具有协同作用的药物组合物的制作方法

专利名称：具有协同作用的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物，具体地说，是一种含有天然植物提取物或单体的药用组合物，用于治疗和/或预防心脑血管疾病、糖尿病、老年痴呆症，以及用于防止心脑血管疾病的复发。
背景技术：
随着现代科学的高速发展，人们越来越重视“天然”药物。近年来，医药界在防治心脑血管疾病、糖尿病等疾病的药用植物研究方面做了诸多工作，加强了对生物活性物质的分析和研究，以期进一步明确其功效。然而，取得的成效是有限的。这主要是由于心脑血管疾病、糖尿病等疾病的致病机理复杂，常伴有不同类别的一种或多种并发症，已有的单一天然活性成分难以全方位奏效。
而且，大量不良反应报道的出现使人们认识到，天然药物在发挥治疗作用的同时也一样具有副作用，人们由此而越来越重视这些天然植物药物的安全性问题。例如，有报道(参见Rosenblatt M等，N Engl J Med 1997，3361108；Gianni L M等，USPharmacist 1998，23(5)80-86；Rowin J等，Neurology 1996，46(6)1775-6)表明，银杏叶制品可与维生素E、阿司匹林等抗血小板聚集和抗血凝药物发生潜在的相互作用，可导致出血、淤血或视觉变化等，甚至引起自发性双侧硬膜下血肿。另有报道(参见Hederson GL等，Life Sci 1999，65PL209-314；Anon等，Pharm J 2001，267(7157)79；康鲁平，医药导报2004，23(12)974-6，中成药，2005，27(5)520)表明，人参皂苷与经CYP2C9和CYP3A4酶代谢的药物合用时，可能会由于酶诱导作用而影响药物疗效和不良反应，而且人参皂也可与维生素E、阿司匹林等抗血小板聚集和抗血凝药物发生潜在的相互作用，甚至某些品种的人参制品被禁止用于高血压患者。
人们试图采用多种天然药物联用的方式，以期通过它们之间的加合、甚至协同作用来减少用药量，从而在确保(甚至提高)疗效的同时进一步降低不良反应。遗憾的是，天然药物的作用机理十分复杂，大多数天然药物的药物动力学参数、药物代谢机制、作用机理均不清楚。因此，与化学药品之间的相互作用相比，更难以预测天然药物间的相互作用。以心脑血管领域常用的银杏、人参和芍药为例，虽然人们对它们之间的联合给药进行了广泛研究(例如，中国专利申请ZL200310111065.5、ZL200310123995.2、ZL98110756.7)，但多着眼于不同组分针对不同症状的加和作用，即不同的药物实际上是各自独立地发挥着其原有的药理活性，几乎没有有关协同作和/或降低毒副反应的报道。
本发明人注意到，在已有技术水平下，没有关于银杏与芍药这两种组分联合应用的报道。李文军(ZL200310110709.9)和董莉(医药论坛杂志2004，25(17)63-64)披露了人参、芍药这两种组分的联合应用，但是依然没有有关二者产生协同增效或减毒作用的报道。鉴于人参皂苷对某些疾病的冶疗有赖于血浆有效浓度、并且有溶血等不良现象(孙光等，大连医学院学报1996，16(2)107-110)，本发明人推测以银杏代替人参与芍药联用，似乎是一种不错的解决方案。但是，很明显地，银杏(主要含内酯和黄酮)和人参(主要含皂苷)是组成和活性均不同的两类药物(参见ZL200310111065.5；钟利群等，中华全科医师杂志2003，2(4)251-252)，二者似乎是不可相互替代的。
更为不利的是，迄今为止，针对银杏能否与芍药联合应用，二者的作用机制是加和、协同还是拮抗等基础问题，已有技术没有提供科学依据。至于二者是否能联合用于其它疾病(例如糖尿病、老年痴呆症)，已有技术甚至没有类似的暗示或尝试。

发明内容
本发明人在这方面进行了有益的探索，并取得了喜人的结果。
本发明的一个目的在于提供于银杏和芍药在治疗和/或预防心脑血管疾病、糖尿病、老年痴呆症中的应用。
至于本发明药物组合物的有益作用，首先是在治疗糖尿病的过程中发现的。研究表明，糖尿病、尤其是其合并性病症(例如糖尿病性冠心病)的发病率和死亡率均很高，而且糖尿病可导致心脏微血管病变、大血管病变、心肌病变、糖尿病自主神经紊乱等危险疾病(北京医学2003，25(2)84-85)。鉴于糖尿病及其并发症的发生机制非常复杂，学术界和临床对此也存在争议(J Am Coll Cardiol 2003，41(1)1-7；Intern Med 2003，42(7)554-9；Exp Clin Endocrinol Diabetes 2002，110(5)212-8；Biol Pharm Bull 2003，26(12)1668-73；山东医药2003，43(1)14-15)，尚无切实可行的治疗方案(尤其是采用天然药物的疗法)，且有些降糖药物之间的联用反而加重其心血管病变的发生。
