一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法

一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法
【专利摘要】本发明属于食品或医药【技术领域】，具体涉及一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法。所述组合物包括0.01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0.01-30重量份维生素、0.01-30重量份矿物质。本发明所述的组合物具有抗氧化，能够提神补脑、抗衰老、增强人体免疫力的作用。根据本发明的制成组合物保留松茸中的松茸醇等生理活性物质的组合物，该组合物可以用于制备口服液、药酒等。
【专利说明】一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖的制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于食品【技术领域】，具体涉及一种松茸维生素组合物及松茸醇、松茸多糖 制备方法。

【背景技术】
[0002] 松茸是世界上珍稀名贵的天然药用菌、我国二级重点保护野生物种。松茸含有18 种氨基酸、14种人体必需微量元素、49种活性营养物质、5种不饱和脂肪酸、8种维生素、2 种糖蛋白、丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多 糖、松茸多肽和全世界独一无二的抗癌物质--松茸醇，是世界上最珍贵的天然药用菌类。 松茸的营养价值和药用价值极高。现代医学表明，松茸具有提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗 糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜、促肠胃保肝脏等多种功效，因此又在全球范围内被广泛 用于研发药品、保健品和化妆品。


【发明内容】

[0003] 本发明的目的是利用发酵技术提供一种松茸维生素组合物。本发明主要解决的技 术问题是提供一种制作工艺简单、口味较好、抗氧化，能够提神补脑、抗衰老、增强人体免疫 力的含有松茸的组合物。根据本发明的制成组合物保留松茸中的松茸醇等生理活性物质的 组合物，该组合物可以用于制备口服液、药酒等。
[0004] 本发明的另一个目的是提供一种松茸醇制备方法，该方法采用共生发酵的方法制 得松茸醇。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种松茸多糖制备方法，该方法采用共生发酵的方法 制得松茸多糖。
[0006] 本发明通过下述技术方案实现的。
[0007] -种松茸维生素组合物，所述组合物包括0. 01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、 0. 01-30重量份维生素、0. 01-30重量份矿物质。
[0008] -种松茸维生素组合物，所述组合物包括0. 01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、 0. 01-30重量份维生素、0. 01-30重量份矿物质、0. 01-50重量份番茄红素和/或谷胱甘肽。 [0009] 所述的松茸多糖和/或松茸醇由松茸子实体或发酵松茸菌粉制备而得。
[0010] 所述的维生素为维生素 A、维生素 B族、维生素 C、维生素 D、维生素 E、维生素 K、维 生素 H、维生素 P、维生素 PP、维生素 M、维生素 T、维生素 U、生物素、胡萝卜素、类胡萝卜素、 叶酸、烟酰胺、泛酸中的一种或几种。
[0011] 所述的矿物质为I丐、铁、锌、硒、磷、钾、氯、镁、铜、猛、碘、铬、钥、镍、锡、娃、银、钻、 硫、钠、氟、锶中的一种或几种。
[0012] 所述的松茸醇由以下方法制备：
[0013] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵0. 1-180小时后，再 将松茸产香菌种子液按照体积比5-20 %接入共生发酵培养基中，在20-40°C，搅拌转速为 50-600转/分钟、通气速率为30-50升/分钟条件下发酵1-20天得共生发酵液，在发酵期 间向培养体系中加人蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐的一 种或几种；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉或麦芽膏粉5-100g/L、 葡萄糖10-200g/L、松针汁或松树愈伤组织匀浆液100-900ml/L制成；
[0014] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入酶制剂于40_55°C下进行水解1-6小时 后迅速加热到80-150°C并保温1-5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩或氮吹浓缩后在 30-80°C下真空干燥使含水量为5% -11%，得到发酵松茸粉；所述的酶制剂为纤维素酶、内 生青霉菌纤维素酶、风味蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、果胶酶或β -葡萄糖苷酶中的一种或几 种；
[0015] 步骤3 :将发酵松茸粉与浓度为60 % -100 %的乙醇按重量比100 :(1-200)的比例 混合后，于20-7(TC、20-80KHZ下超声波处理1-120分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉 置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力为20-50MPa、温度为30-60°C条件下萃取1-24小时， 收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
[0016] 步骤4 :将重量比为（0-5) :1 :(1-5)的海藻糖、蔗糖、葡萄糖，加入1-20倍的水中 混合均匀并加热至70-98°C成熔融状态，冷却到40-70°C时边搅拌边加入占水重量1-40% 的松茸醇粗提物，在2000-5000rpm转速下搅拌1-30分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物 料在20-40°C下均质0. 1-5小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥， 加工成松茸醇微胶囊粉；或将均质过的混合液置于-l〇-25°C温度下冷冻24小时后取出， 放入真空度20-50pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存 备用。
[0017] 所述的松茸多糖由以下方法制备：
[0018] 将发酵松茸粉按ml : g为（5-70) : 1加入水中，在超声功率100-500W、温度 70-KKTC的条件下提取1-3次，每次3-20min ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置 过夜，在2000-5000rpm下离心3-30min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0019] 所述的松茸产香菌为松茸子囊果组织中分离的菌种、松茸孢子、松茸内生菌、松茸 共生菌的一种或几种。
[0020] 所述的松茸产香菌种子液由以下方法制备：
[0021] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的 外生菌根各5-10g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡 10-60min，从中取100-1000 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧或厌氧条件下 用平板划线分离或稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行 发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲或菌液形式； 对菌株可以通过自然变异或人工诱导变异来提高松茸醇含量；所述筛选培养基由葡萄糖或 蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0. 1-20克/升、磷酸二氢钾0. 1-10克/ 升、硫酸镁〇. 01-10克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1_900晕升/升、琼脂1-30克/升， PH值4-9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0022] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20-40°C、转速0_150rpm 条件下振荡培养1-40小时，连续转接1-5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由 葡萄糖1_50克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900晕升/升、蛋白胨1-10克/升、酵 母膏1-10克/升、硫酸镁0. 1-5克/升、磷酸二氢钾0. 1-5克/升组成，PH4-10。
