专利名称：臭参多糖硫酸酯及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性臭参多糖硫酸酯及用途。该臭参多糖硫酸酯具有较强的抗人艾滋病病毒的活性，毒性低，在制备预防或治疗人艾滋病病毒感染的杀微生物剂方面有很好的应用前景。
背景技术：
不少学者注意到硫酸酯化多糖对多种囊膜病毒包括艾滋病病毒(HIV)等有广谱抗病毒作用。由于这类硫酸酯多糖经口服后难以被消化道粘膜吸收，如果通过注射途径用药，在血液内多糖又往往会引起一定的副作用，因此一直未能作为治疗艾滋病的药物上市。国外已将此类化合物作为阴道或直肠局部用药(即microbicides杀微生物剂)进入III期临床试验，并有良好的应用前景。特别是全球艾滋病毒感染者中，90％是通过性传播引起的。且性传播使越来越多的妇女感染HIV，全球新感染者中，妇女的比例逐年上升，有的国家已达58％。目前，除了宣传教育和行为干预之外，常用的阻止HIV性传播的技术手段主要是安全套，但安全套需男性主动使用，在免费发放安全套的国家，持久使用安全套的性行为只占17％。因此，研制可由女方自主和安全使用，并且能有效预防艾滋病毒性传播的药物，对预防艾滋病在我国，乃至全球的流行至关重要。杀微生物剂(microbicides)就是一种由女性主动使用的，能预防HIV和其它性传播病原体性传播的新型药物。当前国际上已把杀微生物剂作为预防HIV性传播的首选新策略和新技术进行研究。
另外，生殖器疱疹是最常见的性传播疾病(STDs)之一，全世界有1亿多人受到疱疹病毒(HSV)感染，约75％生殖器疱疹病例由HSV-2引起。粘膜上皮的疱疹性损害形成病理性创伤和CD4细胞的聚集，给HIV-1感染提供了极为便利的条件。因此，当前把预防和治疗生殖道疱疹病毒感染，看作是减少艾滋病毒性传播的可行和实用的措施之一。
由于多糖结构的复杂性，某一确定多糖的硫酸酯化修饰物的抗HIV活性高低不同。迄今还未有从植物臭参多糖经磺化剂酯化而得的臭参多糖硫酸酯及其具有较强的抗艾滋病病毒作用的报道，臭参多糖硫酸酯的应用也尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是以臭参多糖为原料，研制一种抗HIV和HSV活性较高的化合物-臭参多糖硫酸酯。
本发明提供了一种生物活性臭参多糖硫酸酯的制备方法，其中制备步骤如下1、将臭参(Codonopsis bulleyana)多糖加入磺化剂中，控温搅拌反应；2、反应结束后取出烧瓶冷至室温，用碱溶液中和至pH为6.0-8.0，醇沉得沉淀，用醇洗涤沉淀；3、然后沉淀于蒸馏水中透析，透析内液减压蒸馏浓缩；4、接着用乙醇沉淀，沉淀经真空干燥即得本发明的臭参多糖硫酸酯。
其中，步骤1中的臭参多糖系用以下方法制备称取20克臭参粉，加入蒸馏水500ml浸泡1小时后进行匀浆，微沸热水回流浸提1小时，离心去沉淀，将上清液加入2倍体积95％乙醇静置过夜得到沉淀，沉淀按照张惟杰主编的《糖复合物生化研究技术》(第二版，浙江大学出版社，1999年8月)所述的Sevage法除蛋白质后真空冷冻干燥即得臭参多糖。
步骤1中所述的磺化剂由氯磺酸与甲酰胺或吡啶组成，前者与后者的体积比为1∶5-10。反应温度为60℃至106℃，优选70℃至90℃，首选75℃。磺化剂与臭参多糖的重量比为5∶1至15∶1，优选8∶1至12∶1，首选10∶1。反应时间为8至24小时，优选10至20小时，首选12小时。
步骤2中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾中的一种或几种，优选氢氧化钠或氢氧化钾，首选氢氧化钠。
步骤2和步骤4中所用的醇为甲醇或乙醇，优选乙醇，首选乙醇。
所得臭参多糖硫酸酯分子量为15～30kd，单糖组成为木糖、果糖、葡萄糖组成(见附图1)，为吡喃糖构型(见附图2、3)，由1→6(或非还原末端)、1→4(2)及1→3糖苷键连接无1→2糖苷键。硫酸酯化度0.5～2.5。