在此，我们发现本发明药物组合对糖尿病及其心脑血管相关并发症具有极好的治疗效果。同时，本发明人大胆推测这是由于银杏内酯和芍药苷作用于不同靶点，尤其是在不同病理阶段发挥治疗作用，发挥了药物联用的整体治疗优势。上述药物组合克服了已有药物存在的作用单一、服药量大等缺点，代表了天然药物治疗和预防糖尿病及其并发症的新趋势。
然而，二者联用的有益效果并不仅局限于糖尿病及其并发症中。在进一步的研究中，我们惊奇地发现，本发明药物组合物在心脑血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年痴呆症的治疗和/或预防中也表现出极好的治疗效果。所述心脑血管疾病例如包括冠心病、脑卒中(也称脑中风)、心肌梗塞，和所述老年痴呆症包括阿尔茨海默病(简称AD)或脑血管性痴呆(简称VD)。
本发明的另一个重要发现是本发明药物组合物在防止心脑血管疾病复发方面的有益效果。心脑血管疾病是危害现代人健康的常见病和多发病，其发病率、病死率和致残率均很高。以脑梗死(缺血性脑卒中)为例，研究表明男性和女性患动脉粥样化血栓性脑梗死5年的累计复发率，分别为42％和24％(Sacco RL等，Stroke 1982，13290-295)。尤为不利的是，复发性脑梗死的病死率、致残率均高于首次发病(梁玉宏等，国外医学脑血管疾病分册1993，1155)。
当前，心脑血管疾病发病后的治疗研究结果尚无法令人满意，但已公认这类疾病是可以预防的疾病(Sacco RL等，Cerebrovasc Dis 1999，(增刊3)37-44)。按照干预措施介入的时间，预防可通常分为两个阶段“一级预防”，即对健康人群或存在心脑血管疾病危险因素、但尚无心脑血管疾病症状的人群开展预防。例如，一个人没有发生冠心病，但其有可能导致冠心病的吸烟、嗜酒、高血压、糖尿病等不利因素，针对这些不良嗜好、疾病加以治疗，则可能防止或推迟冠心病的发生。“一级预防”通常主要强调生活(行为)方式干预，而不倡导使用药物干预；和“二级预防”，即对已出现心脑血管疾病症状，如短暂性脑缺血发作(TIA)或已有缺血性卒中后痴呆发作史的病人开展预防，防止其再次发生同种疾病而采取的措施。在此，本发明术语“防止复发”是指“二级预防”。
虽然常规化学药物例如阿司匹林等可在一定程度上实现有效预防，但是有相当的局限性，甚至失败的案例也很多(参见王少华等，铁道医学1999，27(2)136)，临床上俗称为“阿司匹林抵抗”。同时，阿司匹林增加机体出血(尤其是上消化道出血)的危险性，相当一部分患者使用受限。并且，最近有报道，美国食品药品监督管理局(FDA)综合现有的研究数据认为，非甾体抗炎药存在增加心血管不良事件的可能性。目前，在临床实践中，还没有任何一种药物可以同时具有上述药理作用(特别是协同作用)，临床医生被迫选择多种药物同时使用。而同时使用种类繁多的药物，很可能带来药物副作用的叠加(尽管报道很少，但临床医生实际应用药物时难以决策，往往是顾及药物副作用)。尤为不利的是，在众多复发危险因素中，究竟哪一种危险因素对复发起着主要作用，也没有明确结论，因此目前尚无一种药物是以“一级预防”或“二级预防”作为主要活性/适应症而上市的。
本发明人在此方面做了有益的尝试和探索，而且取得了诱人的成果。动物实验表明，银杏和芍药的组合在同时控制多个主要的复发危险因素方面表现出了出人意料的协同作用。鉴于时间及医学论理学因素，我们只进行了有限数量的缺血性脑卒中“二级预防”临床观察试验，但是已可以从中预测出本发明组合物在心脑血管疾病“一级预防”、尤其是“二级预防”临床上的潜在应用前景。
根据试验结果，并结合目前国际公认的心脑血管疾病“一级预防”、“二级预防”循证医学证据，我们推测，本发明药物组合物之所以能有效地防止了心脑血管疾病的复发，极有可能是在以下作用中表现出的协同作用①抗血小板聚集作用(抑制血小板的聚集与分泌，改变血小板和管内皮细胞的前列腺素代谢途径，使血管内环境趋向防止血小板聚集、防止血栓形成及血管内皮破损)；②调节血脂作用(使甘油三酯和总胆固醇降低，高密度脂蛋白稍增加，肝脏合成极低密度脂蛋白减少，这三种变化都能积极防止动脉硬化的发生)；③调节糖代谢作用(将糖尿病患者的血糖水平控制在理想范围内，改善脂肪代谢障碍，控制胆固醇的合成)；④抗氧化作用(激活人体内的SOD，抑制自由基的作用，抑制脂质过氧化物对体内生物膜正常功能的破坏，减少动脉、尤其是小动脉的硬化机会)。
