专利名称：茚地那韦和氯喹在制备复方抗疟疾药物中的应用的制作方法
茚地那韦和氯喹在制备复方抗疟疾药物中的应用技术领域I本发明涉及一种新型复方抗疟药物的制备和应用。具体地讲，本发明涉及茚地那韦(Indinavir)和氯喹联合复方在制备治疗疟疾的药物组合物中的 应用。背景技术]疟疾在世界上分布广泛，它是危害人类最严重的虫媒传染病，是世界 三大传染病之一。目前全世界仍约有24亿人生活在疟疾流行区，每年3-5 亿人发病，其中150-270万人死亡；大约100万例5岁以下儿童死亡是由疙 疾和相伴其它疾病所致。而热带非洲国家疟疾发病人数超过全球柜疾发病总 人数的90%。氯喹曾一度是最经济最有效的一线抗疟药，到目前为止其仍是非恶性症 患者和对氯喹敏感的非重症恶性疟患者的首选药物。但自从上世纪60年代 以来，恶性疟原虫对主要抗疟药氯喹产生抗药性，抗药性已经遍及亚洲、美 洲、大洋州和广大非洲地区，并从单药抗药性向多药抗药性发展。为了提高 治疗效果，延缓抗性产生，WHO倡导抗疟药联合使用，即指同时应用2种 或多种各具有其独立作用和作用于疟原虫不同生化耙位的裂殖体杀灭药物， 以提高治疗效果及延缓疟原虫产生抗性。目前抗疟药联合治疗可分为两类，一类是非-青蒿素类药物联合治疗，另一类是青蒿素类药物与其他抗定:药联合治疗。目前市场上主导的抗疟药均为以青蒿素及其衍生物为基础的复方制剂。蛋白酶抑制剂是目前用于治疗人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)感染的高 效抗逆转录病毒疗法(HAART)中的一类药物。茚地那韦(Indinavir)是其 中一种强效蛋白酶抑制剂，其作为抗成人HIV感染药物已上市销售多年。 2004和2005年一些学者在体外培养的疟原虫中发现一些蛋白酶抑制剂可以 抑制疟原虫的生长，并在小鼠疟疾模型中进行了 Saquinavir, Ritonavir和 lopinavir的药物实验，但结果并不理想。除了 Ritonavir和 Ritonavir/lopinavir组合用药有部分降低疟原虫感染高峰值的作用外，其 它药物并没有抑制疟原虫的作用。我们前期研究发现在猴疟模型上，茚地那韦可有效的治疗猴疟并改善其 临床症状。具体方案是以静脉接种食蟹猴疟原虫感染恒河猴，建立猴疙疾 感染模型。当红细胞感染率达到1%以上时，采用鼻饲Indinavir 240mg/kg/d， 120mg/kg/d和60mg/kg/d q8hX7d治疗给药，通过血涂片检 测疟原虫红细胞感染率，与阴性对照组(鼻饲生理盐水)比较，以治后原虫 密度、原虫转阴时间、红细胞计数和体温等指标，检验Indinavir对猴賠疾 感染的治疗作用及其有效的治疗剂量。实验结果显示Indinavir 240mg/kg/d 和120mg/kg/d组均表现出显著的抑制疟原虫生长的作用，而60mg/kg/d组 有部分缓解临床症状的作用。根据药理实验中不同种属动物的等效剂量折算公式(公斤体重剂量 mg/kg)d A = d猴(O. 11/0. lll)*(4/70)l/3，茚地那韦(Indinavir)用于人疸疾 治疗的有效剂量不低于20mg/kg/d。但目前还没有茚地那韦与其它药物联合 制备^复方抗疟药的应用。世界卫生组织(WHO)推荐氯喹治疗-对氯喹敏感 的恶性疟时口服用药的总剂量为25mg/kg，但此剂量对氯喹抗性的恶性疾患者只能稍微改善临床症状和降低外周血无性期原虫感染率，而不能达到治愈 的疗效。发明内容1本发明要解决的技术问题是确定茚地那韦和氯喹的复方用于制备抗, 药的可能性和复方的有效剂量范围。本发明采用的技术方案是在细胞水平上检测茚地那韦和氯喹联合应用 对人恶性疟原虫株(包括对氯喹敏感的人恶性疟原虫株3D7和对氯喹抗性的 人恶性疟原虫株Dd2)疗效的影响。结果表明，氯喹和茚地那韦在剂量配比 从1:100到100:1 (指单药半数有效剂量的倍比)的范围内对3D7和Dd2均 有显著的协同效应，并且对Dd2的协同性更强。'在小鼠实验中，以标准的四天抑制试验"-Day Suppressive Test)考查 不同剂量组合的氯喹和茚地那韦复方药物对小鼠夏氏疙原虫(P/^/m^/wm c/^^^/O (包括氯喹敏感的夏氏疙原虫株ASS和氯喹抗性的夏氏疱原虫株 ASCQ)感染的影响。以外周血无性期疟原虫红细胞感染率为指标，检验复 方药物对小鼠疟原虫感染的治疗作用及其有效的复方治疗剂量。