本发明对所得臭参多糖硫酸酯抗人艾滋病病毒和人单纯疱疹病毒的作用进行了实验检测。药效学试验证明该多糖硫酸酯具有较高的抗人艾滋病病毒和人单纯疱疹病毒的作用，对人体细胞和乳酸杆菌毒性低，抗艾滋病病毒的活性稳定，可制备成预防或治疗人艾滋病病毒和疱疹病毒感染的制剂。
附图1 D-木糖高效液相色谱分析结果。峰1为溶剂峰，峰2为D-木糖峰(保留时间6.617min)。
附图2 D-果糖高效液相色谱分析结果。峰1为溶剂峰，峰2为D-果糖峰(保留时间9.131min)。
附图3 D-葡萄糖高效液相色谱分析结果。峰1为溶剂峰，峰2为D-葡萄糖峰(保留时间9.998min)。
附图4 D-山梨醇高效液相色谱分析结果。峰1为溶剂峰，峰2为D-山梨醇峰(保留时间12.399min)。
附图5 D-标准单糖混合样高效液相色谱分析结果。峰1为溶剂峰，，峰2为D-木糖峰，峰3为D-果糖峰，峰4为D-葡萄糖峰，峰5为山梨醇峰。
附图6 D-硫酸化臭参多糖水解样品高效液相色谱分析结果。峰1为溶剂峰，，峰2为D-木糖峰，峰3为D-果糖峰，峰4为D-葡萄糖峰。
附图7 臭参多糖红外光谱附图8 臭参多糖硫酸酯红外光谱具体实施方式
通过以下实施例可进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一本发明化合物的一种制备方法取磺化剂80mL置于250mL三口瓶中，控制温度75℃，加入臭参(Codonopsis bulleyana)多糖8克，搅拌反应3h，反应结束后取出烧瓶冷至室温，用6M NaOH溶液中和，乙醇沉淀，离心，沉淀用蒸馏水溶解后于蒸馏水中透析，透析内液减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，离心，干燥即得本发明的臭参多糖硫酸酯。经HPLC分析(见附图1-附图6)表明，臭参多糖硫酸酯由木糖、果糖、葡萄糖组成。硫含量为10.04％。根据多糖高碘酸消耗的规律，推知由1→6(或非还原末端)、1→4(2)及1→3糖苷键连接。通过Smith降解分析表明臭参多糖硫酸酯中没有1→2糖苷键。红外光谱分析(见附图7、8)表明在3400cm-1左右有一宽而强的吸收峰，这是O-H的伸缩振动，说明存在分子内氢键；附图7中在3000-2800cm-1左右有一吸收峰，是糖类C-H的伸缩振动，在1400-1200cm-1的一组吸收为糖类C-H的变角角振动，这两组峰是糖类物质的特征吸收峰，证明所提取的样品是臭参多糖。另外，指纹区905cm-1和847cm-1左右出现吸收峰，分别为α-D-葡萄吡喃糖和β-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰，未发现呋喃型糖的吸收存在，说明臭参多糖是由吡喃型糖构成。由附图7、8的对比可以看出，修饰产物红外光谱除有母体多糖的吸收外，在1240cm-1与820cm-1左右出现很强的吸收峰，其中，1240cm-1是S＝O伸缩振动的特征峰，820cm-1是C-O-S伸缩振动的特征峰，说明经过修饰反应，硫酸基取代羟基而生成硫酸化多糖。
实施例二本发明臭参多糖硫酸酯的药理作用1、臭参多糖硫酸酯体外抗HIV-1IIIB(X4病毒)的活性在96孔培养板上，将臭参多糖硫酸酯待测样品的贮存液作5倍稀释，共8个梯度，每个梯度设4孔，每孔100μl，同时设置AZT阳性对照组和空白对照组。接着每孔加入C8166细胞(为T淋巴细胞系，由英国Medical Research Council(MRC)，AIDS Reagent Project惠赠)50μl(2×104/孔)，HIV-1IIIB(H9/HIV-1IIIB，由英国MRC惠赠，按常规方法复苏，培养，收集，分装和冻存)病毒20μl(MOI值为0.2)，补加完全培养基使每孔终体积为200μl。37℃，5％CO2培养。第三天补加新鲜完全培养基(RPMI-1640)100μl，第七天在倒置显微镜下观察每孔中病毒诱导的细胞致病变效应(Cytopathic effect，CPE)，计数每孔内形成的合胞体数；按Reed & Muench方法计算臭参多糖硫酸酯的EC50(50％effective concentration，即抑制合胞体形成达50％时的样品的浓度)，结果见表1。
