专利名称：：从柴胡中获得提取物的方法及该提取物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及天然药物化学领域，具体说，涉及从柴胡中获得提取物的方法及该提取物的应用。
背景技术：
：柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWild.的干燥根，味苦，微寒，归肝、胆经，具有疏散退热，舒肝、升阳的作用，在本草中被列为上品。历代本草和现代中医的肝病用药中多以柴胡为君药。但柴胡的不同炮制品治疗病症侧重点不一，在用于治疗肝病时，常用其醋制品，与柴胡生品多用于解表退热相比，醋制品能缓和升散之性，有助于引药入肝，增强疏肝止痛的作用，适用于肝郁气滞的胁痛、腹痛及月经不调等证。目前，前人在柴胡中已经大量分到的柴胡皂苷类化合物为其疏肝解郁的主要物质基础。柴胡皂苷主要有柴胡皂苷a、c、d、e、f和h，其中最具促进胆汁分泌作用的活性成分是柴胡皂苷a、c、d，即提取物中柴胡皂苷a、c、d的含量越高，促胆汁分泌效果越好。现有技术对于柴胡活性部位传统的提取方法如下药材用醇提取后，先用石油醚萃取脱掉脂溶性成分，再用正丁醇萃取，正丁醇提取物即为总皂苷部位。但在进行柴胡不同提取物对大鼠胆汁分泌量的影响的药效学实验中，发现传统方法提取得到的正丁醇提取物分泌胆汁的效果并不理想。
发明内容为解决上述技术问题，我们改良了传统的柴胡活性部位的提取方法，得到了分泌胆汁效果明显提高的柴胡提取物。a)柴胡用醇渗漉，将醇蒸干，得流浸膏；b)将所得流浸膏用乙醇或水稀释成悬浊液，其特征在于，所述悬浊液依次分别用有机溶剂石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取，将乙酸乙酯层蒸干，得到柴胡乙酸乙酯提取物。将上述乙酸乙酯提取后的悬浊液继续用正丁醇提取，得到柴胡正丁醇提取物。上述步骤a)中的醇浓度大于90%，步骤b)中乙醇浓度小于30。％。优选地，所述的柴胡为醋制柴胡。醋制柴胡的制备方法如下在生柴胡中加入药材量20%的米醋(为市售镇江恒丰酱醋有限公司的米醋，pH=4.0)，浸润两天，然后放入烘箱中5(TC烘干，即为醋制柴胡(陈青莲，郑祥银.柴胡炮制品的泌胆作用探讨[J].中成药，1993，15(4):18-19)。本发明的提取方法具体如下将柴胡置于渗漉桶中，加入一定量95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入一定量浓度小于30%的乙醇溶液溶解成混悬液，先用石油醚萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取物；水层再用氯仿萃取，反复进行，直至色淡为止，将氯仿层蒸干，得到氯仿提取物；再继续用乙酸乙酯萃取，反复进行，直至色淡为止，将乙酸乙酯层蒸干，得到乙酸乙酯提取物；最后用正丁醇萃取，反复进行，直至色淡为止，将正丁醇层蒸干，得到正丁醇提取物；剩下的水层蒸干后，即得到水部位。上述的乙醇浓度均为体积比浓度。萃取每lkg柴胡所需的有机溶剂的体积为0.2L0.8L，优选0.4L左右。本发明还提供一种药物组合物，其含有所述的柴胡乙酸乙酯提取物或柴胡正丁醇提取物，和药学上可接受的辅料。本发明还提供所述的柴胡乙酸乙酯提取物或柴胡正丁醇提取物在制备利胆药物中的应用。由于本发明方法所得的醋制柴胡乙酸乙酯提取物中柴胡皂苷a、c、d的含量明显高于传统方法得到的醋制柴胡正丁醇提取物中柴胡皂苷a、c、d的含量，可知本发明方法得到的乙酸乙酯提取物的分泌胆汁效果明显优于传统方法得到正丁醇提取物。图1是根据表2数据所得的生柴胡和醋制柴胡不同提取部位等对大鼠胆汁分泌量影响的时效关系图，其中1为实施例2所得的生柴胡正丁醇提取物；2为实施例1所得的生柴胡乙酸乙酯提取物；3为实施例4所得的醋制柴胡正丁醇提取物；4为实施例3所得的醋制柴胡乙酸乙酯提取物；横坐标为时间；纵坐标为胆汁分泌量。从图中可以直观的看出，醋制柴胡的乙酸乙酯部位(即图中的3号样品)从60min到90min之间，其胆汁分泌量较其它样品有非常明显的提高，从90min到120min又回落到近给药前，具有显著的时效关系。