实验结果显 示茚地那韦在0.3g/kg/d到2.4g/kg/d能显著增强氯喹对ASS株和ASCQ株的 疗效，并且对ASCQ株的增效作用更加明显。氯喹10mg/kg/d和茚地那韦 1.8g/kg/d的复方药物可在治疗后彻底清除小鼠ASCQ株的感染，转阴率为 100%。根据药理实验中不同种属动物的等效剂量折算公式(公斤体重剂量mg/kg)d A=d小鼠(0.059/0.111)x(0.02/70)"3，氯喹和茚地那韦'的复方用于人疟 疾治疗(国际标准通常采用3天疗法)的各自有效总剂量为氯喹不低于mg/kg和茚地那韦不低于60mg/kg (茚地那韦不低于20mg/kg/d，)。根据文 献报道的急性毒性结果，小鼠口服茚地那韦的LD^(半数致死量)大于5g/kg， 换算到人的中毒剂量大于500mg/kg。而临床报道氯喹口服总剂量大于 100mg/kg，可出现明显的毒副作用。因此人在这种新型抗疟药复方的使用中， 氯喹的总剂量为12mg/kg-100mg/kg ，茚地那韦的总剂量为 60mg/kg-500mg/kg。本发明开发了 一种新型的复方抗疟药，并为挽救经济实用的氯喹重新应 用于疟疾治疗奠定了基础。
J图1:氯喹和茚地那韦联合对氯喹敏感的人恶性疟原虫株3D7的协同作用。 '图2:氯喹和茚地那韦联合对氯喹耐药的人恶性疟原虫株Dd2的协同作用。 图3:不同剂量茚地那韦对氯喹敏感的小鼠夏氏疟原虫株ASS的疗效。 图4:不同剂量茚地那韦对氯喹耐药的小鼠夏氏疟原虫株ASCQ的疗效。 图5:不同剂量氯喹对氯喹敏感的小鼠夏氏疟原虫株ASS的疗效。 图6:不同剂量氯喹对氯喹耐药的小鼠夏氏疟原虫株ASCQ的疗效。 图7:在ASS株疟原虫感染的小鼠模型中茚地那韦对氯喹的增效作用。 图8:在ASCQ株疟原虫感染的小鼠模型中茚地那韦对氯喹治疗的增效作用。 图9:在ASCQ株症原虫感染的小鼠模型中不同剂量组合的氯喹和茚地那韦 复方的疗效。[具体实施方式一 、 茚地那韦对恒河猴疟疾的治疗作用研究12只3 — 5岁恒河猴静脉接种1乂107个食蟹猴疟原虫后，随机分为4 组，艮卩Indinavir (240mg/kg/d q8h) 、 Indinavir (120mg/kg/d q8h) 、 Indinavir (60mg/kg/dq8h)和阴性对照组(鼻饲生理盐水)。疟原虫感染率达1%时 开始治疗，连续治疗7天。每日制备血涂片，计数红细胞感染率，连续3天 血检未发现疟原虫为阴性。与对照组比较，以治后原虫密度和原虫转阴时间 的改变作出评价。二、 在体外实验中评价茚地那韦和氯喹联合的抗疟作用采取固定比例法判断氯喹和茚地那韦对疟原虫抑制的协同作用。氯喹和 茚地那韦按照IC5o(半数最大抑制浓度)的比例分别设1:0， 1:1， 1:3， 1:5， 1:30， 1:100， 0:1， 3:1， 5:1， 30:1， 100:1的浓度配比，加入培养的对氯喹敏感的 人恶性疟原虫株3D7和对氯喹耐药的人恶性疟原虫株Dd2，作用48h后制备 血涂片，计算红细胞的疟原虫感染率。分别计算两种药物在单独使用和联合 使用时的各自IC5。，并进而计算各自分级抑制浓度(Fractional inhibitory concentration, FIC)。总FIC气联合用药中的茚地那韦IC5Q/单独用药中的茚 地那韦IC5Q)+ (联合用药中的氯喹IC5Q /单独用药中的氯喹IC5Q)。 FIC之和大 于l，表明两者相互拮抗；等于l，表明两者相互叠加；小于l，表明两者相 互协同。三、在小鼠实验中评价茚地那韦和氯喹联合的抗疟作用在小鼠中采用标准的四天抑制实验(4-Day Suppressive Test)评价氯喹 和茚地那韦对疟原虫抑制的协同作用。25±2g雌性NIH小鼠腹腔接种5xl07 个Pc/2akH^/ASCQ或3x107个Pc/w6m^/ASS，随机分组，经胃给予不同 剂量的氯喹、茚地那韦或两者的复方药物，同时设'立阴性对照组(等体积的 溶剂灌胃)。0天接种，并在接种后2-4小时首次给药，此后每天给药l次，共给药4次，第4天停药并剪尾制备血涂片，计算红细胞的疟原虫感染率。抑制率(Inhibition of growth, %)=(对照组感染率一 用药组感染率)/对照 组感染率xl00。/。。以对外周血疟原虫的抑制率为指标对药物的疗效作出评 价。连续两天涂片未发现疟原虫判断为阴性，即为彻底治愈。结果1. 茚地那韦对猴子疟原虫感染有确定的疗效。茚地那韦120mg/kg/d和240mg/kg/d组猴子在用药2天后原虫感染率明 显下降，在治疗5—7天原虫全部转阴，60mg/kg/d与阴性对照组比较无明显差别。