2、臭参多糖硫酸酯体外对C8166细胞的毒性在96孔平底培养板上，将待测样品用培养基进行5倍稀释，共八个稀释度，每孔100μl，设2个重复孔，取4×105/ml C8166细胞悬液100μl与不同浓度的样品溶液混合，同时设置正常细胞对照，置37℃，5％CO2培养箱中培养三天或五天。然后将96孔细胞培养板低速离心后，小心吸去150μl上清，每孔加5mg/ml MTT溶液(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)20μl，37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4小时，每孔加100μl 20％SDS-50％DMF，37℃孵育过夜，用ELISA仪(测定波长为595nm；参考波长为655nm)检测。测定其细胞毒性IC50(50％inhibition concentration)结果见表1。
表1合胞体形成法测样品的对HIV-1IIIB的抑制作用和MTT法测对C8166细胞的毒性作用
由表1可见，本发明的臭参多糖硫酸酯对HIV-1IIIB的抑制作用强，对C8166细胞毒性作用很低，因而是安全高效的抗人艾滋病毒感染的化合物。
3、以MTT法检测样品对PBMC细胞的毒性取对数生长期的PBMC细胞，离心(1000rpm，10min)后将细胞重悬，浓度调至4×106/ml。在96孔细胞培养板上将被检试剂3倍倍比稀释，共设6个梯度，每个梯度设3个重复孔，另设阳性对照(SCH-C)组、阴性对照(0072)组、DMSO对照组及细胞对照组。分别加细胞悬液(4×105cells/100μl/well)后，置37℃、5％CO2培养箱中孵育。第七天用MTT法测定各种样品对细胞的毒性。按下列公式计算被检样品对细胞生长的抑制率，并计算IC50值。
细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×1004、定量ELISA检测化合物对HIV-1Ba-L(R5病毒)P24表达的抑制实验(1)在96孔培养板上，用多头加样器对样品进行3倍倍比稀释，设6个稀释度，每个稀释度设三个重复孔，每孔100μl。同时设阳性对照组(SCH-C)、阴性对照组(0072)、DMSO对照组、病毒对照组。
(2)在96孔平底培养板上每孔分别加含有1000-5000pg/well P24抗原的病毒贮存液25μl，充分混匀。
(3)加入单核巨噬细胞悬液75μl(3×105cells/well)。
(4)置37℃，5％CO2培养箱中培养到第3天时每孔补加100μl培养基，第7天时收集细胞培养上清供P24抗原测定。
(5)按P24试剂盒说明书，用ELISA法检测各样品细胞培养孔上清的HIV-1 P24抗原浓度，以下列公式计算样品对病毒的抑制率样品对病毒P24抗原的抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/细胞加病毒对照孔OD值)×100进一步计算出被测样品的EC50。得到以下表2的结果。
表2臭参多糖硫酸酯对HIV-1Ba-L的抑制作用和对人PBMC细胞的毒性作用
5、臭参多糖硫酸酯对I型和II型单纯疱疹病毒的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用以阿昔洛韦(acyclovir，ACV)为阳性对照，通过空斑形成实验测定样品对单纯疱疹病毒(I型和II型)的抑制作用，结果显示ACV对I型和II型HSV的治疗指数(TI＝IC50/EC50)值分别为59和1157(表3)；AF对I型和II型HSV的EC50值分别为13.94μg/ml和26.54μg/ml，治疗指数(TI)分别为179和94。提示臭参多糖硫酸酯对单纯疱疹病毒I型和II型具有一定的抑制作用(表3)。
