专利名称：一种用于胃癌治疗的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于胃癌治疗的药物及其制备方法，该药物通过一个双功能连接剂将放射性核素间接标记到单克隆抗体3H11，由于肿瘤细胞表面表达特异抗原，利用抗体和抗原的特异性结合，使标记的抗体注入体内后浓聚于肿瘤部位，并利用放射性核素衰变释放的β-粒子杀伤癌细胞以达到治疗的目的。
背景技术：
肿瘤是危害人类生命和健康的主要疾病之一，如何早期诊断和治疗是生物医学工作者长期以来不懈努力追求的目标。肿瘤细胞表面表达特异抗原，单克隆抗体具有识别抗原的特异性，因而可以利用单克隆抗体治疗疾病。由于放射性核素标记的单克隆抗体对肿瘤具有特异性和高亲和力，同时也由于抗体工程技术的快速发展，近年来放射免疫治疗已成为肿瘤治疗的一个新的方法和手段，并在临床上取得了引人注目的疗效。
中国专利CN1166988A公开了一种抗人肝癌单克隆抗体HAb18放射免疫治疗剂，而国内外尚未有放射性核素通过间接法标记的用于胃癌治疗的药物。
3H11是我国研制的抗胃癌单克隆抗体，并用99mTc、188Re和131I标记进行了动物实验和临床研究。上述研究采用的标记方法均为直接标记法，由于在标记过程中加入还原剂或氧化剂，因此对抗体活性产生相对较大的影响。
发明内容
本发明的目在于提供一种用于胃癌治疗的药物及其制备方法，该药物通过一个双功能连接剂将放射性核素标记到单克隆抗体3H11，使标记的抗体注入体内后浓聚于肿瘤部位，并利用放射性核素衰变释放的β-粒子杀伤癌细胞以达到治疗的目的。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种用于胃癌治疗的药物，包括抗体及放射性核素，所述抗体为单克隆抗体3H11，所述放射性核素通过一个双功能连接剂标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体3H11为无色液体针剂。
一种用于胃癌治疗的药物的制备方法，其步骤如下I、将1.2mL浓度为5.0mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；III、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；IV、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4℃条件下保存该抗体溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DOTA-NHS，配制成浓度为33.45g/L的溶液；取该溶液10μL分两次加入到0.5mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4℃条件下反应12小时，获得反应溶液；VII、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0L NH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4℃；在相同条件下再重复所述透析过程3次；透析处理完成后，获得DOTA-3H11溶液；在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8mg/mL的偶联物DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05M；对该溶液中偶联物DOTA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4℃条件下保存该偶联物溶液；IX、将50μL的所述偶联物DOTA-3H11溶液和100μL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；该混和液在43℃条件下反应1小时，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99％的放射性药物90Y-DOTA-3H11或177Lu-DOTA-3H11。
一种用于胃癌治疗的药物的制备方法，其步骤如下I、将1.2mL浓度为5.0mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；III、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；IV、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4℃条件下保存该抗体溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成浓度为33.45g/L的溶液；取该溶液10μL分两次加入到0.5mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4℃条件下反应12小时，获得反应溶液；VII、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0L NH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4℃；在相同条件下再重复所述透析过程3次；透析处理完成后，获得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8mg/mL的偶联物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05M；对该溶液中偶联物DTPA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4℃条件下保存该偶联物溶液；IX、将50μL的所述偶联物DTPA-3H11溶液和100μL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；该混和液在室温条件下反应30分钟，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99％的放射性药物90Y-DTPA-3H11或177Lu-DTPA-3H11。
