专利名称：含有促性腺激素释放素和绿脓毒素功能片段的重组毒性剂的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质。更具体地说，本发明涉及与促性腺激素释放激素融合的重组假单胞菌外毒素A功能片段(rPE38)的构建，以及所说的重组细胞毒性融合蛋白作为抗肿瘤剂，在抑制类固醇激素刺激的肿瘤的发生和发育中的应用。
传统的肿瘤治疗方法是使用化学药物直接杀伤体内的肿瘤细胞。然而，大多数抗肿瘤药物在杀伤肿瘤的同时还杀伤正常细胞。为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性，自20世纪70年代后期以来，人们就试图将某些抗肿瘤药物或本来缺乏靶向选择性的毒素(包括细菌或动植物来源的毒素)化学偶联到适当的导向分子或称识别分子上，以制备杂交的具有靶特异性的抗肿瘤剂。随着分子生物学技术的发展，进而建立了以DNA重组技术制备这样的融合蛋白质的方法。
在肿瘤的发生和发育过程中，许多肿瘤细胞都在其表面上过量表达生长因子受体蛋白质，例如表皮生长因子受体(EGF-R)和转化生长因子α受体(TGFα-R)。因此，可将某些细胞毒性剂(如假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素及蓖麻毒素等)连接到作为导向剂的EGF、TGF-α或bFGF分子上，以产生兼有肿瘤细胞导向功能和细胞毒活性的杂交分子。这些杂交分子借助其对靶肿瘤细胞导向能力将整个分子引向靶细胞并通过其毒素部分杀伤靶细胞。
目前研究较多且较深入的细胞毒性剂是假单胞菌外毒素A(PEA)(参见美国专利4,545,985)。PEA是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PE分子的X射线晶体学研究和突变分析显示，PE分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(I区)；负责毒素分子向细胞溶胶内转位的中间转位区(II区)；以及负责失活蛋白质并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(III区)。其中I区包括介导细胞结合的Ia区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ib区(氨基酸365-399)。可以使用生物化学或重组DNA技术修饰PE分子，以制备PE分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PE片段，例如，一般将删去了PE分子中Ia区，只含有酶促和转位区，分子量约为40KDa的PE-蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的Ia和大部分Ib区(氨基酸365-380)后，即PE38毒素分子，该分子仍保留其特异性细胞毒性，但降低了非特异性毒性(例如参见Hwang et al.，Cell 48129-136，1987；美国专利4,892,827和欧洲专利0261671)。
许多现有技术文献已描述了PE与各种生长因子、抗体、激素或CD4融合，以产生可选择性地导向并杀伤具有不同细胞膜蛋白(受体或抗原)之靶细胞的杂交蛋白质的方法(参见Pastan and Fitz.G.，Science 2541173-1177，1991)。例如，Chaudhary等人(PNAS USA 844538-4542，1987)描述了PE40与TGFα间形成的杂交体融合蛋白质(TGFα-PE40)。TGFα-PE40的临床实用性依赖于其结合并杀伤具有表皮生长因子受体之细胞的能力。Murphy等人(PNAS USA 838258-8262，1986)描述了白喉毒素-α促黑素(MSH)融合蛋白质的基因构建、表达及其黑色素瘤选择性细胞毒性。美国专利5,428,143公开了用于选择性杀伤HIV感染之细胞的杂交蛋白质及编码该杂交蛋白质的嵌合基因的构建。其中所说的杂交蛋白质由含有HIV结合位点的人CD4和可杀死HIV感染之细胞毒性蛋白质(PE38)组成。
作为与本发明更为相关的现有技术，国际专利WO93/15751公开了将促性腺激素释放激素(GnRH)肽直接偶联到假单胞菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白质分子。据称，投用这样的嵌合分子可导致脑垂体中携带GnRH受体的细胞的破坏，并伴有性激素分泌的降低，因而可望将其用于动物不育化及抑制类固醇激素相关肿瘤的增殖。另外，国际专利申请WO97/15325描述了一种含有与假单胞外毒素化学结合的GnRH的免疫原性载体系统，以其作为疫苗可在动物体内诱发产生高浓度抗GnRH抗体，因而可用于控制受孕、减少生殖激素驱动的行为及治疗类固醇激素反应性肿瘤。
