专利名称：抑制人RabJ基因表达的反义寡核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域。本发明涉及针对新型癌基因样分子RabJ的反义寡核苷酸。具体而言，本发明具体涉及一组针对癌基因样分子RabJ的表达及功能的反义寡核苷酸序列，该反义寡核苷酸序列具有靶向性抗肿瘤细胞RabJ基因表达及功能、抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤细胞致瘤性的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该反义寡核苷酸的药物组合物，并公开了将该反义寡核苷酸药物用于疾病治疗的方法，特别是在恶性肿瘤的治疗中的用途。
背景技术：
小G蛋白(small G proteins)是指分子量约20-30kDa的单亚基G蛋白1-5。目前随着人类基因组计划的完成，该类蛋白质的成员已经发现有一百多种，其共有的特征是可以结合三磷酸鸟苷(GTP)和二磷酸鸟苷(GDP)，并且能够水解GTPγ位磷酸成为GDP(即GTP酶活性，GTPase activity)(Wittinghofer和Pai，Trends Biochem Sci.1991，16382-387；Polakis和McCormick，J Biol Chem.1993，2689157-9160；Moodie等，Oncogene.1995，11447-454；Marshall，Trends Biochem Sci.1993，18250-254)。小G蛋白在调控细胞生长、增殖、分化、迁移，以及细胞内蛋白转运等基础生命活动中发挥非常重要的作用。
小G蛋白的功能异常可以引起众多的病理现象和疾病的发生，其中Ras和肿瘤发生以及其在细胞增殖调控中的作用尤为受到关注。在几乎所有类型的肿瘤细胞或者肿瘤组织中，都有H-Ras、K-Ras或者N-Ras基因的突变，而且在肿瘤发生突变的基因中，Ras突变的几率最高(Bos，Cancer Res.1989；494682-4689)。
Rab(大鼠脑Ras样蛋白，Ras-like protein in rat brain)是一类属于Ras超家族的小分子量GTPase，其基本生化特征是可以结合GTP/GDP并水解GTP(Simons和Zerial，Neuron.1993，11789-799；Takai等，Physiol Rev.2001，81153-208；Martinez和Goud，Biochim Biophys Acta.1998；1404101-112；Stenmark和Olkkonen，Genome Biol.2001，2REVIEWS3007)。Rab蛋白及其调控蛋白和效应蛋白的异常也可以引起疾病的发生，如某些出血和色素沉着异常的疾病(Griscelli综合征)、抑郁症、Charcot-Marie-Tooth神经症、肾脏疾病(肾小管硬化)、失明(无脉络膜症)等疾病均与Rab相关蛋白的功能异常相关；在血管、肺、甲状腺疾病的某些病理过程中往往伴随Rab蛋白的高表达(Seabra等，Trends Mol Med.2002，823-30)。
在Griscelli综合征(一种由色素转运异常引起的伴随色素沉着和T淋巴细胞杀伤功能异常的疾病)的研究中发现，Rab27a的突变是该疾病发生的遗传学病因(Menasche等，Blood.2003，1012736-2742；Bahadoran等，J BiolChem.2003；27811386-11392；Barral等，J Clin Inyest.2002，110247-257)。Rab7蛋白的异常可以造成脂蛋白的代谢异常，引起高脂血症和血管性疾病；一些胞内细菌，如结核杆菌，可以通过抑制Rab7的功能达到感染宿主和致病的目的(Runz等，J Neurosci.2002，221679-1689；Kim等，Biochem Biophys Res Commun.2000，293375-382；Choudhury等，J ClinInvest.2002，1091541-1550；Via等，J Biol Chem.1997，27213326-13331；Clemens等，Infect Immun.2000，685154-5166；Rupper等，J Cell Sci.2001，1142449-2460)。
早先的研究认为，Rab蛋白与肿瘤发生的关系不是很密切，但是目前的研究提示Rab蛋白可能参与肿瘤的发生。首先，在某些肿瘤细胞或肿瘤类型中发现有Rab蛋白的表达异常。Rab25在前列腺癌中表达比较高，而且其表达水平与前列腺癌的分化、临床分期等密切相关(He等，6ene Expr.2002，10231-242)；Rab38在黑色素瘤细胞系内的表达也明显升高(Jager等，CancerRes.2000，603584-3591；Loftus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000，994471-4476)；Rab3在垂体腺癌中的表达也很高(Culine等，Cancer.1992，702552-2556)；在造血系肿瘤和实体瘤病人外周血单个核细胞中，Rab2的表达明显增高；在小鼠肾上腺癌和小鼠肺癌中，Rab2的表达也表现为异常(Culine等，Cancer Res.1992，523083-3088)。