本发明与现有技术相比有如下优点由于肿瘤细胞表面表达特异抗原，利用抗体和抗原的特异性结合，通过抗体将放射性核素载带到肿瘤部位，并利用放射性核素衰变释放的β-粒子杀伤癌细胞以达到治疗的目的。在已有技术中，对单克隆抗体3H11的标记方法均为直接标记法，由于在标记过程中加入了还原剂或氧化剂，因此对抗体活性产生相对较大的影响。本发明采用间接标记法，即在单克隆抗体和放射性核素之间引入一个双功能连接剂。这既可减小对抗体活性的影响，又可增强放射性药物的稳定性，同时提高肿瘤对放射性药物的摄取。与非放射性药物相比，放射性药物不仅能杀伤实体瘤表面的肿瘤细胞，同时通过放射性β-粒子杀伤实体瘤内部的肿瘤细胞，具有更强的杀伤力。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明DOTA偶联单抗3H11的分析图；图2为本发明反应pH值对标记率影响的示意图；图3为本发明反应温度及时间对标记率影响的示意图；图4为本发明抗体浓度对标记率影响的示意图；图5为本发明90Y-DOTA-3H11在三种介质中的稳定性示意图；图6为抗体偶联前后免疫活性对比示意图；图7为本发明90Y-DOTA-3H11的放射免疫活性分数示意图；图8为本发明90Y-DOTA-3H11小鼠血液药代动力学曲线图。
具体实施例方式
实施例一一种用于胃癌治疗的药物，包括抗体及放射性核素，所述抗体为单克隆抗体3H11，所述放射性核素通过一个双功能连接剂标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体3H11为无色液体针剂。
本发明中，所述单克隆抗体3H11包括鼠源性抗体及片断，基因工程制备的单链抗体(ScFv)、双链抗体(Diabody)、小型化抗体(Minibody)及嵌合抗体(Chimeric)。
本发明中，所述放射性核素为90Y，所述双功能连接剂为DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N′，N″，N，N′-四乙酸，1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraaceticacid)，所述放射性核素标记的单克隆抗体为90Y-DOTA-3H11。
本发明中，所述双功能连接剂包括DOTA的衍生物。
本发明中，所述双功能连接剂包括DTPA(二乙烯三胺五乙酸，diethylenetriaminepentaacetic acid)。
本发明中，所述双功能连接剂包括DTPA的衍生物。
以DOTA-NHS和90Y为例，90Y-DOTA-3H11的制备和分析如下将1.2mL抗体3H11(5.0mg/mL)和1mL 1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA)分别加入到超滤离心管中(Centricon-30，10K，Amicon)，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟，离心管中溶液约剩0.2mL。然后向离心管加入Na2HPO4溶液(pH7.5，0.1M，含0.15mM NaCl)2.0mL，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟，重复该过程3次。将抗体取出加Na2HPO4溶液(pH7.5，0.1M)稀释至0.5mL，于紫外280nm测量抗体浓度后4℃保存。
抗体预处理的目的为调节pH值并去除抗体溶液中的各种杂质。与DOTA-NHS偶联时反应溶液的最佳pH值为7.5。加入1.0mM EDTA的作用为络合抗体溶液中的其它金属离子，通过超滤离心使其去除。抗体预处理后的收率为83％，抗体浓度为10.0mg/mL。
用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N′，N″，N，N′-四乙酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(DOTA-NHS，N-Hydroxysulfosuccinimidyl-1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid)，配制浓度为33.45g/L的溶液。取10μL(0.667μmol，0.3345mg)分两次加入到0.5mL上述3H11抗体(10.0mg/mL，0.0333μmol)中，避光条件下4℃反应12小时。反应结束后转移反应溶液于透析卡(Slide-A-Lyzer，10K，Pierce)中，在1.0L Na2HPO4溶液(pH7.5，0.1M，含0.15mM NaCl)中4℃条件下透析24小时。然后用1.0L NH4OAc溶液(pH7.0，0.05M)4℃条件下透析处理18小时，在相同条件下再重复此透析过程3次。将透析后的3H11偶联物(DOTA-3H11)在紫外280nm测量抗体浓度，并用HPLC方法评价纯度。用NH4OAc溶液(pH7.0，0.05M)稀释DOTA-3H11至2.8mg/mL，4℃保存待用。
参见图1，图1为本发明DOTA偶联单抗3H11在透析前后的HPLC分析图，其中，(a)为透析纯化前偶联物在紫外280nm吸收曲线，(b)为透析纯化后偶联物在紫外280nm吸收曲线；如图1所示，HPLC分析显示透析后的偶联抗体未见DOTA-NHS的紫外吸收，说明没有游离的DOTA。
90Y标记DOTA-3H11及纯化采用以下方法取50μLDOTA-3H11加入到100μL醋酸钠缓冲液(pH5.2，0.2M)中，再加入10μL90YCl3(溶于0.04M HCl溶液中)，43℃反应1小时，然后加入20μLEDTA(pH5.0，6.0mM)，室温反应10分钟。将反应物通过PD-10柱(G-25 Sephadex，Pharmacia)纯化，以PBS(pH7.5，0.1M)为淋洗液，纯化后收集标记物并测量放射化学纯度。
采用以下方法对所述放射性药物90Y-DOTA-3H11的标记率及纯化后的放射化学纯度进行测定1.ITLC方法10μL标记物中加入20μLEDTA(pH5.0，6.0mM)，室温反应10分钟，取1μL点样于ITLC-SG上，然后在10.0mM EDTA展开液中上行展开10cm，其中90Y-DOTA-3H11保留在原点(Rf＝0.0)，90Y-EDTA展至前沿(Rf＝0.9-1.0)。
2.HPLC方法10μL标记物中加入20μLEDTA(pH5.0，6.0mM)，室温反应10分钟，取20μL上样HPLC，色谱柱为TSK G3000 WXL(7.8×300mm，TosoHaas)，磷酸缓冲液(pH6.5，0.02M，含有0.9％NaCl及0.05％NaN3)为流动相，流速1.0mL/min。90Y-DOTA-3H11的保留时间为8.2min，90Y-EDTA的保留时间为12.3min。