[0023] 所述的松树内生菌发酵液由以下方法制备：
[0024] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，20-40°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑 取不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20-40°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松 树内生菌；筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0. 1-20 克/升、磷酸二氢钾〇. 1-10克/升、硫酸镁〇. 01-10克/升、新鲜松茸汁或松茸产香菌发酵 液1-200克/升、琼脂1-30克/升组成，pH值4-9 ;
[0025] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，20_40°C活化1-48小时得到 松树内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养1-10天，得到松树内生菌发酵液； 活化培养基由葡萄糖20-50克/升，蛋白胨1-20克/升，硫酸镁1-10克/升，磷酸二氢钾 1-10克/升，琼脂10-30克/升组成，pH4-8。 实施例
[0026] 实施例1
[0027] 松茸维生素组合物包括0. Olg松茸醇、0. Olg维生素 A、0. 3g钙、0. Ig铁、2. 3g氯、 〇.8g 镁。
[0028] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0029] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，20°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由葡萄糖5克/升、蛋白胨1克/升、酵母膏0. 1克/升、磷酸二氢钾0. 1克 /升、硫酸镁〇. 01克/升、新鲜松茸汁1克/升、琼脂1克/升组成，PH值4 ;
[0030] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，20°C活化1小时得到松树内 生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养1天，得到松树内生菌发酵液；活化培养基 由葡萄糖20克/升，蛋白胨1克/升，硫酸镁1克/升，磷酸二氢钾1克/升，琼脂10克/ 升组成，pH4。
[0031] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0032] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各5g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡lOmin， 从中取100 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用平板划线分离纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲；所述筛选培养基由葡萄糖5克/升、蛋白胨1克/升、 酵母膏〇. 1克/升、磷酸二氢钾〇. 1克/升、硫酸镁〇. Ol克/升、松针汁1毫升/升、琼脂 1克/升，PH值4组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0033] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20°C、转速0_150rpm条件 下振荡培养1小时，连续转接1次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖1克 /升、松针汁1毫升/升、蛋白胨1克/升、酵母膏1克/升、硫酸镁〇. 1克/升、磷酸二氢钾 〇. 1克/升组成，PH4。
[0034] 松茸醇的制备方法：
[0035] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵1小时后，再将松茸产 香菌种子液按照体积比5%接入共生发酵培养基中，在20°C，搅拌转速为50转/分钟、通气 速率为30升/分钟条件下发酵1天得共生发酵液，所述的共生发酵培养基由经过破壁处理 的啤酒废酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、松针汁lOOml/L制成；
[0036] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入纤维素酶于40°C下进行水解1小时后迅 速加热到80°C并保温1小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在30°C下真空干燥使含水 量为5%，得到发酵松茸粉；
[0037] 步骤3:将发酵松茸粉10(^与浓度为60%的乙醇4混合后，于201：、201(取下超 声波处理1分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力 为20MPa、温度为30°C条件下萃取1小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
[0038] 步骤4 :将海藻糖5g、鹿糖5g、葡萄糖5g，加入10倍的水中混合均勻并加热至90°C 成熔融状态，冷却到40°C时边搅拌边加入占水重量10%的松茸醇粗提物，在2000rpm转速 下搅拌10分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在20°C下均质0. 5小时；将均质过的混 合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉，放入橡木桶储存备用。
[0039] 实施例2
[0040] 松茸维生素组合物包括IOg松茸多糖、Ig维生素 B族、Ig维生素 C、0. 7g维生素 E、I. 8g维生素 H、I. 2g胡萝卜素、0. 5g叶酸、3g烟酰胺、0. Ig钙、2. 2g磷、2. 8g钾、0. 7g镁、 I. 4g 锌、0· 04g 铬、0· 03g 钒、0· 04g 钴、3. 5 硫、0· 08g 锶。
[0041] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0042] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，40°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，40°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由蔗糖300克/升、蛋白胨100克/升、酵母膏20克/升、磷酸二氢钾10克 /升、硫酸镁10克/升、松茸产香菌发酵液200克/升、琼脂30克/升组成，pH值9 ;
[0043] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，40°C活化48小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养10天，得到松树内生菌发酵液；活化培 养基由葡萄糖50克/升，蛋白胨20克/升，硫酸镁10克/升，磷酸二氢钾10克/升，琼脂 30克/升组成，pH8。
