专利名称：醇溶性当归小分子多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，涉及一种中药提取物——醇溶性当归小分子多糖及其制备方法和用途。
背景技术：
在我国传统医学中，传统补益药当归占有十分重要的地位。当归为伞形科当归属多年生草本植物当归[Angelica Sinensis(Oliv)Diels]的干燥根，有活血化瘀之功效。近年来，传统中药中所含多糖的药理作用越来越受到重视，当归中所含的当归多糖已被证明具有复杂的生物活性，当归多糖是由分子量不同的高分子化合物组成的同系混合物，但以往的研究仅仅限于存在于当归醇沉物中提取的当归杂多糖，此种方法所得当归杂多糖分子量在65000以上，分子量大而分散，且此当归杂多糖不溶于乙醇，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛组成，其和本发明从当归醇溶液中提取的醇溶性当归小分子多糖在分子量、组成、化学性质等方面有着巨大的区别。
发明内容
本发明的目的是提供一种醇溶性当归小分子多糖及其制备方法和用途，所得醇溶性当归小分子多糖可用于制备治疗脑缺血病的药物。
本发明提供的技术方案是醇溶性当归小分子多糖，由下法制得先将当归用水提取得当归水提液，当归水提液浓缩后，在105±1℃保温降解1～5小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液A；在搅拌下向浓缩液A中加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在90±5℃保温降解1～4小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液B；在搅拌下向浓缩液B中加乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在85±5℃保温降解0.6～3.5小时，然后浓缩至比重为1.05±0.1，冷却得浓缩液C；在搅拌下向浓缩液C中加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在80±5℃保温降解0.5～2.5小时，浓缩至比重为1.05±0.1，冷却、纯化、冻干即得到分子量为8,000～24,000的醇溶性当归小分子多糖。
本发明还提供了上述醇溶性当归小分子多糖的制备方法先将当归用水提取得当归水提液，当归水提液浓缩后，在105±1℃保温降解1～5小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液A；在搅拌下向浓缩液A中加入乙醇适量除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在90±5℃保温降解1～4小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液B；在搅拌下向浓缩液B中加乙醇适量除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在85±5℃保温降解0.6～3.5小时，然后浓缩至比重为1.05±0.1，冷却得浓缩液C；在搅拌下向浓缩液C中加入乙醇适量除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在80±5℃保温降解0.5～2.5小时，浓缩至比重为1.05±0.1，冷却、纯化、冻干即得到分子量为8,000～24,000的醇溶性当归小分子多糖。
本发明的上述醇溶性当归小分子多糖易溶于水，并易溶于乙醇，糖含量大于70％。经PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化测定在250nm处有紫外吸收峰。
HPLC检测结果醇溶性当归小分子多糖的单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，其中葡萄糖(保留时间38.08min)的百分比含量为55.16％，鼠李糖(保留时间25.86min)的百分比含量为1.74％，半乳糖(保留时间40.96min)的百分比含量为3.71％，甘露糖(保留时间22.27min)的百分比含量为25.04％，阿拉伯糖(保留时间42.65min)的百分比含量为13.14％，葡萄糖醛酸(保留时间30.62min)的百分比含量为1.21％。
本发明所涉及醇溶性当归小分子多糖的分子量相对集中，采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射联用技术鉴定其相对分子质量范围，波长632.8nm，流速为0.800ml/min，出峰时间为23.258～35.642min，测定醇溶性当归小分子多糖的分子量在8,000～24,000之间。
本发明所涉及的醇溶性当归小分子多糖(分子量8000～24000)可显著降低血清和缺血组织内TXA2/PGI2或其前体物的比值，能降低脑缺血模型大鼠脑组织匀浆内丙二醛(MDA)的含量，增加SOD活性，清除氧自由基，抗脂质过氧化反应，减低MDA水平，醇溶性当归小分子多糖能使脑缺血动物脑梗塞体积显著性缩小，通过增加Bcl-2的表达发挥抑制缺血性神经细胞凋亡的作用，电镜下缺血组织超微结构破坏减轻。本发明醇溶性当归小分子多糖可用于制备治疗脑缺血病的药物。
具体实施例方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
本发明醇溶性当归小分子多糖的制备1、当归100g-400g，切片，利用多能提取设备(罐内的压力0.5kg/cm2)加入13-20倍蒸馏水分3次提取，提取液减压浓缩至800～2400ml后备用。
2、第一次保温降解取上述浓缩液在常压下控制温度为105±1℃，保温降解1～5小时，当降解液比重达到1.15±0.1，约150～600ml，冷却至25±5℃。浓缩液用搅拌机于400～800prm转速下搅拌，同时加入乙醇除去醇不溶性杂质。-20±5℃冷藏24-72小时，取上清减压回收乙醇并浓缩至250～1000ml备用。