本发明的一个目的是提供一种由短肽类激素与重组假单胞菌外毒素A功能片段融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所说的短肽类激素部分作为导向剂，可与其表面上具有相应激素受体的外周性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的假单胞菌外毒素功能片段部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的短肽类促激素是促性腺激素释放激素(GnRH)。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的重组假单胞外毒素A功能片段是PE38。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的GnRH是以基因融合形式连接到PE分子中相当于I区的位置。
本发明的另一个目的是提供含有细胞毒性有效量的上述GnRH-PE38嵌合毒素，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
本发明的再一个目的涉及上述药物组合物在治疗性腺激素反应性或非反应性肿瘤中的应用。
图1显示用于表达GnRH-PE38的重组质粒的构建。
图2显示部分纯化的GnRH-PE38对某些性激素反应性或非反应性组织来源的肿瘤细胞及某些正常组织原代细胞培养物的蛋白质合成的影响。数值以在不同浓度GnRH-PE38存在下(横坐标)，特异性嵌合毒素蛋白质抑制恶性细胞蛋白质合成占良性对照组细胞的百分率(纵坐标)表示。■乳腺癌MCF-7细胞；●肝癌HepG-2细胞；▲结肠癌HCT-8细胞；※子宫颈癌Hela细胞；○小牛睾丸细胞；△小鼠胸腺细胞；□小鼠腹腔巨噬细胞；⊙人子宫颈细胞。
本文中所使用术语“导向剂”，是指能够只与待杀伤的靶细胞表面上的受体或抗原特异结合的分子或配体。“导向剂”有时也称为“识别分子”或“配体结合剂”。这样的识别分子的例子是可识别靶细胞的抗体或其片段，可与靶细胞上的分子特异结合的生长因子、淋巴因子、细胞因子、抗原及激素等。根据本发明的优选实施方案，所说的导向剂是小分子短肽类激素(GnRH)。
本文所使用的术语“GnRH”是指能够与其表面上具有类固醇激素受体的细胞结合，并且当以高剂量投用于哺乳动物宿主时能引发抗GnRH抗体产生的天然GnRH的类似物或衍生物。
天然GnRH也称为促黄体激素释放激素(LHRH或LRH)，其为具有下示氨基酸序列的十肽分子pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-rg-Pro-Gly-NH2式中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号，并且其中的pGlu代表焦谷氨酸。可适用于本发明的GnRH类似物或衍生物。研究结果显示，分子中的第3～6位氨基酸是维持GnRH活性所必需的，而Ser4和Tyr5则在受体结合中起到关键性作用。已有证据表明，卵巢细胞特别是粒层细胞表面具有GnRH受体。已证明小鼠睾丸细胞(Legdig细胞)表面的受体表达与体内激素水平有关(Harwood，J.P.etal.，Endocrinology 107407-413，1980)。另外，还有人发现大鼠子宫内膜上具有亲合力很高的GnRH受体(曹咏清等，中国科学B辑132-37，1984)。虽然目前对GnRH的垂体外作用机理尚不完全清楚，但可以肯定的是，GnRH与性腺或子宫内膜等类固醇激素相关组织或细胞上特异性受体的结合是GnRH发挥垂体外作用的一个重要环节。而且也已显示，与靶细胞膜和细胞内分泌颗粒上存在的GnRH受体结合基本上是没有种属特异性的(张崇理等，中国应用生理学杂志5(1)87-93，1988)。我们对按本发明方法制备的GnRH-PE38融合蛋白质的生物学活性分析已清楚地证明，GnRH-PE38具有与包括Hela细胞在内多种性器官来源的肿瘤细胞具有杀伤活性，而对多种组织来源的正常细胞则没有这种特异杀伤活性(参见实施例2)。
本文中所使用术语“ID50”是指抑制靶细胞蛋白质合成达到对照组的50％所需的嵌合毒素的浓度。本发明中使用标准的3H亮氨酸掺入法检测“ID50”值。
本发明进一步涉及以重组DNA技术生产与小分子肽类激素偶联的靶特异性、细胞毒性重组PE融合蛋白质的方法，该方法包括(1)提供携带PE38基因的表达载体；(2)人工合成分子串联连接的编码小分子肽类激素的核苷酸序列，并将其克隆到线性化的步骤(1)的表达载体中；(3)用步骤(2)的表达载体转化适当的宿主细胞；(4)在适于表达所说的由小分子肽类激素和假单胞菌外毒素组成的融合蛋白质的条件下培养所说的被转化的宿主细胞；(5)从细胞培养物中回收并纯化所说融合蛋白质。
用于构建本发明的融合蛋白质的PE分子可以是缺失了Ia区和大部分Ib区的天然PE分子，但也可以并且较好是经过修饰的PE38分子。例如，这样经过修饰的PE38分子可以是其中1～4个半胱氨酸(Cys265、Cys287、Cys372和Cys379)被删除或被其他氨基酸如丙氨酸取代的PE38(参见欧洲专利0383599和美国专利5,621,078)，具有氨基酸280～364和381～613(缺失II区中氨基末端的1～28位氨基酸)，并且287位的半胱氨酸被丝氨酸取代的重组PE38分子(参见美国专利5,821,238)，以及可分别在PE分子羧基末端的氨基酸600-613之间插入第一个识别分子，并在PE分子的氨基末端连接第二个识别分子的重组假单胞菌外毒素(参见美国专利5,705,163)。此外，可以使用本领域技术人员熟知的位点特异性诱变技术或其他技术进一步修饰PE分子，以根据特定应用目的改变之。当然，这些修饰的前提是没有实质上改变由PE分子提供的功能特性。