⑤调节血压作用(降低血管的被动扩张，减少血管壁所受张力、通透性增加，防止血浆成分外渗；降低血管壁厚，改善其坚固性增加，防止出现平滑肌玻璃样变性和坏死)；同时，鉴于心脑血管疾病二级预防的复杂性，本发明人期望不受任何理论的限制，所取得的有益效果皆由药理药效实验证明。有利的是，动物实验表明，本发明药物组合物还表现出显著的抗炎性反应作用施用本发明药物后，受试动物的动脉粥样硬化斑块形成的受抑制程度，与其体内炎性标志物CRP(或者MCP-1)的降低水平相平行，这明显提示本发明药物组合物通过抑制血管发生炎性反应，从而抑制了脂质沉着引起动脉硬化的机会，降低了脑卒中复发或死亡的重要危险因素。上述发现结合临床试验结果，进一步验证了本发明组合物在缺血性脑卒中“二级预防”方面的应用潜力。
因此，本发明的另一个目的在于提供于银杏和芍药在制备用于防止心脑血管疾病复发的药物中的应用。在临床应用时，医师可以根据患者的年龄、体制、严重程度等因素，制定个体给药方案，例如给予1/5-1倍治疗/预防有效量的本发明药物组合物。众所周知，长期口服给药比较适于预防复发。
本发明银杏内酯、芍药苷可以单独的制剂形式供联合给药，也可以同时含有二者的产品形式提供。
因此，本发明的另一个目的在于提供用于含有银杏内酯和芍药苷的药用组合物，其中银杏内酯和芍药苷的重量比例为0.05-10∶1，优选0.05-5∶1、0.1-1∶1，和更优选0.2∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。
本发明组合物中，可以选择药味(例如芍药)直接粉碎成粉末入药，也可以相当于上述天然药物材生药量的提取物或其他形式入药。因此，本发明药物组合物的活性组成包括药材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分。例如，所述活性组成包括a)银杏银杏提取物(例如低级醇、丙酮、乙酸乙酯的银杏叶提取物)，主要含有银杏内酯和银杏黄酮作为活性成分的银杏提取物(例如标准提取物Egb)，或银杏黄酮单体和银杏内酯单体，或银杏内酯单体，或银杏黄酮单体。其中，所述银杏内酯(Ginkgolides)是指含有各种银杏萜类内酯物质(二萜内酯A、B、C、M、J，倍半内酯等)的混合物；“银杏内酯单体”是指上述萜类内酯中各种内酯类物质的单体和/或其衍生物、或其化学修饰物、类似物。所述银杏黄酮是指含有各种银杏黄酮物质(银杏黄酮及其苷、总黄酮醇及其苷、双黄酮、儿茶素等)的混合物；“银杏黄酮单体”是指上述黄酮中各种黄酮类物质的单体和/或其衍生物、或其化学修饰物、类似物。
b)芍药芍药(白芍、赤芍、川赤芍)的干燥根粉末，含有苷类化合物(优选为芍药苷和芍药内酯苷)的提取物，或芍药苷(Paeoniflorin)单体。另外，研究表明，同时含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、丹皮酚(paenol)、丹皮酚原苷(paeonolide)、丹皮酚苷(paeoniside)、芍药苷元(paeoniflorgenone)等的有效部位也是有益的。本领域技术人员可以理解的是，本发明芍药苷类的来源并不局限于芍药，含有芍药苷类的同属其他植物也可实现本发明，其提取和制备方法为已知技术，在此不作赘述。
可以采用现代提取和分离技术，以提高活性物质的纯度、尽量除去不需要的杂质，类似的技术在已有技术中已相当成熟有效，例如DE2117429A、中国专利申请ZL021109737、ZL02133298.3、ZL031131263、ZL03152921、ZL03119744、ZL03114826、ZL03153496、ZL01128926、ZL200410041120、辽宁中医学院学报(2002年，4(1)24)、中成药(2005年，27(3)350-351)、世界科学技术-中医药现代化(2003年，(1)33-39)、中国天然药物(2004年，2(1)11-15)等。