表3臭参多糖硫酸酯对单纯疱疹病毒的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用
5、臭参多糖硫酸酯体外对阴道正常菌群乳杆菌的敏感性菌株德氏乳酸杆菌DM8909，通过平板菌落计数法得到菌液中的活菌数目，用乳杆菌培养基稀释到最终接种菌量为2.0×106cfu/ml，准备接种。
取灭菌的96孔聚苯乙烯平底培养板，每排标记好待测菌株、标准菌株、拟测药物的顺序和编号，对待测药物在培养板中用沙保氏液体培养基做二倍倍比稀释，设置十个梯度，每个样品浓度设置两个复孔，设置阳性对照(加青霉素钠100U/ml)、空白对照(只加培养基)，每孔有100μl药物培养基混合物，再加入100μl稀释菌液，使终体积达到200μl，将96孔板在微型振荡器上振荡1分钟，使各孔内溶液混匀。微孔培养板加盖并用胶纸密封，在37℃培养24小时。在空白对照未见混浊的情况下，观察96孔培养板内各孔的细菌生长情况，以肉眼观察判断孔内的清亮未出现混浊的最低稀释孔对应的药物浓度为该样品的MIC值(最低抑菌浓度)，再将未见细菌生长的孔的混合液混匀后取100μl，均匀涂布于沙保氏固体培养基上，20分钟后倒置，37℃培养36小时。计数各培养皿内的菌落数，与活菌计数相比，菌落数减少50％的最低稀释孔对应的药物的浓度为该样品的MIC50值；菌落数减少90％的最低稀释孔对应的药物的浓度为该样品的MIC90值。结果如下。
表3臭参多糖硫酸酯对阴道正常菌群乳杆菌的敏感性
结果表明对阴道正常优势菌群乳杆菌无抑制作用。
6、以MTT法检测了硫酸酯化臭参多糖样品对人宫颈癌细胞系ME180、HeLa、人包皮成纤维细胞的毒性作用，得到表4的试验结果。
表4臭参多糖硫酸酯对人宫颈癌细胞系ME180、HeLa、人包皮成纤维细胞和阴道乳酸杆菌的毒性
由表4可见，本发明的臭参多糖硫酸酯对HIV-1IIIB、HIV-1Ba-L和HSV的抑制作用强，对C8166细胞、对人PBMC细胞、对Vero细胞、对人宫颈癌细胞系ME180、HeLa及人包皮成纤维细胞和阴道乳酸杆菌的毒性作用都很低，因而是安全高效的抗人艾滋病毒和单纯疱疹病毒感染的化合物。
权利要求
1.臭参多糖硫酸酯，其特征是取植物臭参(Codonopsis bulleyana)的水提取物，经磺化剂处理而得，由木糖、果糖、葡萄糖组成，通过1→6(或非还原末端)、1→4及1→3糖苷键连接，硫酸酯化度在0.5-2.5之间。
2.权利要求1所述臭参多糖硫酸酯的制备方法，其特征是取植物臭参(Codonopsis bulleyana)多糖，经磺化剂处理，10％NaOH溶液中和，无水乙醇沉淀，蒸馏水溶解，然后用蒸馏水透析、减压蒸馏浓缩、无水乙醇沉淀、真空干燥等公知方法处理即得本发明的臭参多糖硫酸酯。
3.权利要求1所述臭参多糖硫酸酯在治疗或预防人艾滋病病毒(HIV)和单纯疱疹病毒(HSV)感染的制剂中的应用。
4.权利要求1所述臭参多糖硫酸酯的用途，其特征是制备药物的制剂形式可选择口服制剂、注射制剂、外用制剂以及阴道和直肠用制剂。
全文摘要
本发明涉及一种具有生物活性的臭参多糖硫酸酯及用途，其特征是糖链中含有由木糖、果糖、葡萄糖组成，通过1→6(或非还原末端)、1→4及1→3糖苷键连接。本发明提供的臭参多糖硫酸酯是以植物臭参(Codonopsis bulleyana)多糖，经磺化剂处理而得，硫酸酯化度0.5－2.5，所述的磺化剂由氯磺酸与吡啶组成，前者与后者的体积比为1∶2－8。本发明所得的臭参多糖硫酸酯不仅具有较高的取代度，而且具有较强的抗人艾滋病毒和人单纯疱疹病毒活性，对人体细胞的毒性低，可用于制备预防或治疗人艾滋病病毒和人单纯疱疹病毒感染的制剂。
文档编号A61K31/715GK101058610SQ20061004868
公开日2007年10月24日 申请日期2006年9月21日 优先权日2006年9月21日
发明者赵声兰, 贲昆龙, 陈朝银, 曹筱梅 申请人:云南中医学院