其次，在肿瘤中发现有Rab基因的缺失突变。在恶性横纹肌肉瘤中发现有染色体1622q11.2区域的缺失，该区域包含Rab36的编码区(Mori等，Biochem Biophys Res Commun.1999，254594-600；Zhou等，Gene.2000，241133-141)。另外，在肿瘤中也有Rab调控蛋白的异常。在神经母细胞瘤和造血系肿瘤中，一个Rab蛋白的调控蛋白RabGDI的表达升高明显。PRC17(前列腺癌基因17，prostate cancer gene 17)是一个RabGTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)，它可调控Rab5蛋白的GTP水解，其在前列腺癌中的表达增高，从而影响肿瘤的生长特性(Pei等，Cancer Res.2002，625420-5424)。
人RabJ是来源于健康成年人外周血单核细胞来源的树突状细胞一个新的小G蛋白家族成员，其特征是在其蛋白质组成中包含三类功能域N端(1-18氨基酸)和中间(210-216氨基酸)的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)、中间的Rab样功能域(19-209氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并与Ras家族分子有较高同源性。三类功能域分别介导RabJ的核定位；与细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)激酶(ERK kinase，MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的P85亚基、P53亚基相互作用；与HSC70和Raf(Ras相关因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核苷酸序列和氨基酸序列以及制法公开于中国专利申请CN01126826.3中。
反义药物又称反义寡核苷酸药物，是指作为药物使用的，长度为10-30个碱基的人工合成DNA分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定的基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。蛋白质在人体代谢过程中扮演重要角色，大多数疾病都是由于蛋白质异常引起的，无论肿瘤、心血管疾病或传染性疾病，传统药物主要直接作用于致病蛋白质本身，而反义药物则作用于产生蛋白质的基因，因此可广泛应用于各种疾病的治疗，比传统药物更具选择性，而且具有高效低毒、用量少等特点。数年前，由于反义药物合成价格昂贵，使该类药物难以进行广泛的临床试验。近年来，由于合成技术的改进和合成仪器的研制成功，反义药物的成本已大为降低，从而加速了反义药物的研究与开发。
从药动学角度而言，由于体内各器官组织存在核酸酶，因此天然的寡核苷酸进入体内极易被分解失活，故反义药物多以修饰寡核苷酸为主，以增强其抗核酸酶降解的作用。寡核苷酸的修饰方法有多种，常用硫代寡核苷酸，因为此类反义药物具有良好的水溶性，易大量合成，能满足临床所需。采用皮下、肌肉和静脉注射方法给药，除脑组织外，硫代寡核苷酸可分布于各器官和组织中，其能与血浆蛋白结合，但亲和力较低，主要从尿中排出。
反义基因治疗依据碱基互补原理，应用能与目的基因或其mRNA互补的核酸，通过空间阻遏作用，诱导RNA酶H(RNase H)活性或与目的DNA双股螺旋形成三聚体(triple helix)，在基因复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译水平上，抑制蛋白质合成的特性、抑制癌基因的表达、抑制生长因子的分泌或封闭其受体，从而阻断癌细胞内的异常信号传导及自分泌和旁分泌环路，使癌细胞进入正常化轨道或引起癌细胞凋亡。
反义核酸包括反义核糖核酸(antisence RNA)、核糖酶(ribozyme)和反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，AONs)三类。通过对反义寡核苷酸药物的开发和研究，目前已有17种反义寡核苷酸药物进入临床试验。其中Vitravene是1998年经FDA批准进入市场的反义药物，其分子结构的两端有一个修饰帽，从而增强了其稳定性。该药物抗病毒作用较强，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病并发巨细胞视网膜炎。不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