可针对银杏内酯、芍药苷的溶解特性和体内吸收特点(张壮等，中国实验方剂学杂志2000，6(6)21-24)，采用标准制剂技术制成适宜的口服或非肠道给药剂型，类似的技术在已有技术中也已相当成熟有效，例如制备银杏内酯钠盐(ZL00115134)、口腔快速崩解片(ZL200310123852)、软胶囊(ZL03116572)、缓控释制剂(ZL02116223、ZL200310110709)、环糊精包合物(ZL200310125175)、注射剂(ZL99124228、ZL021153590、ZL03113818、ZL031399428、ZL200410069038)、粉针剂(ZL03131959.9、ZL200410013937、ZL2003101210259、ZL200410000912)、滴丸(ZL03136485)、分散片(ZL03125462)、磷脂复合物(ZL01139971、ZL03128337)等。
可以理解的是，本领域技术人员根据不同的疾病状况，可选用不同组合形式。例如，在以抗动脉粥样硬化作用为主的治疗中，可采用“银杏内酯(为主)+芍药苷”的组合；而在以抗氧化作用为主的治疗中，可采用“银杏黄酮(为主)+芍药苷”的组合。本发明组合物临床使用中，每日推荐剂量(优选)为银杏内酯2mg-30mg、芍药苷5-50mg、银杏黄酮10-100mg。
随后进行的研究表明，与已有的“银杏(内酯)+人参(皂苷)+芍药(苷)”组合(例如ZL98110756.7)相比，在减少了一种活性成分的情况下，本发明药物组合物依然保持了相同、甚至就某些方面而言更为有利的药理作用(例如避免了不需要的人参皂苷之不良反应)，多项指标显著优于单独施用的银杏内酯、银杏黄酮或芍药苷，这是本领域技术人员无法根据现有技术推测的。因此，本发明试图提供一种选择，它提供了一种新的安全产品作为现有技术的替代，这种产品及其相应治疗方案将是医生高度认可并着力推荐的。
药理药效学试验研究一.心脑血管方面的药理作用1.对离体豚鼠心脏冠脉流量的影响1.1材料本发明药物组合物银杏内酯-芍药苷(2∶1、1∶1、1∶5、1∶10)，4mg/kg注射给药；阳性对照药银杏内酯(4mg/kg)；芍药苷(4mg/kg)；银杏内酯+人参皂苷+芍药苷(1∶1∶1，简称“银-人-芍”，12mg/kg)；硫酸异丙肾上素注射液。
1.2实验方法A.调节恒温灌流装置(参照《中药药理研究方法学》，人民卫生出版社，第一版，第523页)；B.制备豚鼠离体心脏，放入低温洛氏液中排出余血，在升主动脉最高处插入主动脉插管，固定，使洛氏液由冠脉经心肌入右心房，从腔静脉和肺动脉的断端流出，心尖通过蛙心夹连接记录杠杆，描记心脏搏动曲线，记录心率；C.测定冠脉流量冠脉流量、心率、心搏幅度基本稳定后，连续测量3次每分钟流量球平均值，作为给药前的正常流量；D.给药后的作用从主动脉上方注入各药，测定给药后1～10分钟内每分钟流量、心率和心搏幅度，找出其极值，算出给药后灌流量的最大增建值。每个药物重复5个心脏，结果见表1。
表1.不同配比的本发明组合物(注射)对离体豚鼠心脏的影响(X±SD)

自身前后比较*p＜0.05**p＜0.01由表1实验结果可知，硫酸异肾上腺素、银杏内酯、银-人-芍、本发明组合物均能增加离体心脏冠脉流量。硫酸异肾上腺素和银杏内酯虽然可明显增加冠脉流量，也明显增加心率和心搏幅度。银-人-芍也可增加冠脉流量，但同时也增加心率，因而增加心肌耗氧量，所以可据此推测硫酸异肾上腺素和银杏内酯+人参皂苷+芍药苷并不适用于冠心病患者。
本发明组合物明显增加冠脉流量，但不增加心率和心搏幅度，效果好于硫酸异肾上腺素和银-人-芍，也好于单独施用的银杏内酯或芍药苷。
2.对不同诱导剂(包括血小板活化因子、腺苷二磷酸)诱导血小板凝集的影响2.1材料本发明药物组合物(银杏内酯-芍药苷1∶1，简称组合物A，4mg/kg注射)，和银杏叶和白芍的提取物(1∶1，简称组合物B，10、20、30mg/kg灌胃)；空白对照组生理盐水阳性对照药相当于同样用药量的单组分的银杏内酯(4mg/kg)；相当于同样用药量的单组分的芍药苷(10mg/kg)；天保宁片(含银杏叶提取物20mg/kg)；银杏+人参+芍药提取物(1∶1∶1，30mg/kg)2.2实验方法豚鼠分组，实验动物连续灌胃5天，空白对照用生理盐水。末次给药1小时后颈动脉采血，以枸橼酸钠抗凝，混匀后离心(800r/min)2次，合并上清液作为富血小板血浆(PRP)，血小板计数；余下血浆离心(3000r/min)，取上清液作为贫血小板血浆(PPP)；以PPP调零，取PRP300μl加入比浊管，37℃温育5分钟，加入诱导剂血小板活化因子(PAF)，聚集不同时间，记录数据，结果见表2。
表2.对PAF诱导的豚鼠血小板聚集的影响

与空白对照组比较*p＜0.05**p＜0.01诱导剂为腺苷二磷酸(ADP)的实验结果，类似于表2显示的效果。
由上述结果可知，银杏内酯、银-人-芍、天保宁片、本发明组合物高和中剂量组均能抑制不同诱导剂诱导的血小板聚集(凝集)、降低最大聚集率，其中以银-人-芍、本发明组合物高剂量效果最好，中剂量组也表现出抑制血小板聚集作用，优于单独施用的银杏内酯或芍药苷。