由于作为本发明抗肿瘤嵌合毒素中导向剂或称识别分子的小分子肽类激素的分子量均相对较小(10～13肽)，所以可使用通用的DNA合成仪在1000A固相载体上合成这些激素或其变异体的核苷酸序列。为了便于与游离的或携带于特定重组载体上的PE编码序列连接，可在合成的激素基因序列的5’和/或3’端引入适当的核酸内切酶(如NdeI)酶切位点，并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术(例如参见Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor laboratory，1989)，克隆编码这些合成的短肽类激素的基因(或以其cDNA或基因组DNA形式)，并在相当于已被删除的Ia区和大部分Ib区的位置或在III区内的适当酶切位点处将其连接到线性化的携带PE38的载体中如pKK-PE38(Chandhary et al.，PNAS USA 844538-4542，1987)或PET-11b-PE38(Novagen Co.)中。然后可将如此得到的重组载体系统转化到原核细胞如大肠杆菌细胞中以生产GnRH-PE38融合蛋白质。DNA重组操作中，一般使用标准的PCR扩增技术扩增所需的基因片段并造成适当的酶切位点。使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变，最后以Sanger等人的双脱氧链终止法进行序列测定以进一步证实之。
当然，也可以借助适当的化学偶联基团，用已知的化学方法将两个部分结合在一起。例如可使用SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-2-吡啶二硫代)-丙磺酯、戊二醛、马来酰亚氨基苯甲酰-N-琥珀酰胺酯、亚氨基硫烷等携带功能性基团的异双功能交联剂作为连接GnRH与PE38分子的“接头”。
这里应特别指出的是，由于相对于细胞毒性部分PE38来说，导向部分GnRH的分子量小得多，所以由两者产生的融合蛋白质中的PE38部分很可能形成新的二级空间构象，导致PE38部分对GnRH的卷曲，影响融合蛋白质的受体结合的程度。特别在没有对PE分子中的半胱氨酸残基进行取代/删除修饰的情况下，这种可能性更大。另外，如前所述，由于GnRH为哺乳动物脑垂体分泌的一级激素，而且相关外周组织的肿瘤细胞表面上相应受体密度较低，所以为增加这些导向分子与靶细胞受体的结合几率和结合稳定性，最好以GnRH分子作为嵌合毒素中的导向部分。
可以将作为配体结合剂的小分子肽类激素插入到PE38I区内，最好是相当于天然PE分子的Ia区的位置上(参见Heimbrook et al.，PNAS USA 874697-4701，1990)。但也可以插入到PE分子羧基末端氨基酸605～613的位置上。
可在大肠杆菌或其他原核细胞内表达包括PE分子和小分子肽类激素的融合蛋白质。重组蛋白质基因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上，如连接到适于在大肠杆菌中使用的T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法，如适于原核细胞的氯化钙处理法或适于哺乳动物细胞的电穿孔法将本发明的重组质粒转化到选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质，即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如，可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶或盐酸胍裂解之，然后超速离心并在低浓度磷酸盐(约20mM)溶液中反复透析。然后向混合物中加入尿素以溶解细胞包涵体内的蛋白质。再次离心除去不溶物后，依次经离子交换层析(IEC)和体积排阻层析(SEC)纯化所需的GnRH-PE38重组杂交蛋白质。另外，亦可使用盐析、亲合层析及制备性凝胶电泳等方法进行纯化(参见R.Scopes，ProteinPurificafion，Springer-Verlag，N，Y.，1982)。
一般说来，使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法(Laemmli，Nature227680-689，1970)分析各柱层析洗脱部分，并使用多克隆兔抗PE抗血清和Vectastain试剂盒(Vector Labs，Buvlingame，Calif.)以免疫印迹法监测之。对重组融合蛋白质纯化产物进行蛋白质合成抑制试验(Prior et al.，Cell 641017-1029，1991)，以检测融合蛋白质的细胞毒性(ID50)。对于GnRH-PE38融合蛋白质，则主要检测其对包括肿瘤或正常细胞在内的不同靶细胞的体外杀伤活性，以及用3H标记的亮氨酸掺入法检测融合蛋白对HeLa、Swiss 3T3等细胞的蛋白质合成抑制作用。另外，可按Colliev和Kondel所述的方法(J.Biol.Chem.2461496-1503，1971)，使用富含延伸因子2的麦胚提取物检测蛋白质样品的ADP-核糖基化活性。