反应pH值、反应时间、反应温度及抗体浓度均对标记率有影响。参见图2，图2为本发明反应pH值对标记率影响的示意图，当反应pH值为5.2时，可以获得最高的标记率。参见图3，图3为本发明反应温度及时间对标记率影响的示意图，反应温度对标记率的影响很大，43℃时温育后1小时标记率接近最高，并随着时间的增加趋于平缓，而在室温和4℃条件下温育3小时后标记率仍不到20％。参见图4，图4为本发明抗体浓度对标记率影响的示意图，标记率随着抗体浓度的增加而增大，当抗体终浓度大于1.0mg/mL时，可获得较高的标记率。
90Y-DOTA-3H11的标记率大于90％，纯化后的放射化学纯度大于99％。
90Y-DOTA-3H11的体外稳定性采用以下方法测定取50μL标记物分别加入到100μL以下3种体系中生理盐水(0.9％NaCl)、EDTA(pH5.0，10.0mM)、裸鼠血清(Nude Mice Serum，NMS)。37℃振摇温育，分别于0、3、15、24、36、48、70、148小时取样，通过ITLC方法测量放射化学纯度，评价标记物的体外稳定性。参见图5，图5为本发明标记物在三种介质中的稳定性示意图，该图显示90Y-DOTA-3H11在体外有很好的稳定性，温育148小时，标记物在三种介质中的放化纯均大于90％。
免疫活性检测可以采用以下方法参见图6，图6为抗体偶联前后免疫活性对比示意图，使用ELISA方法检测DOTA-3H11的免疫活性，发现DOTA-3H11较3H11免疫活性有一定程度的降低，偶联后免疫活性下降了20％-30％。
90Y-DOTA-3H11的放射免疫活性检测参照Lindmo方法，即7×107个BGC823细胞以每分钟1000转的速度离心5分钟，用含有1％BSA的PBS(pH7.4，0.01M)洗两遍，再用含有1％BSA的PBS倍比稀释5个滴度；标记物稀释至40μg/L。将细胞和标记物混合，在37℃温育2小时，测量总放射性计数(T)和沉淀细胞的放射性计数(B)，计算不同浓度细胞数对应的T/B值。以T/B值对细胞浓度倒数(1/F)作图，所得曲线的延长线于y轴的截距的倒数即为标记物保留的放射免疫活性分数。参见图7，图7为本发明90Y-DOTA-3H11的放射免疫活性分数示意图，计算求得标记物的放射免疫活性分数为72.4％，说明标记物保持了良好的免疫活性。
90Y-DOTA-3H11在荷人胃癌裸鼠体内分布实验方法及结果如下将BALB/C荷人胃癌裸鼠随机分3组，每组5只，取100μL90Y-DOTA-3H11(～185kBq)及阴性对照100μL90Y-DOTA-IgG(～185kBq)经尾静脉注射到小鼠体内(90Y-DOTA-3H11两组，90Y-DOTA-IgG一组)，并于注射后4和24小时处死小鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
表一列出90Y-DOTA-3H11及阴性对照90Y-DOTA-IgG在荷瘤裸鼠体内分布数据。90Y为亲骨核素，当它在体内脱落后会浓聚在骨组织中，本实验数据显示，骨中的放射性浓度随着时间的延长并没有出现增高的趋势，并且较其它组织没有明显的偏高，说明制备的90Y-DOTA-3H11具有良好的体内稳定性。与阴性对照组相比，注射后24小时肿瘤对90Y-DOTA-3H11的摄取明显高于对照组，说明90Y-DOTA-3H11保持了良好的免疫活性，对人胃癌肿瘤细胞具有良好的亲和力。
表一90Y-DOTA-3H11及90Y-DOTA-IgG荷瘤裸鼠分布(n＝5，％ID/g±SD)
90Y-DOTA-3H11药代动力学测试方法如下选取状态良好的BALB/C小白鼠12只，每只小鼠经尾静脉注射100μL90Y-DOTA-3H11(～185kBq)，分别于注射后10分钟、1、2、4、6、8、12、20、24、35和48小时于眼眶后静脉采血，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算％ID/g。参见图8，图8为本发明90Y-DOTA-3H11小鼠血液药代动力学曲线图，采用Prism4.0软件拟合，药代动力学符合二室模型，计算血浆清除参数分别为T1/2α＝1.5h，T1/2β＝70.2h。
DOTA的衍生物以及DTPA及其衍生物与抗体3H11的偶联和纯化方法与DOTA与抗体3H11的偶联和纯化方法相同，对所形成的抗体偶联物的90Y标记方法及质控方法与上述90Y-DOTA-3H11的标记方法和质控方法相同。
90Y-DOTA-3H11的用药剂量将根据核医学临床显像结果进行剂量计算后确定。
实施例二本实施例是用另一种放射性核素标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素为177Lu(镥-177)，所述双功能连接剂为DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N′，N″，N，N″″-四乙酸，1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid)，所述放射性药物为177Lu-DOTA-3H11。
本发明中，所述双功能连接剂包括DOTA的衍生物。
本发明中，所述双功能连接剂包括DTPA(二乙烯三胺五乙酸，diethylenetriaminepentaacetic acid)。
本发明中，所述双功能连接剂包括DTPA的衍生物。
177Lu-DOTA-3H11的制备及质控方法与90Y-DOTA-3H11相同。
DOTA的衍生物以及DTPA及其衍生物与抗体3H11的偶联和纯化方法与DOTA与抗体3H11的偶联和纯化方法相同，对所形成的抗体偶联物的177Lu标记方法及质控方法与上述90Y-DOTA-3H11的标记方法和质控方法相同。
177Lu-DOTA-3H11的用药剂量将根据核医学临床显像结果进行剂量计算后确定。