还对大鼠颈动-静脉血流旁路术血栓形成的影响、对大鼠体外血栓形成的影响等进行了实验，结果表明本发明组合物对体内血栓形成具有明显对抗作用。
3.对大鼠试验性脑缺血的影响还对脑水含量的影响、MCAO所致大鼠缺血损伤行为学指标的影响等进行了实验，结果表明①本发明各配比组、银-人-芍组、以及单独施用的银杏内酯，对不完全性脑缺血引起的脑水肿均显示出明显保护作用，单独施用的芍药苷治疗组作用不明显。与单独施用的银杏叶治疗组相比，本发明组合物各组的脑含水量显著减少(P＜0.01)，表明其对不完全性脑缺血引起的脑水肿有显著的保护作用，效果稍优于或等于银-人-芍组②大鼠MCAO后明显有脑梗塞发生，本发明各配比组均可明显降低脑梗塞组织重量百分比(P＜0.01)，效果与银杏+人参+芍药组相近似，单独施用的芍药苷治疗组作用不明显。而单独施用的银杏内酯组也有较明显的降低效果(P＜0.05)，但明显不如本发明组合物的大、中剂量组③同样，在对MCAO所致大鼠缺血损伤行为学指标的影响的实验中，显示了与上述相类似的结果，即本发明的组合物大、中剂量组的效果最好，明显优于单独施用的银杏内酯或芍药苷组，而且效果稍优于或等于银-人-芍组。
二.糖尿病方面的药理作用1.材料本发明药物组合物(银杏内酯-芍药苷1∶5，简称组合物A，注射)，和银杏叶和白芍的提取物(简称组合物B，灌胃)；正常对照组生理盐水；糖尿病组生理盐水；阳性对照药相当于同样用药量的单组分的银杏内酯；相当于同样用药量的单组分的芍药苷；降糖灵片；银杏内酯+人参皂苷+芍药苷。
2.实验方法糖尿病实验模型的建立二级SD大鼠按照150mg/kg体重尾静脉注射四氧嘧啶液，在四氧嘧啶液作用下，大鼠的胰岛β细胞受到损伤，造成胰岛素发生障碍，3天后尾静脉采血测空腹血糖，血糖值大于11.0mmol/L的为糖尿病大鼠。
每日一次，连续4周，之后，尾静脉采血测空腹血糖(FBG)和血清Ins。
表3.对糖尿病大鼠的FBG和血清Ins的影响


与糖尿病组比较*p＜0.05**p＜0.01上述实验表明，以银杏内酯和芍药苷组成的组合物注射组的效果最明显(p＜0.01)。提取物的高剂量口服组次之。口服芍药苷可产生一定的降低血糖的作用，但不如银-人-芍组、本发明组合物明显，口服银杏内酯组降血糖作用不明显，口服银-人-芍组，可以降低四氧嘧啶糖尿病的血糖，并使血清Ins水平呈一定程度升高。降糖灵片只显示降低血糖的效果，对血清Ins水平的影响不显著。本发明组合物注射组明显降低了四氧嘧啶糖尿病的血糖，并使血清Ins水平明显升高，这表明银杏内酯与芍药苷的联合用药对四氧嘧啶糖尿病大鼠产生了较强的降血糖作用。
同时，本发明研究了本发明组合物对糖尿病模型的大鼠的血清、肝、脑中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的影响。与正常对照组相比，糖尿病模型的大鼠的血清、肝、脑、胰腺中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量显著提高，而经过本发明的组合物高剂量给药后，上述组织中的MDA明显下降，而胰腺MDA值变化不明显，说明银杏(内酯)和芍药(苷)是改善和治疗糖尿病的有效药物，尤其以二者的一定比例配伍使用，其伍用加合的效果最好(明显优于单用各组分)。
另外，进一步的实验证明，本发明组合物可以纠正糖尿病微血管动力学异常，其效果优于单独施用的银杏内酯或芍药苷。
三.高血脂方面的药理作用1.材料本发明药物组合物(银杏内酯-芍药苷2∶1，简称组合物A，注射)，和银杏叶和白芍的提取物(简称组合物B，灌胃)；正常对照组生理盐水；高血脂组生理盐水；阳性对照药相当于同样用药量的单组分的银杏内酯；相当于同样用药量的单组分的芍药苷；洛伐他汀；银杏内酯+人参皂苷+芍药苷；
2.实验方法高血脂模型的建立Wistar大鼠给予高脂饲料20g/只/天，共12天；正常对照组喂食普通饲料。
每日一次，药物灌胃，连续12天，最后一天禁食不禁水，次日麻醉，之后腹主动脉取血，分离血清，测空腹血脂包括甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，按照试剂盒说明书操作，结果见下表表4.对糖尿病大鼠TG、TC、HDL和LDL的影响