可将本发明的GnRH-PE38融合蛋白质作为基本活性成分，并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床应用的药物组合物。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据所治疗的疾病的不同，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的融合蛋白质有辅助或协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物。另外，可在本发明的药物组合物中加入选自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白质保护剂，以及选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。
可以通过常规给药途径，特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物，例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几毫微克至几十毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量将根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、对药物的反应能力及给药方式等因素而定。
应特别指出的是，尽管更深入的作用机理尚不明确，但我们的实验室已早在2001年即已证明本发明的GnRH-PE38蛋白质对包括结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR3细胞、子宫颈腺癌HeLa细胞及肝癌HepG-2细胞等肿瘤细胞系均有明显的特异结合活性和细胞毒性。
因此可见，本发明的GnRH-PE38蛋白质不仅对受下丘脑-垂体-性腺轴控制的所谓类固醇激素反应性肿瘤有明显体外杀伤作用，而且对某非性腺器官来源的腺癌细胞如S-180肉瘤细胞及骨髓瘤细胞也具有差不多相同的特异性结合、内化及细胞毒活性。
以下借助实施例进一步阐明本发明，但本领域技术人员可以意识到，这些实施例并不构成对本发明待批权利要求范围的限制。
实施例1GnRH-PE38融合蛋白质的制备A.重组表达质粒的构建与鉴定a.起始质粒DNA的扩增与线性化用携带处于T7启动子及SD序列和终止子控制下的编码PE分子之氨基酸1～3和氨基酸253～613(去除其中Ib区大部分，即△365-380)的核苷酸序列的质粒pVC(Chaudhary et al.，PNAS USA 844538-4542，1987)转化感受态大肠杆菌HB101细胞，并将被转化的细胞培养于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，以扩增质粒DNA。培养完成后，破碎细胞，离心收集质粒并用苯酚/氯仿提取质粒DNA。用NdeI将质粒DNA切成线性，并用牛小肠碱性磷酸酶处理以使其末端去磷酸化。
b.含GnRH-基因的人工合成根据人GnRH-的氨基酸序列，使用DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.AB1394型)合成如SEQ ID NO.1所示的编码GnRH的基因序列(36bp)。
c.重组质粒pVC8-GnRH-PE38的构建与筛选在T4DNA连接酶存在下，按照大约1∶2-4的摩尔比例将线性化并末端去磷酸化的pVC8-PE38与经过末端磷酸化处理的双链GnRH-核苷酸编码序列连接在一起。由于在NdeI消化pVC8-PE38时3’末端留有AT突出部分，而所合成的GnRH-编码序列基因分别在5’端带有TA碱基，从而退火后很容易在只使用单一酶切的情况下实现修饰的GnRH基因序列与携带PE38之pVC8质粒载体(pVC8-PE38)的正确连接。图I显示了重组质粒pVC8-GnRH-PE38的构建。
然后用所得到的连接反应混合物转化大肠杆菌HB101。将被转化的菌株接种于含氨苄青霉素(50μg/ml)LB琼脂平皿上，培养后挑选氨苄青霉素抗性菌落，并在硝酸纤维素滤膜上与放射标记的探针(γ-32P-GnRH)(A链)原位杂交(65℃预杂交2小时；55℃杂交12小时)。从原位杂交阳性的转化体中小量提取质粒DNA，再次用上述探针以相同的方法进行斑点杂交，用空pVC8载体序列作为阴性对照。
随机选取杂交阳性的质粒，用酶切鉴定法和琼脂糖凝胶(2％)电泳法进行鉴定。选择正确连接有单一GnRH编码序列的重组质粒并将其定名为pVC8-GnRH-PE38。
一般说来，如在连接反应中增加GnRH编码序列对pVC8-PE38的摩尔比例，理论上应得到其中串联连接有多个GnRH编码序列的重组质粒。经SDS-PAGE电泳分析后，选择只以正向连接有单个(GnRH)核苷酸编码序列的重组质粒进行DNA序列分析。SEQID NO2显示了所测得的GnRH-PE38杂交基因的核苷酸序列。SEQ ID NO3则显示由GnRH-PE38推测的融合蛋白质的氨基酸序列。