图2a、2b、2c和2d分别是对比例2所得的醋制柴胡正丁醇提取物、实施例3所得的醋制柴胡乙酸乙酯提取物、实施例4所得的醋制柴胡正丁醇提取物和柴胡皂苷a、c、d的混合对照品的HPLC图谱。具体实施方式实施例1lKg生柴胡置于渗漉桶中，加入5L95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入25%乙醇溶液0.4L溶解成混悬液，先用石油醚萃取，每次加入石油醚0.3L萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取提取物；水层再用氯仿萃取，每次加入氯仿0.3L萃取，反复进行，直至色淡为止，将氯仿层蒸干，得到氯仿提取提取物；再继续用乙酸乙酯萃取，每次加入乙酸乙酯0.3L萃取，反复进行，直至色淡为止，将乙酸乙酯层蒸干，得到生柴胡的乙酸乙酯提取物。实施例2lKg生柴胡置于渗漉桶中，加入5L95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入25%乙醇溶液0.4L溶解成混悬液，先用石油醚萃取，每次加入石油醚0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取物；水层再用氯仿萃取，每次加入氯仿0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将氯仿层蒸干，得到氯仿提取物；再继续用乙酸乙酯萃取，每次加入乙酸乙酯0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将乙酸乙酯层蒸干，得到乙酸乙酯提取物；最后用正丁醇萃取，每次加入正丁醇0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将正丁醇层蒸干，得到生柴胡的正丁醇提取物。实施例3lKg醋制柴胡置于渗漉桶中，加入5L95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入25%乙醇溶液0.4L溶解成混悬液，先用石油醚萃取，每次加入石油醚0.7L萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取物；水层再用氯仿萃取，每次加入氯仿0.7L萃取，反复进行，直至色淡为止，将氯仿层蒸干，得到氯仿提取物；再继续用乙酸乙酯萃取，每次加入乙酸乙酯0.7L萃取，反复进行，直至色淡为止，将乙酸乙酯层蒸干，得到醋制柴胡的乙酸乙酯提取物。实施例4lKg醋制柴胡置于渗漉桶中，加入5L95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入25%乙醇溶液0.4L溶解成混悬液，先用石油醚萃取，每次加入石油醚0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取物；水层再用氯仿萃取，每次加入氯仿0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将氯仿层蒸干，得到氯仿提取物；再继续用乙酸乙酯萃取，每次加入乙酸乙酯0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将乙酸乙酯层蒸干，得到乙酸乙酯提取物；最后用正丁醇萃取，每次加入正丁醇0.4L萃取，反复进行，直至色淡为止，将正丁醇层蒸干，得到醋制柴胡的正丁醇提取物。对比例llKg生柴胡置于渗漉桶中，加入5L95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入25X乙醇溶液400ml溶解成混悬液，先用石油醚萃取，每次加入石油醚400ml萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取物；水层再用正丁醇萃取，每次加入正丁醇400ml萃取，反复进行，直至色淡为止，将正丁醇层蒸干，得到生柴胡的正丁醇提取物。