的抑制效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>抑制人RabJ基因表达的siRNA及其应用<130>057873<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>RNA<213>寡核苷酸<400>1gauucguguc uaaauaccu 19<210>2<211>19<212>RNA<213>寡核苷酸<400>2uagcagugcu aguuucacc 19<210>3<211>19<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3gauacguguc uauataccu 19<210>4<211>19<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4uaggagugcu aguaucacc 19<210>5
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<221>CDS<222>(25)..(843)<223>
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权利要求
1.一种针对带有J功能域的人Rab GTP酶RabJ的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA与人RabJ基因mRNA反向互补，其长度为16-30bp，且所述的小分子干扰RNA可使HeLa细胞的生长降低50％以上。
2.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA的长度为18-25bp。
3.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA结合于RabJ的以下区域的对应的核苷酸序列核定位信号、Rab功能域、J功能域、或其组合。
4.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA含有选自SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA选自下组si-RabJ15’-GAUUCGUGUCUAAAUACCU-3’3’-CUAAGCACAGAUUUAUGGA-5’；si-RabJ25’-UAGCAGUGCUAGUUUCACC-3’3’-AUCGUCACGAUCAAAGUGG-5’。
6.根据权利要求1-5中任一所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA的3’端还含有2-4个dT或含有2-6个U的延伸结构。
7.一种组合物，其特征在于，其含有0.001-99.99wt％权利要求1-6中任一项所述的小分子干扰RNA以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.权利要求1所述的小分子干扰RNA的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤细胞生长组合物或治疗肿瘤的药物组合物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达RabJ蛋白，并且选自下组子宫颈癌、乳腺癌、结肠癌。
全文摘要
本发明涉及一种针对癌基因样分子RabJ的干扰RNA核苷酸序列。具体而言，本发明涉及一种针对癌基因样分子RabJ的表达及功能的干扰RNA核苷酸序列，该干扰RNA核苷酸序列具有靶向性抗肿瘤细胞RabJ基因表达及功能、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞的致瘤性和促进肿瘤细胞凋亡的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该干扰RNA核苷酸序列的药物组合物，并公开了将该干扰RNA药物在肿瘤治疗中的用途，特别是在过表达RabJ的恶性肿瘤治疗中的用途。
文档编号A61P35/00GK1948483SQ200510030428
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者陈涛涌, 李楠, 万涛, 曹雪涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学