3、第二次保温降解取第一次提取液，在常压下保温降解1～4小时，保温降解温度控制在90±5℃，再浓缩至比重为1.15±0.1，约100-500ml，冷却至25±5℃，控制搅拌速度为300～600prm，加入乙醇除去醇不溶性杂质。提取液在-20±5℃条件下冷藏24-72小时。取上清液减压回收乙醇并浓缩至200～800ml备用。
4、第三次保温降解取第二次提取液，在常压下保温降解0.6～3.5小时，保温降解温度控制在85±5℃，当比重达到1.05±0.1，约80--400ml时，冷却至25±5℃，在转速为200～400rpm搅拌时，加入乙醇除去醇不溶性杂质。提取液在-20±5℃冷藏24-72小时，取上清液回收乙醇并浓缩至150～400ml备用。
5、第四次保温降解取第三次提取液，在常压下保温降解0.5～2.5小时，保温降解温度控制在80±5℃，当比重达到1.05±0.1，约80--400ml时，冷却至25±5℃备用。
6、精制上述保温降解液加水100～500ml稀释后，通过树脂过滤；滤液加丙酮约400～600ml进行萃取。萃取液在3000～5000rpm下离心，取沉淀冻干即得分子量在8000～24000之间的醇溶性当归小分子多糖。
实施例1当归200g，切片放入多能提取设备中，分三次加入蒸馏水(第一次1400ml，第二次1000ml，第三次800ml)，在提取罐内的压力达到0.5kg/cm2时开始计时提取(第一次40分钟，第二次30分钟，第三次20分钟)，合并三次提取液并用滤膜滤过；滤液浓缩至960ml后备用。
第一次保温降解取上述浓缩液在常压下，控制温度为105±1℃，保温降解2小时。保温降解液浓缩至比重为1.15±0.01、约200ml时，取出冷却至25±2℃。加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±1℃冷藏48小时，取上清滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至300ml后备用。
第二次保温降解取第一次提取液，在常压下保温降解，控制温度为90±2℃时保温1.5小时，当保温降解液比重为1.15±0.01、约180ml，冷却至25±2℃，将保温降解液加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±1℃冷藏48小时。取上清液减压回收乙醇并浓缩至250ml备用。
第三次保温降解取上述提取液，在常压下保温降解，温度控制在85±2℃时保温1.0小时，当保温降解液比重为1.05±0.01、约160ml，冷却至25±2℃，将保温降解液加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±1℃冷藏48小时，取上清液，减压回收乙醇备用。
第四次保温降解取第三次提取液，在常压下保温降解，温度控制在80±2℃时保温0.5小时，当保温降解液比重为1.05±0.01、约150ml，冷却至25±2℃备用。
精制取第四次保温降解液加蒸馏水稀释，通过树脂过滤，滤液加入丙酮约500ml进行萃取，萃取液在4000rpm下离心，取沉淀，冻干即得醇溶性当归小分子多糖。
上述醇溶性当归小分子多糖易溶于水，并易溶于乙醇，糖含量大于70％。经PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化测定在250nm处有紫外吸收峰。
HPLC检测结果上述醇溶性当归小分子多糖的单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，其中葡萄糖(保留时间38.08min)的百分比含量为55.16％，鼠李糖(保留时间25.86min)的百分比含量为1.74％，半乳糖(保留时间40.96min)的百分比含量为3.71％，甘露糖(保留时间22.27min)的百分比含量为25.04％，阿拉伯糖(保留时间42.65min)的百分比含量为13.14％，葡萄糖醛酸(保留时间30.62min)的百分比含量为1.21％。
采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射联用技术鉴定上述醇溶性当归小分子多糖相对分子质量范围，波长632.8nm，流速为0.800ml/min，出峰时间为23.258～35.642min，测定醇溶性当归小分子多糖的分子量在8000～24000之间。
实施例2当归水提取浓缩液制备同实施例1。
第一次保温降解将浓缩液在常压下，控制温度为105℃，保温降解5小时。保温降解液浓缩至比重为1.15±0.01、约500ml时，取出冷却至25±2℃。加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20℃冷藏72小时，取上清滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至900ml后备用。
第二次保温降解取第一次提取液，在常压下保温降解，控制温度为95℃时保温4小时，当保温降解液比重为1.15±0.01、约400ml，冷却至25±2℃，将保温降解液加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20℃冷藏36小时。取上清液减压回收乙醇并浓缩至750ml备用。
第三次保温降解取上述提取液，在常压下保温降解，温度控制在90℃时保温3.0小时，当保温降解液比重为1.05±0.01、约360ml，冷却至25±2℃，将保温降解液加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20℃冷藏24小时，取上清液，减压回收乙醇备用。
第四次保温降解取第三次提取液，在常压下保温降解，温度控制在85℃时保温2.5小时，当保温降解液比重为1.05±0.01、约350ml，冷却至25±2℃备用。