为使AON顺利进入靶细胞发挥治疗作用，靶向性转运至关重要。直接注射存在诸多问题，如AON易降解、细胞摄取率不高、非特异性结合降低AON的药效以及对mRNA的非特异性阻断等。为此，人们试用以下方法改善靶向性转运(1)将AON与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(2)将AON与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(3)用脂质体包裹AON后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(4)将AON与胆固醇结合，使其胞浆保持时间增加10倍；(5)用免疫脂质体转运AON可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(6)将AON体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将AON载入靶细胞内；(7)电打孔(electroporation)，即借助于电流将AON导入靶细胞。
近年来，虽然在临床试验还是应用中，反义药物在治疗某些肿瘤和病毒性感染方面取得了一些进展，但是所取得的结果尚不十分令人满意。因此，本领域迫切需要进一步开发可有效抑制肿瘤的反义药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可有效抑制肿瘤的反义寡核苷酸，所述的反义特异性地在mRNA水平靶向癌基因样分子RabJ基因，对表达RabJ的肿瘤细胞的生物学行为进行干预，从而有效抑制RabJ的表达，达到抗肿瘤效果。
在本发明的第一方面中，提供了一种反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸与人RabJ基因mRNA反向互补，其长度为18-25bp，并且所述的反义寡核苷酸可使HeLa细胞的生长降低50％以上。
在另一优选例中，所述的反义寡核苷酸结合于RabJ的以下区域的对应的核苷酸序列核定位信号、Rab功能域、J功能域、或其组合。
在另一优选例中，所述的反义寡核苷酸含有选自SEQ ID NO5-8所示的核苷酸序列。
更佳地，所述的反义寡核苷酸选自下组AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’。
在另一优选例中，所述的反义寡核苷酸中具有经修饰的核苷酸，所述的修饰方式选自下组硫代修饰、甲基化修饰、磷酸硫代修饰、或其组合。
在另一优选例中，所述的经修饰的核苷酸是全链经磷酸硫代修饰的核苷酸。
本发明的第二方面，还涉及一种组合物，其含有0.001-99.99wt％如前所述的反义寡核苷酸以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
较佳地，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的第三方面，提供了如前所述的反义寡核苷酸的用途，它被用于制备抑制肿瘤细胞生长组合物或治疗肿瘤的药物组合物。更佳地，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达RabJ蛋白，并且选自下组子宫颈癌、乳腺癌、结肠癌。
图1RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后，RabJ在mRNA水平的表达分析；图2RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后，RabJ在蛋白水平的表达分析；图3RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后，其对肿瘤细胞生长的抑制；图4RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后，其对肿瘤细胞体外致瘤活性的抑制；图5瘤体内注射RabJ反义寡核苷酸后，其对体内肿瘤细胞生长的抑制；图6瘤体内注射RabJ反义寡核苷酸后，其对肿瘤细胞分化的促进。图6A为野生型HeLa肿瘤；图6B为SON-RabJ1；图6C为SON-RabJ4；图6D-6F为AON-RabJ1；图6G-6I为AON-RabJ4。其中箭头表示纤维状结缔组织插入；小星号表示鳞状分化；大星号表示坏死区域；花型图案表示空泡状结构。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现肿瘤细胞内RabJ的表达往往升高，抑制RabJ的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤活性。本发明人还进一步合成和测试了多种RabJ的反义寡核苷酸，筛选出了可强烈抑制RabJ的表达进而抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤性的反义序列。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人的研究表明，RabJ在睾丸组织中主要分布于初级和次级精母细胞(spermatocyte)、早期精子细胞中(spermatids)，在间质细胞和支持细胞中无表达，与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D1在小鼠睾丸中的表达模式类似，提示RabJ可能与细胞周期调控相关。