[0044] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0045] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的 外生菌根各l〇g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡 60min，从中取1000 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法 纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇 的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌液形式；所述筛选培养基由蔗糖300克/升、蛋白 胨100克/升、酵母膏20克/升、磷酸二氢钾10克/升、硫酸镁10克/升、松树内生菌发 酵液900毫升/升、琼脂30克/升，pH值9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0046] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在40°C、转速150rpm条件下 振荡培养40/小时，连续转接5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖50 克/升、松树内生菌发酵液900毫升/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁5克 /升、磷酸二氢钾5克/升组成，pHIO。
[0047] 松茸多糖的制备方法：
[0048] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵10小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比20%接入共生发酵培养基中，在40°C，搅拌转速为600转/分钟、 通气速率为50升/分钟条件下发酵20天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗 糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由麦 芽膏粉100g/L、葡萄糖200g/L、松树愈伤组织匀浆液900ml/L制成；
[0049] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入果胶酶于55°C下进行水解6小时后迅速 加热到150°C并保温5小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在80°C下真空干燥使含水 量为11%，得到发酵松茸粉；
[0050] 步骤3 :将发酵松茸粉IOg加入50ml水中，在超声功率500W、温度100°C的条件下 提取3次，每次3min ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置过夜，在2000rpm下离心 30min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0051] 实施例3
[0052] 松茸维生素组合物包括19g松茸醇、23g松茸多糖、0. 3g维生素 A、0. 9g维生素 P、 7. 3g 维生素 M、5g 胡萝卜素、3. 8g铁、2. 3g锌、6. 8g氯、(λ 2g碘、(λ Olg铬、(λ 7g镁、(λ 09g铜、 0. Olg 猛。
[0053] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0054] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，30°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，30°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由蔗糖100克/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、磷酸二氢钾1克/ 升、硫酸镁〇. 05克/升、新鲜松茸汁10克/升、琼脂10克/升组成，pH值5 ;
[0055] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，30°C活化10小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养3天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖30克/升，蛋白胨5克/升，硫酸镁2克/升，磷酸二氢钾3克/升，琼脂15克 /升组成，PH5。
[0056] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0057] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根6g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡20min，从 中取300 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用平板划线分离纯化后获 得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即 为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由蔗糖50克/升、蛋白胨30克/ 升、酵母膏10克/升、磷酸二氢钾2克/升、硫酸镁3克/升、松针汁150毫升/升、琼脂15 克/升，PH值6组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0058] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在30°C、转速IOOrpm条件下 振荡培养5小时，连续转接3次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖20克 /升、松针汁700毫升/升、蛋白胨3克/升、酵母膏7克/升、硫酸镁2克/升、磷酸二氢钾 1.5克/升组成，pH9。
[0059] 松茸醇的制备方法：
[0060] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵80小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比10%接入共生发酵培养基中，在30°c，搅拌转速为200转/分钟、 通气速率为35升/分钟条件下发酵15天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗 糖、葡萄糖、松针汁、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤 酒废酵母粉l〇g/L、葡萄糖20g/L、松针汁300ml/L制成；
[0061] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入β -葡萄糖苷酶于50°C下进行水解2小 时后迅速加热到100°c并保温1. 5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在50°C下真空 干燥使含水量为8%，得到发酵松茸粉；
[0062] 步骤3 :将发酵松茸粉IOOg与浓度为100%的乙醇150g混合后，于30°C、40KHz下 超声波处理100分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在 压力为25MPa、温度为36°C条件下萃取12小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗 提物；
[0063] 步骤4 :将海藻糖0. 5g、鹿糖lg、葡萄糖2. 5g，加入40g水中混合均勻并加热至 78°C成熔融状态，冷却到47°C时边搅拌边加入占水重量20%的松茸醇粗提物，在2500rpm 转速下搅拌13分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在24°C下均质0. 5小时；将均质过 的混合液置于-KTC温度下冷冻24小时后取出，放入真空度20pa的冷冻干燥器中冻干，粉 碎后得到松茸醇微胶囊粉，放入橡木桶储存备用。
[0064] 松茸多糖的制备方法：
[0065] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵100小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比18%接入共生发酵培养基中，在30°C，搅拌转速为550转/分钟、 通气速率为40升/分钟条件下发酵8天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗 糖、松针汁、麸皮汁、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由麦芽膏粉80g/L、 葡萄糖120g/L、松树愈伤组织匀浆液500ml/L制成；