与高血脂组比较*p＜0.05**p＜0.01上述实验表明，口服银杏内酯可以降低TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.05)；口服银-人-芍也可以降低TG、TC和LDL，但升高HDL不明显(p＞0.05)；而银杏内酯和芍药苷组成的组合物注射，以及银杏叶-白芍的提取物的高剂量口服，明显降低TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.01)，这表明银杏-白芍的联合用药对四氧嘧啶糖尿病大鼠血脂代谢产生了较强的调节作用。
四.抗氧化方面的药理作用1.对高血脂症大鼠的抗氧化作用1.1材料本发明药物组合物银杏黄酮+芍药苷1∶1(40、20、10mg/kg灌胃)；正常对照组生理盐水；
高血脂组生理盐水；阳性对照药银杏黄酮(20mg/kg、40mg/kg)；银杏内酯(10mg/kg、20mg/kg)；芍药苷(40mg/kg、20mg/kg)；VE(150mg/kg)；人参+芍药(2∶1，100mg/kg)；1.2实验方法高血脂模型的建立Wistar大鼠给予高脂饲料20g/只/天，共12天；正常对照组喂食普通饲料。高脂模型与正常组比较，血清和肝脏的LPO明显升高，而SOD活性明显降低，表明高血脂大鼠伴有自由基脂质过氧化损伤。
每日一次，药物灌胃，连续12天，最后一天禁食不禁水，次日麻醉，之后腹主动脉取血，分离血清，测过氧化脂质(LPO)和超氧化物歧化酶(SOD)，按照试剂盒说明书操作，取1/2肝脏待测LPO和SOD，结果见下表表5.对高血脂大鼠血清和肝脏LPO和SOD的影响(nmol/L)

与高血脂组比较*p＜0.05**p＜0.01上述实验表明，单独施用的银杏黄酮、银杏内酯和芍药苷大剂量时存在一定的抗氧化活性(芍药苷的活性优于银杏内酯)，低剂量银杏黄酮、银杏内酯、芍药苷则不明显。本发明组合物的中、高剂量组有抗氧化活性，尤其是高剂量组的活性更显著(p＜0.01)，明显优于单独施用的银杏黄酮、银杏内酯和其他对照药，推测这是由于银杏叶中银杏总黄酮的清除自由基能力较强，抗氧化活性优于银杏内酯，而本发明的组合物中有效成分为银杏总黄酮，所以活性优于单纯的银杏内酯。
另外，还从保护神经细胞、减少脑组织丙二醛(MDA)和NO生成等方面，考察了本发明组合物的抗氧化作用，结果证明本发明组合物对脑组织MDA有明显抑制作用，降低脑组织中升高的NO，对神经细胞也显示了保护作用，实验也证明银杏内酯的抗氧化作用较弱，推测本发明组合物在抗氧化中以银杏叶总黄酮的活性为主。其中的银杏和芍药提取物两者存在明显的协同作用，其原因和机理有待进一步探讨。
五.老年痴呆方面的药理作用1.材料本发明药物组合物含有银杏和白芍的提取物(简称组合物，配比分别为6∶1、1∶1、1∶6，ip 20mg/kg)；正常对照组生理盐水；模型组β-淀粉样肽；阳性对照药银杏内酯(20mg/kg)；芍药苷(20mg/kg)；银杏内酯+人参皂苷+芍药苷(20mg/kg)；2.实验方法模型的建立将小鼠麻醉，将其前囟处皮肤开一小口，暴露颅骨，侧脑室注入β一淀粉样肽，对照组注射生理盐水。
ip给药10天。之后将透明的安全岛置于水迷宫第三象限，以第一、第二象限为小鼠的入水点，水面高出安全岛1cm，室温，上方通过摄像机和监视屏与计算机相连，自动检测和记录活动轨迹(大致分为边缘型、随机型、趋向型和直线型)以及到达安全岛的时间，同步进行数据处理，每天训练4次，每次3min，每次入水前将小鼠搁置在安全岛30秒，训练结束再搁置30秒，以强化记忆，记录进步的速度(是否路程增加、潜伏期延长、寻找策略目的性是否增强等)，第四天，结果见下表。
表6.对β-淀粉样肽所致的AD小鼠学习记忆功能障碍改善的作用(n＝10)


与模型组比较*p＜0.05上述实验表明，银-人-芍、本发明各配比组均具有路程减少、潜伏期缩短、寻找策略目的性增强的作用，银杏内酯组也有该方面的作用，但不如银-人-芍以及本发明组合物组的效果，而本发明组合物的作用相近似或略优于银-人-芍组。
同时本发明对上述实验的大鼠死亡率、抗D-半乳糖致脑老化、预防/治疗VD、被动回避实验中对诱发小鼠记忆巩固/再现障碍的作用等指标也作以详细测试，实验证明，本发明的组合物的合用施用效果均好于单独使用银杏内酯或芍药苷。说明本发明的组合物产生了效果加合/协同作用。