在NIH3T3细胞系内，RabJ的过表达可以促进细胞周期蛋白表达、促进细胞增殖、推动细胞周期进展，且可促进该细胞系在软琼脂上形成克隆，并在裸鼠体内也可以形成成纤维肉瘤，提示其可能是一个癌基因样的小G蛋白。
本发明的研究还发现，在肿瘤细胞内RabJ的表达往往升高，抑制RabJ的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤活性。由于RabJ可以和多种蛋白形成复合体，因此用激酶抑制剂抑制各个激酶的活性，发现MEK/ERK抑制剂可以完全抑制RabJ的体外致瘤能力，提示ERK1/2依赖的信号传导机制可能是RabJ的致瘤机理。
共聚焦显微镜的试验结果还提示，RabJ是一个MEK1/2的核锚着蛋白，通过增加细胞核的磷酸化MEK1/2的水平，在胞核局部形成ERK1/2的持续活化，引起肿瘤的发生。
因此，本发明人的研究表明，RabJ作为小G蛋白家族成员，在细胞周期调控、细胞增殖、肿瘤发生等过程中发挥重要的作用，其机理可能是通过核锚着磷酸化的MEK1/2促进ERK1/2介导的效应，促进细胞增殖和肿瘤的发生。因此，RabJ是一个癌基因样的小G蛋白，在临床肿瘤的诊断和治疗中可作为潜在的候选靶标。
活性成分在本发明中，活性成分是RabJ反义寡核苷酸。如本文所用，术语“活性成分”指这样的RabJ反义寡核苷酸所述的寡核苷酸与人RabJ基因mRNA反向互补，其长度宜为18-25bp，并且所述的反义寡核苷酸可使HeLa细胞的生长降低50％以上(如50％-90％或更高)。
RabJ的cDNA序列如SEQ ID NO19所示，编码RabJ蛋白质(如SEQ ID NO20所示)。SEQ ID NO19全长为1787bp，包括24bp的5’端非编码区和316bp的3’端非编码区，编码含273个氨基酸的多肽。
如本文所用，“反义寡核苷酸”指为反义的核苷酸寡聚物。反义寡核苷酸通过碱基互补(A-T，A-U和G-C)配对与双链DNA形成三链(反基因)，或与单链RNA形成杂交双链(反义)，从而阻断基因的复制、转录或转录后mRNA的加工和翻译。同时，双链RNA能被细胞内的核糖核酸酶H(RNase H)所降解，从而更有效地阻断靶基因的表达。由于反义核苷酸只能与反向互补的靶序列结合，具有专一性高，副作用小的特点。
优选的反义寡核苷酸结合于RabJ的以下区域的对应的核苷酸序列核定位信号(NLS，1-18位氨基酸)、Rab功能域(19-200位氨基酸)、J功能域(201-273位氨基酸)、或其组合。
在本发明的一个实施例中，所述的反义寡核苷酸选自下组AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’。
其中，AON-RabJ1和AON-RabJ2对应于RabJ核定位信号(NLS，1-18位氨基酸)；AON-RabJ3对应于RabJ的Rab功能域(19-200位氨基酸)；AON-RabJ4对应于RabJ的J功能域(201-273位氨基酸)。
核苷酸的各种修饰方式是本领域的熟练技术人员知晓的。通过核苷酸的修饰，可进一步提高反义寡核苷酸的稳定性和/或反义寡核苷酸药物的效率。因此本发明还包括包含各种的核苷酸修饰形式，代表性的修饰形式例子包括但不限于硫代修饰、甲基化修饰、磷酸硫代修饰、或其组合。
本发明的RabJ反义寡核苷酸能有效抑制RabJ的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。具体地，本发明的RabJ反义寡核苷酸在mRNA水平针对RabJ基因，对阳性表达RabJ的肿瘤细胞的生物学行为进行逆转。实验证明(1)抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞的增殖；(2)体内抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞的体外致瘤性；(3)抑制RabJ的表达可抑制肿瘤细胞体内的生长；(4)抑制RabJ的表达可促进肿瘤细胞发生分化。
药物组合物及给药方法本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99wt％)的本发明的RabJ反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。
使用药物组合物时，是将安全有效量的RabJ反义寡核苷酸施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的反义寡核苷酸配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
优选的本发明的反义寡核苷酸药物的给药途径包括但不限于(1)直接裸DNA注射法；(2)将AON与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接；(3)将AON与带正电荷的脂类形成复合物；(4)用脂质体包裹AON后介导进入细胞；(5)将AON与胆固醇结合；(6)用免疫脂质体转运AON；(7)将AON体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将AON导入靶细胞等。