[0066] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入芽孢杆菌蛋白酶于48°C下进行水解3. 5 小时后迅速加热到90°C并保温2. 7小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在40°C下真空 干燥使含水量为8%，得到发酵松茸粉；
[0067] 步骤3 :将发酵松茸粉5g按加入水350ml中，在超声功率370W、温度78°C的条件 下提取2次，每次IOmin ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置过夜，在2800rpm下离 心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0068] 实施例4
[0069] 松茸维生素组合物包括90g松茸醇、0. 8g维生素 A、3. 2g维生素 C、0. 7g维生素 E、 I. 2g维生素 PP、0. 3g维生素 T、5. 2g生物素、2. 3g胡萝卜素、0. 9g类胡萝卜素、I. 3g叶酸、 〇· 8g 泛酸、4. 7g 铁、2. 3g 锌、6. 8g 氯、0· 7g 镁、2. Ig 铜、0· 5g 番茄红素。
[0070] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0071] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，25°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，25°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏5克/升、磷酸二氢钾2克 /升、硫酸镁5. 5克/升、松茸产香菌发酵液180克/升、琼脂20克/升组成，pH值7 ;
[0072] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，40°C活化20小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养7天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖30克/升，蛋白胨18克/升，硫酸镁4克/升，磷酸二氢钾2克/升，琼脂30 克/升组成，PH6。
[0073] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0074] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各7g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡40min， 从中取800 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用稀释涂平板法纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨70 克/升、酵母膏6克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁2克/升、松针汁300毫升/升、琼 脂1-30克/升，pH值5组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0075] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在40°C、转速0_150rpm条件 下振荡培养20小时，连续转接4次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30 克/升、松针汁600毫升/升、蛋白胨4克/升、酵母膏1. 8克/升、硫酸镁0. 9克/升、磷 酸二氢钾3. 8克/升组成，pH7。
[0076] 松茸醇的制备方法：
[0077] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵130小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比8 %接入共生发酵培养基中，在28°C，搅拌转速为500转/分钟、 通气速率为45升/分钟条件下发酵16天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗 糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤 酒废酵母粉80g/L、葡萄糖150g/L、松针汁850ml/L制成；
[0078] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入纤维素酶于50°C下进行水解5. 5小时后 迅速加热到90°C并保温3. 7小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在60°C下真空干燥使 含水量为10%，得到发酵松茸粉；
[0079] 步骤3:将发酵松茸粉1(^与200(^浓度为70%的乙醇按混合后，于501：、601(他 下超声波处理100分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中， 在压力为35MPa、温度为50°C条件下萃取18小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇 粗提物；
[0080] 步骤4 :将海藻糖50g、鹿糖10g、葡萄糖40g，加入IOOg水中混合均勻并加热至 88°C成熔融状态，冷却到60°C时边搅拌边加入占水重量25%的松茸醇粗提物，在4500rpm 转速下搅拌8分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在20°C下均质3小时；将均质过的 混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备 用。
[0081] 实施例5
[0082] 松茸维生素组合物包括20g松茸醇、3g维生素 D、4g维生素 E、5. 2g维生素 K、2. 8g 维生素 Ρ、〇· 7g 维生素 ΡΡ、0· 03g 硒、3. 2g 氯、0· 05g 镁、0· 09g 铜、I. 2g 碘、0· 07g 铬、0· 05g 钥、0· 02g 镍、0· Olg 锡、0· 03g 硅、0· Olg 钒、0· 02g 钴、2. 3g 硫、3. 2g 钠、0· 02g 氟、0· 04g 锶、 〇. Olg谷胱甘肽。
[0083] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0084] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，35°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，35°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨1-1090克/升、酵母膏5克/升、磷酸二氢钾 2克/升、硫酸镁0. 5克/升、新鲜松茸汁150克/升、琼脂18克/升组成，pH值4-9 ;
[0085] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35°C活化25小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养3天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖40克/升，蛋白胨5克/升，硫酸镁9克/升，磷酸二氢钾2.5克/升，琼脂25 克/升组成，PH8。
[0086] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0087] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各9g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡40min， 从中取500/μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用稀释涂平板法纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌液形式；所述筛选培养基由葡萄糖250克/升、蛋白胨50 克/升、酵母骨1克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁5克/升、松树内生菌发酵液650晕 升/升、琼脂2克/升，pH值5组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0088] 步骤2:将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在2 : 5°C、转速IOOrpm条 件下振荡培养20小时，连续转接4次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖 20克/升、松针汁900毫升/升、蛋白胨10克/升、酵母膏10克/升、硫酸镁0. 1克/升、 磷酸二氢钾〇. 1克/升组成，pHIO。