实施例三一种用于胃癌治疗的药物的制备方法，具体步骤如下I、将1.2mL浓度为5.0mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；III、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；IV、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4℃条件下保存该抗体溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DOTA-NHS，配制成浓度为33.45g/L的溶液；取该溶液10μL分两次加入到0.5mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4℃条件下反应12小时，获得反应溶液；VII、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0L NH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4℃；在相同条件下再重复所述透析过程3次；透析处理完成后，获得DOTA-3H11溶液；在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8mg/mL的偶联物DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05M；对该溶液中偶联物DOTA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4℃条件下保存该偶联物溶液；IX、将50μL的所述偶联物DOTA-3H11溶液和100μL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；该混和液在43℃条件下反应1小时，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0mM，在室温(20℃-25℃)条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99％的放射性药物90Y-DOTA-3H11或177Lu-DOTA-3H11。
在本实施例中，所使用的单克隆抗体3H11是溶于PBS溶液，其浓度为5.0mg/mL。所使用的EDTA是乙二胺四乙酸溶液，其pH值为5.0，浓度为6.0mM，是常规试剂。所使用的DMF是无水二甲基甲酰胺溶液，是常规试剂。所使用的DOTA-NHS是双功能连接剂，其中文名称为1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N′，N″，N，N″″-四乙酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯，其英文名称为N-Hydroxysulfosuccinimidyl-1，4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid，购于美国Macrocyclic公司。所述PD-10柱是常规实验材料，从Pharmacia公司购买。所述超滤离心管是常规实验材料，从Amicon公司购买。
实施例四I、将1.2mL浓度为5.0mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；III、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
IV、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4℃条件下保存该抗体溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成浓度为33.45g/L的溶液；取该溶液10μL分两次加入到0.5mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4℃条件下反应12小时，获得反应溶液；VII、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0L NH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4℃；在相同条件下再重复所述透析过程3次；透析处理完成后，获得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8mg/mL的偶联物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05M；对该溶液中偶联物DTPA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4℃条件下保存该偶联物溶液；IX、将50μL的所述偶联物DTPA-3H11溶液和100μL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；该混和液在室温条件下反应30分钟，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99％的放射性药物90Y-DTPA-3H11或177Lu-DTPA-3H11。
在本实施例中，所使用的单克隆抗体3H11是溶于PBS的溶液，其浓度为5.0mg/mL。所使用的EDTA是乙二胺四乙酸溶液，其pH值为5.0，浓度为6.0mM，是常规试剂。所使用的DMF是无水二甲基甲酰胺溶液，是常规试剂。所使用的DTPA衍生物购于美国Macrocyclic公司。所述PD-10柱是常规实验材料，从Pharmacia公司购买。所述超滤离心管是常规实验材料，从Amicon公司购买。
权利要求
1.一种用于胃癌治疗的药物，包括抗体及放射性核素，其特征在于所述抗体为单克隆抗体3H11，所述放射性核素通过一个双功能连接剂标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体3H11为无色液体针剂。
2.根据权利要求1所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述单克隆抗体3H11包括鼠源性抗体及片断，基因工程制备的单链抗体、双链抗体、小型化抗体及嵌合抗体。
3.根据权利要求1所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述放射性核素为90Y，所述双功能连接剂为DOTA，所述放射性核素标记的单克隆抗体为90Y-DOTA-3H11。
4.根据权利要求1所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述放射性核素为177Lu，所述双功能连接剂为DOTA，所述放射性核素标记的单克隆抗体为177Lu-DOTA-3H11。
5.根据权利要求3或4所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述双功能连接剂包括DOTA的衍生物。
6.根据权利要求1所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述放射性核素为90Y，所述双功能连接剂为DTPA，所述放射性核素标记的单克隆抗体为90Y-DTPA-3H11。