六.抗AS(动脉粥样硬化)的药理作用1.对兔AS病变进展的抑制作用1.1材料本发明药物组合物为含有银杏、白芍的提取物(1∶2，100mg/kg灌胃)；正常对照组生理盐水；模型组生理盐水；阳性对照药银杏内酯(10mg/kg)芍药苷(20mg/kg)；阿司匹林(50mg/kg)；1.2实验方法将雄性新西兰兔，随机分组正常组(A组，空白对照组，喂普通标准饲料)、AS模型组(B组，喂含1％胆固醇饲料)、AS+阳性对照药银杏内酯组(C1组，胆固醇喂料与B组同，另同时给予银杏内酯口服，10mg/kg)、AS+阳性对照药芍药苷组(C2组，胆固醇喂料与B组同，另同时给予芍药苷口服，20mg/kg)、AS+阳性对照药阿司匹林组(C3组，胆固醇喂料与B组同，另同时给予阿司匹林口服，50mg/kg)、AS+本发明组合物组(D组，胆固醇喂料与B组同，另同时给予本发明实施例1的组合物口服)。动物均单笼饲养。实验期为12周。12周后处死动物。
测定指标1血脂、血清C反应蛋白(CRP)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)水平在0、12周末经耳缘静脉抽血，用酶学法测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C，其中LDL-C由Friedewald公式计算得出，按照试剂盒说明书操作。
实验结果表明，各组高胆固醇塑料组动物的血清TG、TC、LDL-C水平均明显高于喂养前，也显著高于正常对照组；口服银杏内酯可以降低TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.05)；口服阿司匹林也可以降低TG、TC和LDL，但升高HDL不明显(p＞0.05)；而本发明组合物的高剂量口服组则明显地降低了TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.01)。
再于12周末取静脉血，利用固相酶联免疫吸附法测血清CRP水平和MCP-1水平，结果见表7表7.对兔主动脉的CRP和MCP-1水平的影响n＝10

与模型组比较*p＜0.05**p＜0.01结果表明，口服芍药苷的作用不明显，银杏内酯、阿司匹林组和本发明组合物组的血清CRP和MCP-1的浓度仍高于正常，但明显低于模型组和芍药苷组。D组与C1之间虽然无显著性差异，但是数据表明银杏内酯与芍药苷药物的合用具有使血清CRP和MCP-1进一步降低的趋势，其增强银杏内酯活性的机理有待进一步探讨。
测定指标2主动脉组织病理形态学改变并分析病变程度于12周末处死动物，剖开胸腹腔，游离主动脉全长，剥离外膜脂肪组织，纵行剖开置于10％中性福尔马林中保存，大体标本行苏丹III染色厚摄像，利用生物医学图像分析系统测定斑块大体面积、内膜总面积和血管周长，计算斑块与内膜面积比；并将主动脉全长分段，常规石蜡包埋，制成4μm厚度的病理切片，染色，测量内膜厚度、中膜厚度，计算内膜与中膜厚度比，并加以平均，作为病理形态学观察指标的测定值，见表8。
测定指标3斑块部位的巨噬细胞、平滑肌细胞阳性率以及COX-2的表达取4μm厚主动脉组织切片采用EnVision法进行免疫组织化学染色，设替代对照(PBS代替一抗)，棕黄色颗粒装产物为阳性标记，采用细胞图像分析系统计算阳性细胞百分率，取平均值，见表8。
表8.兔主动脉组织病理形态学改变以及斑块部位的巨噬细胞、平滑肌细胞阳性率(％)


与模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01病理形态学改变与模型组比较，芍药苷组各项指标均无明显变化；与模型组比较，银杏内酯、阿司匹林组和本发明组合物组的各项指标呈显著性减少，同时巨噬细胞含量明显减少，平滑肌细胞含量明显增加，其中以本发明组合物组最为显著(p＜0.01)。
毒理学小鼠急毒、长毒实验结果表明本发明的组合物静脉注射小鼠的最大耐受量为1.5g/kg，腹腔注射的LD50为3g/kg；与对照组相比，本发明组合物在给药30周时，各脏器系数均无显著差异。
病理形态学观察大鼠主要脏器均未见与受试药物毒性相关的病理改变。
缺血性脑卒中二级预防的临床观察1.对象入选标准年龄＜75岁；缺血性脑卒中；首发或二次复发病例；急性期3月后；有CT/MRI诊断，并与临床表现相符合。
排除标准各种出血性卒中；三次及以上脑卒中发作；影像学检查为缺血性脑卒中，而无临床症状或体征的病人；无CT/MRI确诊的脑卒中患者；缺血性脑卒中急性期3个月内；瘤卒中；血液病；严重肝肾功能损伤；静息卒中。
2.方法与结果本发明组合物组400例病人，口服(银杏内酯15mg+芍药苷40mg/天)；药物对照组480例病人，阿司匹林，口服75mg/天；空白对照组470例病人，不提供阿司匹林或组合物药物。