[0089] 松茸醇的制备方法：
[0090] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵2小时后，再将松茸产 香菌种子液按照体积比9%接入共生发酵培养基中，在25°C，搅拌转速为160转/分钟、通 气速率为45升/分钟条件下发酵19天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗糖、 葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过 破壁处理的啤酒废酵母粉90g/L、葡萄糖180g/L、松树愈伤组织匀浆液500ml/L制成；
[0091] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入内生青霉菌纤维素酶于55°C下进行水解 2小时后迅速加热到140°C并保温4. 5小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在60°C下 真空干燥使含水量为9%，得到发酵松茸粉；
[0092] 步骤3:将发酵松茸粉2(^与浓度为98%的乙醇300(^混合后，于681：、701(取下 超声波处理90分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压 力为40MPa、温度为55°C条件下萃取18小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提 物；
[0093] 步骤4 :将海藻糖8g、蔗糖10g、葡萄糖30g，加入1-20倍的水中混合均匀并加热至 95°C成熔融状态，冷却到65°C时边搅拌边加入占水重量20 %的松茸醇粗提物，在4500rpm 转速下搅拌3分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在30°C下均质2. 5小时；将均质过 的混合液置于：_25°C温度下冷冻24小时后取出，放入真空度40pa的冷冻干燥器中冻干，粉 碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
[0094] 实施例6
[0095] 松茸维生素组合物包括15g松茸多糖、0. 7g维生素 PP、2. 7g维生素 M、l. 5g维生 素 T、3. Ig维生素 U、4.2g生物素、0.6g胡萝卜素、2. Ig类胡萝卜素、5.2g叶酸、Ig烟酰胺、 Ig 泛酸、4. 6g |丐、3. 8g 铁、2. Ig 锌、0. 09g 硒、I. 6g 磷、5. 2g 钾、2. 7g 氯、3g 番爺红素。
[0096] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0097] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75 %的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，38°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，25°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由葡萄糖200克/升、蛋白胨30克/升、酵母膏15克/升、磷酸二氢钾7克 /升、硫酸镁1克/升、新鲜松茸汁200克/升、琼脂10克/升组成，pH值7 ;
[0098] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35°C活化28小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养8天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖30克/升，蛋白胨16克/升，硫酸镁3克/升，磷酸二氢钾2克/升，琼脂20 克/升组成，PH4. 5。
[0099] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0100] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各8g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡50min， 从中取200 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖180克/升、蛋白胨60 克/升、酵母膏〇. 5克/升、磷酸二氢钾2. 5克/升、硫酸镁3. 5克/升、松树内生菌发酵液 700毫升/升、琼脂18克/升，pH值6组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0101] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20°C、转速150rpm条件下 振荡培养20小时，连续转接3次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克 /升、松针汁750毫升/升、蛋白胨9克/升、酵母膏3克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸二氢 钾〇. 5克/升组成，pH5。
[0102] 松茸多糖的制备方法：
[0103] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵10小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比12%接入共生发酵培养基中，在25°C，搅拌转速为400转/分钟、 通气速率为40升/分钟条件下发酵16天得共生发酵液；所述的共生发酵培养基由经过破 壁处理的啤酒废酵母粉80g/L、葡萄糖170g/L、松针汁550ml/L制成；
[0104] 步骤2:将步骤1所得的共生发酵液加入风味蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶于50°C下进 行水解2. 6小时后迅速加热到IKTC并保温1. 5小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后 在75°C下真空干燥使含水量为6%，得到发酵松茸粉；
[0105] 步骤3 :将发酵松茸粉3g加入水60ml中，在超声功率450W、温度90°C的条件下提 取1次，每次20min ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置过夜，在4500rpm下离心 lOmin，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0106] 实施例7
[0107] 松茸维生素组合物包括9g松茸多糖、Ig维生素 C、3g维生素 E、0.8g维生素 K、2. Ig 维生素 P、〇. 9g维生素 PP、3. 2g维生素 M、2. Ig维生素 U、7. Ig胡萝卜素、0. 3g叶酸、1.7g烟 酰胺、3. 9g钙、0· 08g硒、2. 2g磷、I. 8g钾、2. 8g氯、0· 2g铜、0· 02g锰、0· 7g碘、2. 7g硫、3. 2g 纳、IOg谷胱;甘肤。
[0108] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0109] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，40°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，35°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由蔗糖150克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏2克/升、磷酸二氢钾3克/ 升、硫酸镁〇. 9克/升、新鲜松茸汁180克/升、琼脂17克/升组成，pH值7. 5 ;
[0110] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35°C活化28小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养7天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖45克/升，蛋白胨14克/升，硫酸镁7克/升，磷酸二氢钾3克/升，琼脂20 克/升组成，PH4. 5。