2. 在体外实验中氯喹和茚地那韦联合对氯喹耐药(Dd2)和氯喹敏感(3D7) 的人恶性疟原虫的抑制具有协同增效作用。根据我们体外实验检测，氯喹对3D7的EC5。(半数有效浓度)为35nM， 对Dd2的EC5Q为90nM;茚地那韦对3D7的EC5G为20 y M，对Dd2的EC50 为12uM。如图l和图2所示，氯喹和茚地那韦按不同比例组合的FIC均小 于1，说明这两种药物联合对氯喹敏感的人疟原虫株和氯喹耐药的人賠原虫 株均有协同杀灭作用，并且对氯喹抗性的疟原虫株的协同作用更加明显。3. 在小鼠实验中氯喹和茚地那韦联合对氯喹耐药(ASCQ)和氯喹敏感 (ASS)的小鼠疟原虫的抑制具有协同增效作用。如图3和图4所示，茚地那韦口服用量0.3-2.4g/kg/d时，对ASS和ASCQ 小鼠疟原虫的抑制率较低，均不能达到50。％抑制率。如图5所示，氯喹对ASS的EDso约为1.5mg/kg， 4.5mg/kg可完全清除 疟原虫感染。如图6所示，氯喹对ASCQ的EDso约为2.5mg/kg， 10mg/kg不能完全抑制ASCQ的感染，即使100mg/kg的用量也不能完全清除ASCQ 感染(图9)。如图7所示，对氯喹敏感的ASS疟原虫，茚地那韦口服用量1.2-2.4g/kg/d 时，与氯喹的协同增效作用明显，较低剂量0.3-0.6g/kg/d时不影响氯喹的疗效。如图8所示，对氯喹耐药的ASCQ疟原虫，茚地那韦口服用量在较低剂 量0.3-0.6g/kg/d即可极显著提高氯喹的疗效。4.氯喹和茚地那韦联合在一定剂量比例可清除小鼠ASCQ疙原虫的感染。如图9所示，氯喹10mg/kg/d和茚地那韦1.8g/kg/d，可在四天抑制实验 中彻底清除氯喹抗性的疟原虫，转阴率为100%，而单独应用氯喹时，即使 达到100mg/kg/d，清除率也只有50% (图9)。CWoroquine和Indinavir的结构及其主要盐类Chloroquine (氯喹)，化学名为N'， N'-二乙基-N4-(7-氯-4-喹啉基)-l， 4-戊二胺。其盐类主要为磷酸盐。 分子式<formula>formula see original document page 10</formula>
ndinavir (茚地那韦)，化学名为[l(lS，2R),5(S)]-2,3，5-三脱氧-N— (2,3-二水合-2-羟基-lH-茚-l-基)-5-[2-[[(1，1-二甲基乙基)氨基]羰基]-4-(3-吡啶甲 基)-l-哌嗪基]-2-(苯甲基)-D-赤-戊酰胺。其盐类主要为硫酸盐。 分子式
权利要求
1、茚地那韦和氯喹在制备治疗疟疾的药物组合物中的联合应用。
2、 根据权利要求1所述复方药物的应用，其特征在于氯喹和茚 地那韦的有效剂量比为1:100 — 100:1。
3、 根据权利要求1或2所述复方药物的应用，其特征在于氯喹 使用总剂量为12mg/kg—100mg/kg，茚地那韦使用总剂量为 60mg/kg—500mg/kg。
全文摘要
本发明涉及茚地那韦(Indinavir)作为氯喹抗性逆转剂或氯喹增效剂在制备治疗疟疾药物组合物中的应用。在细胞水平检测茚地那韦和氯喹的不同浓度比1∶100-100∶1，均对敏感株3D7和氯喹耐药株Dd2均有显著的协同效应，并且表现出对氯喹耐药株的协同性更强。在小鼠感染夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)模型中，采用标准四天抑制实验(4-Day Suppressive Test)，发现茚地那韦对氯喹抗疟活性的增效作用在氯喹耐药株上表现的更加明显。氯喹10mg/kg和茚地那韦1.8g/kg的复方药物可在治疗后彻底清除小鼠的夏氏疟原虫氯喹抗性株，疟原虫转阴率为100％。此复方应用于人疟疾的防治总剂量为氯喹12mg/kg-100mg/kg和茚地那韦60mg/kg-500mg/kg。本发明开发了一种新型的复方抗疟药，并为挽救经济实用的氯喹重新应用于疟疾治疗奠定了基础。
文档编号A61K31/47GK101327217SQ20071002869
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者何正祥, 刘劲松, 张建存, 戴仁科, 莉 秦, 凌 陈, 陈小平 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院