B.GnRH-PE38融合蛋白质的表达及产物的纯化将分别用携带GnRH-PE38杂交基因的重组质粒pVC8-PE38-GnRH以及不含GnRH基因序列的起始质粒pVC8-PE38(作为对照)转化的大肠杆菌BL21(DE3)(含有T7RNA聚合酶基因)(Studier，F.W.and Moffatt，B.A.，J.Mol，Biol，189113-130，1986)培养在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中。当A600达到约0.8～1.2时加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度1mM/L)，37℃继续培养3小时，以诱导目的产物的表达。然后离心收集细胞并将细胞沉淀物反复冻融后悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，5mM EDTA和0.2mg/ml溶菌酶)中，离心除去上清(可溶性部分)，并将重悬物超声(3×20秒)处理，以破碎细胞。再次离心(25,000g，20分钟)收集沉淀物(不溶部分)后加入冰冷的变性缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA 15mM二巯基乙醇，7M盐酸胍)。室温下搅拌2小时后再次离心，并将所得蛋白质溶液稀释到200倍体积的重折叠缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.8，1mMEDTA，0.1M NaCl和10mM二巯基乙醇)中，4℃放置24小时，将重新折叠的蛋白质溶液在10mM磷酸盐缓冲盐水中(PBS)(pH7.4)彻底透析(换液4次)，然后离心(20,000g，30分钟)，上清即为GnRH-PE38粗提物。
将如上得到的澄清的上清液加到已用上述重折叠缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)上，用含有0.05～0.5M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)阶段洗脱，并收集蛋白质活性峰部分。使用装有YM-30膜的Amicon超滤器浓缩后，使浓缩物通过用上述重折叠缓冲液平衡过的2.6×100cm Sephacryl S-200柱(Pharmacia)，并用含有0.15M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris·HCl，pH8.0，1mM EDTA)洗脱。收集活性峰部分并再次过2.0×20cmQ-Sepharose柱(Pharmacia)，用NaCl梯度洗脱后收集蛋白质峰值(A280)部分并在20mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用。如此纯化的蛋白质纯度＞96％。
按照制造商推荐的方法，使用Vectastain ABC试剂盒(Vector LaboratoriesInc.)和多克隆兔抗PE抗血清对纯化的GnRH-PE38蛋白质进行鉴定。
实施例2GnRH-PE38融合蛋白质的靶特异性和生物学活性分析A.蛋白质合成抑制试验按照Prior等人(Cell 641017-1023，1991)所述的方法检测本发明GnRH-PE38融合蛋白质对选择的肿瘤或正常细胞系的蛋白质合成的抑制作用。
实验中使用的靶细胞包括结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR细胞、子宫颈腺癌Hela细胞和肝癌HepG-2细胞等瘤系以及预制备的小牛睾丸细胞、小鼠胸腺细胞、乳腺细胞和腹腔巨噬细胞等原代正常细胞培养物。
以每孔2×104个细胞的密度将各种被试细胞接种在96孔微量培养板中，在5％CO2环境下37℃保温24小时后向各孔内加入不同浓度的GnRH-PE38和作为对照样品的等量PE38，终体积为200μl/孔。所有被试样品均稀释在0.2％牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲盐水(BSA-PBS)中。37℃保温24小时后加入[3H]标记的亮氨酸(Amershanm，Corp.)(5μCi/孔，稀释在BSA-PBS中)继续保温12小时。-70℃冷冻并快速融解后将细胞收获到玻璃纤维滤膜上，然后用β计算器检测掺入到细胞蛋白质中的放射活性。以占没有接触毒素蛋白质而只加BSA-PBS的对照细胞的百分掺入量表示的结果示于图2中。
从图2所示的结果可以看出，本发明部分纯化的GnRH-PE38融合蛋白(DEAE-Sepharose柱后的峰值部分)能够以剂量依赖方式杀死类固醇激素反应性器官乳腺、子宫颈来源的肿瘤细胞(ID50值约为15-40μg/ml)。而且发现，毒素对结肠癌和肝癌细胞也表现有明显的细胞毒性(ID50值约为55-80μg/ml)。
另外，从图2中可进一步看出，本发明GnRH-PE38对于得自健康供体的正常性腺相关组织(小牛睾丸细胞和人子宫颈细胞)、淋巴组织(小鼠胸腺细胞)和上皮组织(大鼠皮肤或纤维细胞)来源的原代细胞培养物则没有表现出可检测的细胞毒活性。
B.GnRH-PE38的特异性结合试验基本上按照Qayum，A.等人(Br.J.Cancer 6296-99，1990)所述的方法进行GnRH-PE38对与Hela细胞胞浆膜部分结合之125I-GnRH的特异性竞争和取代研究。