[0111] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0112] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各7g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡45min， 从中取800 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖300克/升、蛋白胨20 克/升、酵母膏6克/升、磷酸二氢钾3克/升、硫酸镁2克/升、松针汁750毫升/升、琼 脂28克/升组成，pH值8. 5 ;去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0113] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在30°C、转速130rpm条件下 振荡培养28小时，连续转接3次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克 /升、松树内生菌发酵液650晕升/升、蛋白胨7克/升、酵母骨4. 5克/升、硫酸镁3. 8克 /升、磷酸二氢钾2. 5克/升组成，pH6. 8。
[0114] 松茸多糖的制备方法：
[0115] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵18小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比9%接入共生发酵培养基中，在30°C，搅拌转速为550转/分钟、 通气速率为48升/分钟条件下发酵12天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入葡 萄糖、麸皮汁、蛋白胨、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废 酵母粉60g/L、葡萄糖120g/L、松树愈伤组织匀浆液700ml/L制成；
[0116] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入果胶酶于45°C下进行水解3. 5小时后迅 速加热到120°C并保温2. 8小时；将酶解后的共生发酵液氮吹浓缩后在50°C下真空干燥使 含水量为10%，得到发酵松茸粉；
[0117] 步骤3 :将发酵松茸粉30g加入水IOOOg中，在超声功率380W、温度KKTC的条件 下提取3次，每次IOmin ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置过夜，在3000rpm下离 心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0118] 实施例8
[0119] 松茸维生素组合物包括30g松茸醇、45g松茸多糖、Ig维生素 A、I. 3g维生素 B族、 0. 7g维生素 C、0. 9g维生素 D、2. 4g维生素 E、l. 7g维生素 K、l. 6g维生素 H、lg维生素 P、 〇. 9g维生素 PP、Ig维生素 M、2. 3g维生素 T、I. 5g维生素 U、I. Ig生物素、I. 9g胡萝卜素、 3. Ig类胡萝卜素、Ig叶酸、2g烟酰胺、Ig泛酸、3. Olg钙、2. 3g铁、2. 4g锌、0. 3g硒、I. 2g磷、 2. 3g 钾、2. 7g 氯、0· 3g 镁、0· 05g 铜、0· 02g 锰、0· 2g 碘、0· Olg 铬、0· Olg 钥、0· Olg 镍、0· Olg 锡、0· 02g硅、0· Olg 钒、0· 03g 钴、3. 5 硫、3. 6g钠、0· 02 氟、0· Olg 锶、23g 番茄红素、27g 谷胱 甘肽。
[0120] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0121] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，400恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由葡萄糖100克/升、蛋白胨60克/升、酵母膏2克/升、磷酸二氢钾3克 /升、硫酸镁3. 5克/升、新鲜松茸汁180克/升、琼脂15克/升组成，pH值8. 5 ;
[0122] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35°C活化24小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养5天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖40克/升，蛋白胨18克/升，硫酸镁3. 5克/升，磷酸二氢钾7. 8克/升，琼脂 25克/升组成，pH5. 5。
[0123] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0124] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各8g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡45min， 从中取950 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在厌氧条件下用稀释涂平板法纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲形式；所述筛选培养基由葡萄糖180克/升、蛋白胨75 克/升、酵母膏13克/升、磷酸二氢钾7克/升、硫酸镁3. 8克/升、松树内生菌发酵液550 毫升/升、琼脂23克/升，pH值6. 5组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0125] 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在35°C、转速150rpm条件下 振荡培养30小时，连续转接4次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖44克 /升、松树内生菌发酵液700晕升/升、蛋白胨5克/升、酵母骨4. 8克/升、硫酸镁3. 8克 /升、磷酸二氢钾2. 8克/升组成，pH8. 8。
[0126] 松茸醇的制备方法：
[0127] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵100小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比8 %接入共生发酵培养基中，在25°C，搅拌转速为350转/分钟、 通气速率为30升/分钟条件下发酵7天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗 糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经 过破壁处理的啤酒废酵母粉70g/L、葡萄糖130g/L、松树愈伤组织匀浆液600ml/L制成；
[0128] 步骤2:将步骤1所得的共生发酵液加入纤维素酶、风味蛋白酶于55°C下进行水解 3小时后迅速加热到120°C并保温3. 8小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩在40°C下真 空干燥使含水量为6%，得到发酵松茸粉；
[0129] 步骤3 :将发酵松茸粉20g与浓度为75 %的乙醇3500g混合后，于45°C、75KHz下超 声波处理80分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取釜中，在压力 为40MPa、温度为30°C条件下萃取4小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物；
[0130] 步骤4 :将海藻糖3g、鹿糖lg、葡萄糖4. 5g，加入水150g中混合均勻并加热至95°C 成熔融状态，冷却到50°C时边搅拌边加入占水重量35%的松茸醇粗提物，在5000rpm转速 下搅拌20分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在40°C下均质1小时；将均质过的混合 液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥，加工成松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
[0131] 松茸多糖的制备方法：