于实验开始的第30、60、90、120天，观察是否有卒中复发、副作用(出现胃肠不适、黑便、恶心、嗳气等症状)和严重副作用(以出现黑便，大便潜血检查阳性，经停药抗酸治疗后黑便、潜血消失为判定上消化道出血副反应依据)，评定复发必须有CT/MRI确诊。结果见下表表9.120天复发率观察表

表10.120天消化道副反应观察表

表11.120天上消化道出血副反应观察表

3.结论本发明组合物及阿司匹林均可以降低缺血性脑卒中的复发率，两者效果相当，与空白对照组相比，本发明组合物组和药物对照组均有着显著性差异。
服用阿司匹林的480例病人中出现37例副作用和11例严重副作用，而服用本发明组合物的400例病人只有7例副作用，1例严重副作用产生，两组对比有显著性差异。
制剂实施例实施例1 胶囊剂取银杏叶提取物(纯度97％，其中黄酮含24％，内酯含6％)5g，取赤芍提取物(含芍药苷20％)5g，加入淀粉，混合均匀，制粒、粉碎过筛、干燥制得颗粒，装入20粒硬胶囊中即得。经检测，每胶囊中含有银杏内酯15mg、和芍药苷50mg。
实施例2 片剂取银杏内酯8g，芍药苷60g，磨细粉过80目筛，加适量糊精，混匀，先用40-60％乙醇湿匀，后用淀粉浆制粒，过筛后80℃干燥，整粉(过14目筛)用100目均匀地将硬脂酸镁混入颗粒中，制得1000片，包衣即得。经检测，每片中含有银杏内酯8mg、和芍药苷60mg。
实施例3 软胶囊剂取银杏黄酮40g、芍药苷20g，加入植物油中混匀，用明胶作囊壳材料，压制成1000粒软胶囊。经检测，每胶囊中含有银杏黄酮40mg、和芍药苷20mg。
实施例4 缓释片取银杏内酯40g、芍药苷5g、加入乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基基纤维素、聚乙烯吡咯、硬质酸镁，按照标准制粒和压片工艺制备1000粒。经检测，每胶囊中含有银杏内酯40mg、和芍药苷5mg。
实施例5 冻干针剂取羟丙基-β-环糊精80克、葡甲胺3克加2000ml注射用水溶解，得溶液I，85℃保温，备用；另取银杏内酯10克加适量丙酮使其溶解，取芍药苷20g，再将二者缓缓加入溶液I中进行溶解，保温65分钟，然后放冷至室温，滤过，再微孔滤膜过滤，分装1000支，冻干，其冻干工艺为，先-15℃冷冻成型，再-40℃冷冻降温，冷冻下真空干燥，36小时后，缓缓升温，直至25℃封盖，即得。经检测每支含有银杏内酯10mg、和芍药苷20mg。
权利要求
1.一种药物组合物，包括以下组分a.银杏提取物，或主要含有银杏内酯和银杏黄酮作为活性成分的银杏提取物，或银杏黄酮单体和银杏内酯单体、或银杏内酯单体、或银杏黄酮单体；和b.芍药的干燥根粉末，或含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷的芍药提取物，或芍药苷单体，其中组分a中银杏内酯与组分b中芍药苷的重量比例为0.05-10∶1。
2.如权利要求1的药物组合物，包括以下组分a.主要含有银杏内酯和银杏黄酮作为活性成分的银杏提取物；和b.含有芍药苷、芍药内酯苷的芍药提取物。
3.如权利要求1的药物组合物，包括以下组分a.银杏黄酮单体和银杏内酯单体；和b.含有芍药苷、芍药内酯苷的芍药提取物。
4.如权利要求1的药物组合物，包括以下组分a.银杏内酯单体；和b.芍药苷单体，其中银杏内酯与芍药苷的重量比例为0.1-5∶1。
5.如权利要求1的药物组合物，包括以下组分a.银杏黄酮单体；和b.芍药苷单体，其中银杏黄酮与芍药苷的重量比例为0.1-5∶1。
6.如权利要求4的药物组合物，其中银杏内酯与芍药苷的重量比例为0.1-1∶1。
7.如权利要求5的药物组合物，其中银杏黄酮与芍药苷的重量比例为0.1-1∶1。
8.如权利要求1-7之一的药物组合物，为口服或非肠道给药制剂形式。
9.权利要求1-8之一的药物组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病及其并发症、老年痴呆症、心脑血管疾病的药物中的应用。
10.权利要求1-8之一的药物组合物在制备用于防止心脑血管疾病复发的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种药物组合物、制备方法及其应用，所述药物组合物主要含有银杏内酯和芍药苷。本发明药物组合物可用于治疗和预防糖尿病、老年痴呆症、心脑血管疾病，以及用于防止心脑血管疾病的复发。
文档编号A61P25/28GK1714832SQ200510082739
公开日2006年1月4日 申请日期2005年7月11日 优先权日2005年7月11日
发明者林艳和, 潘锡平, 林谷风 申请人:深圳市生物谷科技有限公司