将培养的Hela细胞单层分离到含有10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT和1mg/ml牛血清白蛋白的缓冲液中以制备细胞匀浆，并离心(500g，15分钟)去除大的碎片。以25,000g将上清部分4℃离心30分钟得到胞浆膜部分，并将其悬浮于冷的上述缓冲液中(0.5mg蛋白质/ml)。以每孔100μl的终体积将此胞浆膜悬液(100μg/孔)加于24孔培养板的各孔中。然后各加入5μM(0.25μCi)125I-GnRH-并37℃温浴1小时。1小时后再分别加入未标记的GnRH(0.01-1000μM)或本发明的GnRH-PE38嵌合毒素(0.1-500mM)并继续保温24小时。保温后用上述缓冲液洗样品并用γ计数仪检测结合的配体。以渐增的浓度加入部分纯化的GnRH-PE38嵌合毒素可随着GnRH-PE38浓度的增加而逐渐取代与Hela细胞膜结合的125I-GnRH。
虽然不拘泥于理论，但我们推测GnRH-PE38的这种较高的受体特异亲合性可能是由于延长了本不带有半胱氨酸的导向分子的空间伸展性，进而增加了导向分子与相关受体或抗原的结合机会。另外，这一实验结果提示，本发明的GnRH作为导向部分的嵌合毒素似乎适于开发成可在临床实践中应用的抗肿瘤剂。
序列表(1)一般信息(I)申请人深圳高科生物科技有限公司(II)发明名称含有导向的促性腺激素释放激素和绿脓杆菌外毒素A毒性功能片段(PE38)的重组毒性剂(III)序列数3(IV)通讯地址(A)联系人王志敏(B)街道深圳市高新区高新中一道生物孵化器大楼2-101A.B(C)城市深圳(D)国家中华人民共和国(E)邮编518057(V)计算机可读形式(A)介体类型3.5英寸软盘(B)计算机IBM PC(C)操作系统WINDOWS98(D)软件WORD2000(VI)电讯信息(A)电话13510077369(B)电传0755-26031096(2)SEQ ID No1的信息(I)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型cDNA(III)序列描述SEQ ID No1
TATGCAGCAC TGGTCCTATG GACTGCGCCC TGGACA(2)SEQ ID No2的信息(I)序列特征(A)长度1086碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型cDNA(III)序列描述SEQ ID NO2ATGCAGCACT GGTCCTATGG ACTGCGCCCT GGACATATGG CCGAAGAGGG CGGCAGCCTGGCCGCGCTGA CCGCGCACCA GGCTTGCCAC CTGCCGCTGG AGACTTTCAC CCGTCATCGCCAGCCGCGCG GCTGGGAACA ACTGGAGCAG TGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCCCTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAAC CAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTGGCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGC GAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCCCGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAG AGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGCAACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGGCCCG GCGGACAGCG GCGACGCCCT GCTGGAGCGCAACTATCCCA CTGGCGCGGA GTTCCTCGGC GACGGCGGCG ACGTCAGCTT CAGCACCCGCGGCACGCAGA ACTGGACGGT GGAGCGGCTG CTCCAGGCGC ACCGCCAACT GGAGGAGCGCGGCTATGTGT TCGTCGGCTA CCACGGCACC TTCCTCGAAG CGGCGCAAAG CATCGTCTTCGGCGGGGTGC GCGCGCGCAG CCAGGACCTC GACGCGATCT GGCGCGGTTT CTATATCGCCGGCGATCCGG CGCTGGCCTA CGGCTACGCC CAGGACCAGG AACCCGACGC ACGCGGCCGGATCCGCAACG GTGCCCTGCT GCGGGTCTAT GTGCCGCGCT CGAGCCTGCC GGGCTTCTACCGCACCAGCC TGACCCTGGC CGCGCCGGAG GCGGCGGGCG AGGTCGAACG GCTGATCGGCCATCCGCTGC CGCTGCGCCT GGACGCCATC ACCGGCCCCG AGGAGGAAGG CGGGCGCCTGGAGACCATTC TCGGCTGGCC GCTGGCCGAG CGCACCGTGG TGATTCCCTC GGCGATCCCCACCGACCCGC GCAACGTCGG CGGCGACCTC GACCCGTCCA GCATCCCCGA CAAGGAACAGGCGATCAGCG CCCTGCCGGA CTACGCCAGC CAGCCCGGCA AACCGCCGCG CGAGGACCTGAAGTAA