[0132] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵20小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比15%接入共生发酵培养基中，在30°C，搅拌转速为480转/分钟、 通气速率为30升/分钟条件下发酵8天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入松针 汁、维生素、无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉30g/L、葡萄 糖ll〇g/L、松树愈伤组织匀浆液200ml/L制成；
[0133] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入芽孢杆菌蛋白酶、β -葡萄糖苷酶于55°C 下进行水解3小时后迅速加热到130°C并保温3. 5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩 后在60°C下真空干燥使含水量为6. 5%，得到发酵松茸粉；
[0134] 步骤3 :将发酵松茸粉50g加入水IOOOml中，在超声功率450W、温度80°C的条件 下提取3次，每次20min ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置过夜，在2000rpm下离 心20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0135] 实施例9
[0136] 松茸维生素组合物包括30g松茸醇、60g松茸多糖、3g维生素 A、3g维生素 E、5g维 生素 K、7g维生素 PP、Ig维生素 T、4g类胡萝卜素、Ig叶酸、6g泛酸、0. 9g铁、0. 7g锌、0. 07g 硒、I. 3g磷、L 28g钾、3. Ig氯、(λ 7g镁、(λ 09g铜、(λ Olg锰、(λ 5g番茄红素、3. 8谷胱甘肽。
[0137] 松树内生菌发酵液的制备方法：
[0138] 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表 面尘土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用 质量分数为〇. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫 米的小块分别接种到PDA培养基平板上，30°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不 同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，35°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树内生 菌；筛选培养基由葡萄糖200克/升、蛋白胨50克/升、酵母膏13克/升、磷酸二氢钾7. 3 克/升、硫酸镁〇. 9克/升、新鲜松茸汁170克/升、琼脂22克/升组成，pH值6. 5 ;
[0139] 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，35°C活化36小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养7天，得到松树内生菌发酵液；活化培养 基由葡萄糖45克/升，蛋白胨18克/升，硫酸镁3克/升，磷酸二氢钾6克/升，琼脂22 克/升组成，PH5。
[0140] 松茸产香菌种子液的制备方法：
[0141] 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各8g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡40min， 从中取700 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧条件下用平板划线分离纯化后 获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株 即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌液形式；所述筛选培养基由蔗糖50克/升、蛋白胨10克 /升、酵母骨10克/升、磷酸二氢钾1克/升、硫酸镁1克/升、松树内生菌发酵液900晕升 /升、琼脂10克/升，PH值4. 9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基；
[0142] 步骤2:将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在30°C、转速120rpm条件下 振荡培养30小时，连续转接5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄糖30克 /升、松树内生菌发酵液700毫升/升、蛋白胨8克/升、酵母膏3克/升、硫酸镁1. 5克/ 升、磷酸二氢钾2. 5克/升组成，pH9. 5。
[0143] 松茸醇的制备方法：
[0144] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵38小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比15%接入共生发酵培养基中，在35°C，搅拌转速为350转/分钟、 通气速率为40升/分钟条件下发酵18天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蛋 白胨、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由麦芽膏粉l〇g/L、葡萄糖150g/L、 松针汁350ml/L制成；
[0145] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入内生青霉菌纤维素酶于40°C下进行水解 3小时后迅速加热到IKTC并保温3. 5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在50°C下 真空干燥使含水量为5%，得到发酵松茸粉；
[0146] 步骤3 :将发酵松茸粉IOOg与浓度为65%的乙醇IOOOOg的比例混合后，于50°C、 40KHz下超声波处理110分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于超临界二氧化碳萃取 釜中，在压力为25MPa、温度为55°C条件下萃取10小时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松 鸾醇粗提物；
[0147] 步骤4 :将海藻糖0. 8g、鹿糖lg、葡萄糖3g，加入1-20倍的水中混合均勻并加热至 75°C成熔融状态，冷却到60°C时边搅拌边加入占水重量30 %的松茸醇粗提物，在4000rpm 转速下搅拌15分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物料在30°C下均质3. 5小时；将均质过 的混合液置于-15°C温度下冷冻24小时后取出，放入真空度30pa的冷冻干燥器中冻干，粉 碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存备用。
[0148] 松茸多糖的制备方法：
[0149] 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵90小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比10%接入共生发酵培养基中，在28°C，搅拌转速为300转/分钟、 通气速率为38升/分钟条件下发酵16天得共生发酵液，在发酵期间向培养体系中加入蔗 糖、葡萄糖、松针汁、酵母膏、维生素和无机盐；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤 酒废酵母粉60g/L、葡萄糖50g/L、松针汁200ml/L制成；
[0150] 步骤2 :将步骤1所得的共生发酵液加入芽孢杆菌蛋白酶于48°C下进行水解4. 5 小时后迅速加热到IKTC并保温4. 5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩后在60°C下真 空干燥使含水量为11%，得到发酵松茸粉；
[0151] 步骤3 :将发酵松茸粉7g加入水300ml中，在超声功率200W、温度80°C的条件下 提取3次，每次20min ;将提取液减压浓缩并加入乙醇后于4°C静置过夜，在4000rpm下离心 20min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松茸多糖。