精制取第四次保温降解液加蒸馏水稀释，通过树脂过滤，滤液加入丙酮约500ml进行萃取，萃取液在4000rpm下离心，取沉淀，冻干即得醇溶性当归小分子多糖。
上述醇溶性当归小分子多糖易溶于水，并易溶于乙醇，糖含量大于70％。经PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化测定在250nm处有紫外吸收峰。
HPLC检测结果上述醇溶性当归小分子多糖的单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，其中葡萄糖(保留时间38.08min)的百分比含量为55.16％，鼠李糖(保留时间25.86min)的百分比含量为1.74％，半乳糖(保留时间40.96min)的百分比含量为3.71％，甘露糖(保留时间22.27min)的百分比含量为25.04％，阿拉伯糖(保留时间42.65min)的百分比含量为13.14％，葡萄糖醛酸(保留时间30.62min)的百分比含量为1.21％。
采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射联用技术鉴定上述醇溶性当归小分子多糖相对分子质量范围，波长632.8nm，流速为0.800ml/min，出峰时间为23.258～35.642min，测定醇溶性当归小分子多糖的分子量在8000～24000之间。
实施例3醇溶性当归小分子多糖(分子量8000～24000)的药理学实验，抗实验性脑缺血及再灌注损伤1.阻断Wistar大鼠大脑中动脉90min恢复再灌流，并持续滴注1.25％的醇溶性当归小分子多糖溶液7.5ml，第八天后处死动物，病理染色、图象分析，结果观察到醇溶性当归小分子多糖组动物脑梗塞部位体积显著性缩小。
2.线栓法制作Wistar大鼠大脑中动脉局灶性缺血模型，同时腹腔滴注1.25％醇溶性当归小分子多糖液7.5ml，每12小时一次，48小时后，用TUNEL法观察到醇溶性当归小分子多糖组缺血半暗带内凋亡细胞数显著减少，免疫组化法观察到凋亡抑制基因Bcl-2的表达显著增加，Bax基因的表达无变化。显示醇溶性当归小分子多糖通过增加Bcl-2的表达发挥抑制缺血性神经细胞凋亡的作用。
3.大鼠脑缺血模型阻断前30分钟经鼠尾静脉滴注1.25％醇溶性当归小分子多糖液5ml，缺血30min再灌60min后，醇溶性当归小分子多糖组动物脑组织匀浆内MDA含量、TXB2/PGFla比值明显下降，SOD含量明显回升，电镜下缺血组织超微结构破坏减轻。
4.抗自由基损伤醇溶性当归小分子多糖能降低脑缺血模型大鼠脑组织匀浆内丙二醛(MDA)的含量，增加SOD活性，清除氧自由基，抗脂质过氧化反应，升高PGI2，降低TXA2，调整PGI2/TXA2平衡。
上述结果表明，本发明的醇溶性当归小分子多糖(分子量8000～24000)具有明显的抗脑缺血作用。
权利要求
1.醇溶性当归小分子多糖，由下法制得先将当归用水提取得当归水提液，当归水提液浓缩后，在105±1℃保温降解1～5小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液A；在搅拌下向浓缩液A中加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在90±5℃保温降解1～4小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液B；在搅拌下向浓缩液B中加乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在85±5℃保温降解0.6～3.5小时，然后浓缩至比重为1.05±0.1，冷却得浓缩液C；在搅拌下向浓缩液C中加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在80±5℃保温降解0.5～2.5小时，浓缩至比重为1.05±0.1，冷却、纯化、冻干即得到分子量为8,000～24,000的醇溶性当归小分子多糖。
2.醇溶性当归小分子多糖的制备方法，其特征在于先将当归用水提取得当归水提液，当归水提液浓缩后，在105±1℃保温降解1～5小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液A；在搅拌下向浓缩液A中加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在90±5℃保温降解1～4小时，浓缩至比重为1.15±0.01，冷却得浓缩液B；在搅拌下向浓缩液B中加乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在85±5℃保温降解0.6～3.5小时，然后浓缩至比重为1.05±0.1，冷却得浓缩液C；在搅拌下向浓缩液C中加入乙醇除去醇不溶性杂质，-20±5℃冷藏24-72小时后取上清液，减压回收乙醇并在80±5℃保温降解0.5～2.5小时，浓缩至比重为1.05±0.1，冷却、纯化、冻干即得到分子量为8,000～24,000的醇溶性当归小分子多糖。
3.醇溶性当归小分子多糖在制备治疗脑缺血病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种醇溶性当归小分子多糖(分子量8000～24000)，由下述方法制得当归饮片用水提取，提取液在常压下，通过四次保温降解，同时用乙醇除去不溶于乙醇的杂质，－20℃左右冷藏后，纯化、冻干，得到分子量为8000～24000的醇溶性当归小分子多糖。本发明的醇溶性当归小分子多糖(分子量8000～24000)具有明显的抗脑缺血作用，可用于制备抗脑缺血的各种制剂。
文档编号A61P9/10GK1896109SQ20061001949
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者方世平, 王智勇, 孙曼春, 罗国庆, 吴建元, 袁娴芬 申请人:武汉大学