此外，本发明的反义寡核苷酸可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如TNF-α、TGF-β、IFN-α、Angiostatin、Endostatin、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。
本发明的主要优点在于(a)本发明针对RabJ基因不同靶位点所设计的4个反义寡核苷酸序列，可有效抑制癌基因样分子RabJ的表达，从而用于癌症治疗；(b)本发明的反义寡核苷酸可以单独使用或几个反义寡核苷酸联合，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于恶性肿瘤的治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例通用方法和材料(a)寡核苷酸RabJ反义寡核苷酸的序列如下所示AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’(+7-+26)(SEQ ID NO5)；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’(+318-+337)(SEQ 1D No.6)；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’(+651-+670)(SEQ ID NO7)；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’(+788-+807)(SEQ ID NO8)。
作为阴性对照的寡核苷酸序列如下AON-RabJ1neg (+7-+26 AON序列阴性对照)(SEQ ID NO9)AON-RabJ2neg (+318-+337 AON序列阴性对照)(SEQ ID No.10)
AON-RabJ3neg (+651-+670 AON序列阴性对照)(SEQ ID NO11)AON-RabJ4neg (+788-+807 AON序列阴性对照)(SEQ ID NO12)(b)细胞系HeLa细胞系ATCCCCL-2(购自ATCC)，这是一种阳性表达RabJ的宫颈癌肿瘤细胞系。
MCF-7细胞系ATCCHTB-22(购自ATCC)，这是一种阳性表达RabJ的乳腺癌肿瘤细胞系。
SW480细胞系ATCCCCL-28(购自ATCC)，这是一种阳性表达RabJ的结肠癌肿瘤细胞系。
细胞的培养和处理方法如下细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培养液，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。分别将磷酸硫代修饰的SON-RabJ1(SEQID NO1)、SON-RabJ2(SEQ ID NO2)、SON-RabJ3(SEQ ID NO3)、SON-RabJ4(SEQID NO4)、AON-RabJ1(SEQ ID NO5)、AON-RabJ2(SEQ ID NO6)、AON-RabJ3(SEQID NO7)、AON-RabJ4(SEQ ID NO8)和相应的阴性对照AON-RabJ1neg(SEQ IDNO9)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO10)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO11)和AON-RabJneg(SEQ ID NO12)以1μmol的终浓度与LipofectAMINE(InvitroGen公司)加入细胞培养液，于孵育24-48h后收获细胞进行检测。
实施例1RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后RabJ在mRNA和蛋白水平的表达分析将磷酸硫代修饰的正向序列SON-RabJ1(SEQ ID NO1)、SON-RabJ2(SEQ IDNO2)、SON-RabJ3(SEQ ID NO3)、SON-RabJ4(SEQ ID NO4)、反义寡核苷酉麦AON-RabJ1(SEQ ID NO5)、AON-RabJ2(SEQ ID NO6)、AON-RabJ3(SEQ IDNO7)、AON-RabJ4(SEQ ID NO8)和相应的阴性对照AON-RabJ1neg(SEQ ID NO9)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO10)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO11)和AON-RabJneg(SEQ ID NO12)(由上海生工生物工程公司合成)，以1μmol的终浓度与转染试剂LipofectAMINE(Invitrogen公司)加入HeLa宫颈癌细胞培养液中，于孵育后24-48h收获细胞进行检测。