[0152] 试验例
[0153] 试验例1 :全身免疫的活化-迟发型超敏反应
[0154] 为了检测对肿瘤抗原产生的特异的全身免疫应答的活化，进行迟发型超敏反应的 评价。对迟发型超敏反应的评价方法进行说明。
[0155] 试验药物：取实施例1-9所得组合物各lg，加入IOOml注射用水中，待用。
[0156] 实验方法：以腹水的形式采取Sarcomal80肿瘤细胞，该细胞在ICR小鼠（雌性，4 周龄）腹腔内移植传代，用生理盐水调成3xl07/ml。用25G注射器将该细胞稀释液移植到 ICR小鼠（雌性，4周龄）的右腰背部皮下，0.1ml/只。
[0157] 次日，根据体重进行分组（7只/组），进行个体标记后，开始施用药物1-9组。1 日1次经口施用，施用5次后休息2天，共进行9次。每次的施用量是0.1ml/kg。
[0158] 各组提供7只小鼠，正常小鼠提供3只，进行迟发型超敏反应（DTH=Delayer Type Hypersensitivity)试验。即，在肿瘤移植后第9天（开始施用后第8天），向右足垫注射 50 μ 1生理盐水作为对照，向左足垫注射50 μ 1将Sarcomal80细胞进行3M KCl可溶化法或 冻融法（处理5xl07/ml细胞悬浮液）而得到的肿瘤抗原溶液，24小时后，测定左右足的厚 度，根据下面的公式算出足的肿胀程度，进行DTH反应的检测。
[0159] 足肿（mm)-左足厚度（mm)-右足厚度（mm)
[0160] 表1 :迟发型超敏反应：足肿（mm)
[0161]

【权利要求】
1. 一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述组合物包括0. 01-90重量份松茸醇和/或 松茸多糖、〇. 01-30重量份维生素、0. 01-30重量份矿物质。
2. 根据权利要求1所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述组合物包括 0. 01-90重量份松茸醇和/或松茸多糖、0. 01-30重量份维生素、0. 01-30重量份矿物质、 0. 01-50重量份番茄红素和/或谷胱甘肽。
3. 根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的松茸多糖和/ 或松茸醇由松茸子实体或发酵松茸粉制备而得。
4. 根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的维生素为维 生素 A、维生素 B族、维生素 C、维生素 D、维生素 E、维生素 K、维生素 H、维生素 P、维生素 PP、 维生素 M、维生素 T、维生素 U、生物素、胡萝卜素、类胡萝卜素、叶酸、烟酰胺、泛酸中的一种 或几种。
5. 根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的矿物质为钙、 铁、锌、硒、磷、钾、氯、镁、铜、锰、碘、铬、钥、镍、锡、硅、钒、钴、硫、钠、氟、锶中的一种或几种。
6. 根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的松茸醇由以 下方法制备： 步骤1 :将松树内生菌发酵液接种到共生发酵培养基中发酵0. 1-180小时后，再将松茸 产香菌种子液按照体积比5-20%接入共生发酵培养基中，在20-40°C，搅拌转速为50-600 转/分钟、通气速率为30-50升/分钟条件下发酵1-20天得共生发酵液，在发酵期间向培 养体系中加入蔗糖、葡萄糖、松针汁、麸皮汁、蛋白胨、酵母膏、维生素和无机盐的一种或几 种；所述的共生发酵培养基由经过破壁处理的啤酒废酵母粉或麦芽膏粉5-100g/L、葡萄糖 10-200g/L、松针汁或松树愈伤组织匀浆液100-900ml/L制成； 步骤2 :将步骤1所得共生发酵液加入酶制剂于40-55°C下进行水解1-6小时后迅速加 热到80-150°C并保温1-5小时；将酶解后的共生发酵液减压浓缩或氮吹浓缩后在30-80°C 下真空干燥使含水量为5% -11%，得到发酵松茸粉；所述的酶制剂为纤维素酶、内生青霉 菌纤维素酶、风味蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、果胶酶或β -葡萄糖苷酶中的一种或几种； 步骤3 :将发酵松茸粉与浓度为60% -100%的乙醇按重量比100 : (1-200)的比例混合 后，于20-70?、20-80ΚΗΖ下超声波处理1-120分钟；将经超声波处理过的发酵松茸粉置于 超临界二氧化碳萃取釜中，在萃取釜压力为20-50MPa、温度为30-60°C条件下萃取1-24小 时，收集萃取液并进行减压浓缩得到松茸醇粗提物； 步骤4:将重量比为（0-5) : 1 : (1-5)的海藻糖、蔗糖、葡萄糖，加入1-20倍的水中 混合均匀并加热至70-98°C成熔融状态，冷却到40-70°C时边搅拌边加入占水重量1-40% 的松茸醇粗提物，在2000-5000rpm转速下搅拌1-30分钟，采用高压均质设备将搅拌好的物 料在20-40°C下均质0. 1-5小时；将均质过的混合液采用气流式喷雾干燥机进行喷雾干燥， 加工成松茸醇微胶囊粉；或将均质过的混合液置于-l〇-25°C温度下冷冻24小时后取出， 放入真空度20-50pa的冷冻干燥器中冻干，粉碎后得到松茸醇微胶囊粉；放入橡木桶储存 备用。
7. 根据权利要求1、2所述的一种松茸维生素组合物，其特征在于，所述的松茸多糖由 以下方法制备： 将权利要求6步骤2所得的发酵松茸粉按ml :g为（5-70) : 1加入水中，在超声功率 100-500W、温度70-KKTC的条件下提取1-3次，每次3-20min ;将提取液减压浓缩并加入乙 醇后于4°C静置过夜，在2000-5000rpm下离心3-30min，经无水乙醇清洗后真空干燥即得松 茸多糖。
8. 根据权利要求6所述的松茸产香菌，其特征在于，所述的松茸产香菌为松茸子囊果 组织中分离的菌种、松茸孢子、松茸内生菌、松茸共生菌的一种或几种。
9. 根据权利要求6所述的松茸产香菌，其特征在于，所述的松茸产香菌种子液由以下 方法制备： 步骤1 :取松茸子囊果的组织块、表皮、表皮土壤，土壤中菌丝及松茸与宿主的外 生菌根各5-10g，消毒后用无菌研钵磨成浆状，在无菌条件下加入到无菌蒸馏水中震荡 10-60min，从中取100-1000 μ L液体滴加到筛选培养基上均匀涂开，在有氧或厌氧条件下 用平板划线分离或稀释涂平板法纯化后获得一批微生物菌株，然后用液体筛选培养基进行 发酵实验从中筛选出富产松茸醇的菌株即为筛选的松茸产香菌，菌种为菌曲或菌液形式； 所述筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0. 1-20克/ 升、磷酸二氢钾〇. 1-10克/升、硫酸镁〇. 01-10克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900 毫升/升、琼脂1-30克/升，pH值4-9组成；去掉琼脂即为液体筛选培养基； 步骤2 :将松茸产香菌斜面菌种接种到种子培养基中，在20-40°C、转速0_150rpm条件 下振荡培养1-40小时，连续转接1-5次后制得松茸产香菌种子液；所述种子培养基由葡萄 糖1-50克/升、松针汁或松树内生菌发酵液1-900晕升/升、蛋白胨1-10克/升、酵母骨 1-10克/升、硫酸镁〇. 1-5克/升、磷酸二氢钾0. 1-5克/升组成，pH4-10。
10. 根据权利要求6所述的松树内生菌发酵液，其特征在于，由以下方法制备： 步骤1 :选取共生有松茸的松树的皮、叶、茎、花、果实及菌根，先用无菌水冲洗表面尘 土，然后在无菌条件下用体积比为75%的乙醇浸泡30秒，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量 分数为0. 1 %的氯化汞浸泡30秒，无菌水冲洗3-5次后用无菌刀将其剪成3毫米*3毫米 的小块分别接种到PDA培养基平板上，20-40°C恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取 不同形态的菌落，转到筛选培养基斜面，20-40°C纯化培养得到的优势菌株即为筛选的松树 内生菌；筛选培养基由葡萄糖或蔗糖5-300克/升、蛋白胨1-100克/升、酵母膏0. 1-20克 /升、磷酸二氢钾〇. 1-10克/升、硫酸镁〇. 01-10克/升、新鲜松茸汁或松茸产香菌发酵液 1-200克/升、琼脂1-30克/升组成，pH值4-9 ; 步骤2 :将分离的松树内生菌接种于活化培养基斜面，20-40°C活化1-48小时得到松树 内生菌斜面菌种，将其接种到MS液体培养基中培养1-10天，得到松树内生菌发酵液；活化 培养基由葡萄糖20-50克/升，蛋白胨1-20克/升，硫酸镁1-10克/升，磷酸二氢钾1-10 克/升，琼脂10-30克/升组成，pH4-8。
【文档编号】A23L1/30GK104286828SQ201410491277
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】杜超峰 申请人:杜超峰