7.根据权利要求1所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述放射性核素为177Lu，所述双功能连接剂为DTPA，所述放射性核素标记的单克隆抗体为177Lu-DTPA-3H11。
8.根据权利要求6或7所述的用于胃癌治疗的药物，其特征在于所述双功能连接剂包括DTPA的衍生物。
9.一种用于胃癌治疗的药物的制备方法，其特征在于I、将1.2mL浓度为5.0mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；III、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；IV、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4℃条件下保存该抗体溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DOTA-NHS，配制成浓度为33.45g/L的溶液；取该溶液10μL分两次加入到0.5mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4℃条件下反应12小时，获得反应溶液；VII、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0L NH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4℃；在相同条件下再重复所述透析过程3次；透析处理完成后，获得DOTA-3H11溶液；在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8mg/mL的偶联物DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05M；对该溶液中偶联物DOTA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4℃条件下保存该偶联物溶液；IX、将50μL的所述偶联物DOTA-3H11溶液和100μL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；该混和液在43℃条件下反应1小时，然后加入20μL EDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99％的放射性药物90Y-DOTA-3H11或177Lu-DOTA-3H11。
10.一种用于胃癌治疗的药物的制备方法，其特征在于I、将1.2mL浓度为5.0mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第二次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；III、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第三次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；IV、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPO4溶液2.0mL，第四次在4℃条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4℃条件下保存该抗体溶液，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成浓度为33.45g/L的溶液；取该溶液10μL分两次加入到0.5mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4℃条件下反应12小时，获得反应溶液；VII、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0L Na2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4℃，所述Na2HPO4溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mM NaCl；VIII、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0L NH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4℃；在相同条件下再重复所述透析过程3次；透析处理完成后，获得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8mg/mL的偶联物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05M；对该溶液中偶联物DTPA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4℃条件下保存该偶联物溶液；IX、将50μL的所述偶联物DTPA-3H11溶液和100μL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2M，再加入10μL90YCl3溶液或10μL177LuCl3溶液，所述90YCl3或177LuCl3溶于0.04M HCl溶液中；该混和液在室温条件下反应30分钟，然后加入20μLEDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99％的放射性药物90Y-DTPA-3H11或177Lu-DTPA-3H11。
全文摘要
本发明涉及一种用于胃癌治疗的药物及其制备方法，该药物包括抗体及放射性核素，抗体为单克隆抗体3H11，放射性核素通过一个双功能连接剂标记所述单克隆抗体3H11。由于肿瘤细胞表面表达特异抗原，利用抗体和抗原的特异性结合，通过抗体将放射性核素载带到肿瘤部位，并利用放射性核素衰变释放的β－粒子杀伤癌细胞以达到治疗的目的。本发明采用间接标记法，即在单克隆抗体和放射性核素之间引入一个双功能连接剂。这既可减小对抗体活性的影响，又可增强放射性药物的稳定性，同时提高肿瘤对放射性药物的摄取。与非放射性药物相比，放射性药物不仅能杀伤实体瘤表面的肿瘤细胞，同时通过放射性β－粒子杀伤实体瘤内部的肿瘤细胞，具有更强的杀伤力。
文档编号A61P35/00GK101091799SQ20061008896
公开日2007年12月26日 申请日期2006年7月27日 优先权日2006年7月27日
发明者王凡, 贾兵, 杨志 申请人:北京大学