本实施例从mRNA和蛋白质水平二个层次来检测反义寡核苷酸对癌基因样分子RabJ基因表达的抑制。
(a)TaqMan定量RT-PCR方法检测mRNA方法如下(1)逆转录按TRIzol总RNA提抽试剂盒提取总RNA。电泳鉴定RNA的质量，并以紫外光分光光度计定量。取总RNA2.5μg，加入50μl逆转录反应体系，用SuperScriptTMII逆转录置试剂盒(购自于Invitrogen公司)，按说明书操作进行逆转录。
(2)PCR扩增PCR反应体系按常规(试剂购自Invitrogen公司)。
所使用的RabJ特异性引物为5’-GGA GTC AAA CCT GGG GCC TCA AG-3’(上游，SEQ ID NO13)和5’-CAG GAG GGC TGT CCG AGC ATT C-3’(下游，SEQ IDNO14)；所使用的RabJ特异性探针为5’FAM-GTA GCA CCT GGC AGT GAA GATG-3’TAMRA(SEQ ID NO15)；所使用的β-actin特异性引物为5’-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT AC6A-3’(上游，SEQ ID NO16)和5’-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3’(下游，SEQ ID NO17)；所使用的β-actin特异性探针为5’FAM-ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCCTGC GT-3’TAMRA(SEQ ID NO18)。
循环条件94℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后延伸10分钟。
(3)PCR产物定量动态测定荧光强度，以RabJ和β-actin的荧光强度的比值来表示RabJmRNA的水平。
(b)Western blot技术检测RabJ蛋白的表达水平收集48h的各组细胞，制备细胞裂解液，用RabJ多抗(按CN01126826.3中实施例6的方法制备)进行Western blot检测。
结果RabJ反义寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)能够明显抑制HeLa肿瘤细胞中RabJ的mRNA(见图1)和蛋白质表达(见图2)。其相应的正向序列(SEQ ID NO1-4)以及阴性对照(SEQ ID NO9-12)对RabJ的mRNA(见图1)和蛋白质表达没有影响。
实施例2RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后对肿瘤细胞的生长抑制本实施例采用了[3H]-胸腺嘧啶掺入法。
RabJ反义寡核苷酸瞬时表达48小时后，将HeLa、MCF-7以及SW480细胞以5×104个/孔的细胞密度接种于24孔培养板(Falcon)中，每种细胞接种三孔。培养6h后，在无血清培养基中继续培养24-48h，在最后4h，于每孔中加入0.5μCi(1Ci＝37GBq)的[3H]-胸腺嘧啶。然后，用PBS洗三遍，将细胞悬浮于含1％Triton X-100的PBS中，用玻璃纤维滤膜收集，用液闪仪测定放射性。或者在血清饥饿24h后，加入含10％FCS的正常培养基，继续培养24h，最后4h加入[3H]-胸腺嘧啶，然后进行放射测定。
结果显示，RabJ反义寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)能够明显抑制HeLa、MCF-7以及SW480肿瘤细胞体外的生长能力。其中对HeLa的抑制效果见图3。
实施例3RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后对肿瘤细胞体外致瘤活性的抑制本实施例采用了软琼脂克隆形成法。将混悬于0.5％软琼脂的5×104RabJ反义寡核苷酸瞬时表达后的HeLa细胞接种于底层含1％软琼脂的6孔板中，以检测细胞接触非依赖生长的能力。培养3周后，光镜下观察，细胞数多于50个的克隆记为阳性。
结果显示，RabJ反义寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)能够明显抑制HeLa肿瘤细胞体外在软琼脂上的克隆形成能力(见图4)。
实施例4瘤体内注射RabJ反义寡核苷酸对肿瘤细胞体内生长速率的抑制将1×106个HeLa细胞皮下注射到Balb/C裸鼠(购自上海必凯实验动物公司)的右下侧腹部(每种RabJ反义寡核苷酸的实验组和对照组各5只裸鼠，联用试验组为2只)，4周后，向瘤体内注射RabJ反义寡核苷酸(20μg/20μl 0.9％NaCl/小鼠)(SEQ ID NO5、6、7、8或联用SEQ ID NO5和6)，观察肿瘤生长速度。
结果显示，当HeLa野生型细胞在裸鼠体内形成肿瘤后，瘤体内连续注射RabJ反义寡核苷酸可显著抑制HeLa肿瘤的生长速率，提示RabJ反义寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)对体内肿瘤具有治疗作用，其中AON-RabJ1反义寡核苷酸的试验结果如图5所示。