(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)长度359氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型蛋白质(III)序列描述SEQ ID NO3Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Gly-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asp-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Len-Len-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Len-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Gln-Gln-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Len-Gln-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Gln-Asp-Leu-Asp-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Len-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Gln-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asp-Gly-Ala-Len-Len-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Len-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Len-Thr-Len-Ala-Ala-Pro-Gln-Ala-Ala-Gly-Gln-Val-Gln-Arg-Len-Ile-Gly-His-Pro-Len-Pro-Len-Arg-Len-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Gln-Gln-Gly-Gly-Arg-Len-Gln-Thr-Ile-Len-Gly-Trp-Pro-Len-Ala-Gln-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Len-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Gln-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Len-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Arg-Gln-Asp-Len-Lys-end.
权利要求
1.由短肽激素与重组假单胞菌外毒素A功能片段融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所说的短肽类激素部分作为导向剂，可与其表面具有相应激素受体或其他配体的性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异地结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的重组假单胞菌外毒素A功能片段部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。
2.根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的假单胞菌外毒素是PE38。
3.根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的短肽类激素是GnRH。
4.含有根据权利要求1～3中任何一项的嵌合毒素及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
5.根据权利要求4的药物组合物在治疗性腺激素反应性或非反应性肿瘤的应用。
全文摘要
本发明涉及以包括促性腺激素释放激素短肽类激素作为导向剂，并以重组假单胞菌外毒素A功能片段为细胞毒性剂的嵌合毒素，其制备方法及在治疗性腺反应性或非反应性肿瘤中的应用，特征在于其中所说的嵌合毒素的导向部分是以促性腺激素释放激素为导向的。
文档编号A61P35/00GK1966529SQ20061006122
公开日2007年5月23日 申请日期2006年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者朱玫玫, 马迎吉, 王卫东, 赵书芹 申请人:深圳市高科生物科技有限公司