另外，联用AON-RabJ1和AON-RabJ2(各20μg/20μl 0.9％NaCl/小鼠)时的肿瘤体积比单用AON-RabJ1或AON-RabJ2时的肿瘤体积更小。这表明，联用RabJ反义寡核苷酸可获得更好的抑制效果。
实施例5瘤体内注射RabJ反义寡核苷酸对体内HeLa细胞分化的促进将1×106个HeLa细胞皮下注射到Balb/C裸鼠的右下侧腹部，4周后，向瘤体内注射RabJ反义寡核苷酸(20μg/20μl 0.9％NaCl/小鼠)，4周后取肿瘤标本进行HE染色。
结果显示，RabJ反义寡核苷酸作用后的HeLa细胞发生分化，形成由鳞状上皮细胞组成的癌巢，并发生纤维组织样结缔组织的插入、空泡细胞的产生和大面积细胞死亡的现象，提示了HeLa肿瘤组织的成熟分化(见图6)。这表明RabJ反义寡核苷酸对体内肿瘤具有分化促进作用，从而产生肿瘤治疗效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>抑制人RabJ基因表达的反义寡核苷酸序列及其应用<130>057872<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>1ccaacatgcc gaagcggaag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>2ccttgatgcg tggctggcag 20<210>3<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3cagttgggac atgctgggag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4atgctcggac agccctcctg 20<210>5<211>20
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权利要求
1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，所述的反义寡核苷酸与人RabJ基因mRNA反向互补，并且其长度为18-25bp，并且所述的反义寡核苷酸可使HeLa细胞的生长降低50％以上。
2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的反义寡核苷酸结合于RabJ的以下区域的对应的核苷酸序列核定位信号、Rab功能域、J功能域、或其组合。
3.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的反义寡核苷酸含有选自SEQ ID NO5-8所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的反义寡核苷酸选自下组AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’。
5.如权利要求1-4中任一所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的反义寡核苷酸中具有经修饰的核苷酸，所述的修饰方式选自下组硫代修饰、甲基化修饰、磷酸硫代修饰、或其组合。
6.如权利要求5所述的反义寡核苷酸，其特征在于，其特征在于，所述的经修饰的核苷酸是全链经磷酸硫代修饰的核苷酸。
7.一种组合物，其特征在于，其含有0.001-99.99wt％权利要求1-6中任一项所述的反义寡核苷酸以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.权利要求1所述的反义寡核苷酸的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤细胞生长组合物或治疗肿瘤的药物组合物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达RabJ蛋白，并且选自下组子宫颈癌、乳腺癌、结肠癌。
全文摘要
本发明提供了一种针对癌基因样分子RabJ的反义寡核苷酸。具体而言，本发明涉及一种针对癌基因样分子RabJ的表达及功能的反义寡核苷酸序列，该反义寡核苷酸序列具有靶向性抗肿瘤细胞RabJ基因表达及功能、抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤细胞致瘤性的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该反义寡核苷酸的药物组合物，并公开了将该反义寡核苷酸药物用于疾病治疗的方法，特别是其在恶性肿瘤治疗中的用途。
文档编号A61P35/00GK1948482SQ20051003042
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者陈涛涌, 李楠, 万涛, 曹雪涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学