对比例2lKg醋制柴胡置于渗漉桶中，加入5L95%乙醇溶液渗漉，将渗漉液蒸干，得到流浸膏，将流浸膏加入25X乙醇溶液400ml溶解成混悬液，先用石油醚萃取，每次加入石油醚400ml萃取，反复进行，直至色淡为止，将石油醚层蒸干，得到石油醚提取物；水层再用正丁醇萃取，每次加入正丁醇400ml萃取，反复进行，直至色淡为止，将正丁醇层蒸干，得到醋制柴胡的正丁醇提取物。药效学结果将以上实施例1到对比例2所得的各种提取物进行药效学筛选，具体步骤如下大白鼠实验前禁食12h，不禁水。乌拉坦(lg/kg)腹腔麻醉，将大白鼠背位固定，开腹，向总胆管近端插入一外径为lmm的塑料小管，结扎近十二指肠端胆管，收集流出胆汁，待胆流稳定后，收集0.5h的胆汁，作为给药前的胆汁流量。然后给药，再连续收集2h胆汁，每隔0.5h记录一次流量，共记录4次，药液由十二指肠注入，阴性对照组注入等容量的生理盐水，阳性对照组注入等容量的阳性对照溶液。测定结果做自身给药前后增减百分率计算，得到如下结果。表1:生柴胡正丁醇提取物及醋制柴胡正丁醇提取物对大鼠胆汁分泌量的影响胆汁量加inin(迈l)Q30min31~60min61~90min91120迈in表1显示，生柴胡正丁醇提取物与生理盐水对照组比较在给药后60分钟有一定的分泌胆汁作用；醋制柴胡正丁醇提取物与生理盐水对照组比较在给药后近卯分钟有较强的分泌胆汁作用，同时与熊去氧胆酸组(178.6mg/kg)相比有较强的分泌胆汁作用。即醋制柴胡正丁醇提取物分泌胆汁的效果优于生柴胡正丁醇提取物。表2:柴胡和醋制柴胡不同提取物对大鼠胆汁分泌量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>HPLC图谱用HPLC法测定以下样品的柴胡皂苷a、c、d的含量对比例2所得的醋制柴胡正丁醇提取物其中高效液相色谱条件如下-色谱柱DiamonsilC18(250x4.6mm);流动相乙腈一水梯度洗脱060min乙腈浓度5。/。80。/。(如下表)；时间(min)01015304055乙腈(o%)52528406080流速lml/min;柱温35°C;检测波长204nm;样品浓度10.725mg/ml;进样量20^1。得到图2a。所得色谱峰结果见表3:保留时间面积峰高柴胡皂苷a38.1808564410796柴胡皂苷d43.519123581521实施例3所得的醋制柴胡乙酸乙酯提取物其中高效液相色谱条件如下色谱柱DiamonsilC18(250x4.6mm);流动相乙腈一水梯度洗脱060min乙腈浓度5。/。80。/。(如下表)；时间(min)01015304055乙腈(％)52528406080流速lml/min;柱温35°C;检测波长204nm;样品浓度9.579mg/ml;进样量20^1。得到图2b。所得色谱峰结果见表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4所得的醋制柴胡正丁醇提取物其中高效液相色谱条件如下色谱柱DiamonsilC18(250x4.6mm);流动相乙腈一水梯度洗脱060min乙腈浓度5。/。80。/。(如下表)；<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>流速lml/min;柱温35°C;检测波长204nm;样品浓度10.094mg/ml;进样量20pl。得到图2c。所得色谱峰结果见表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>柴胡皂苷a、c、d的混合对照品:其中高效液相色谱条件如下色谱柱DiamonsilC18(250x4.6mm);流动相乙腈一水梯度洗脱060min乙腈浓度5。/。80。/。(如下表)，<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>流速lml/min;柱温35°C;检测波长204nm;样品浓度柴胡皂苷a:0.0432mg/ml;柴胡皂苷c:0.0324mg/ml;柴胡皂苷d:0.0695mg/ml;进样量20|ll。得到图2d。所得色谱峰结果见表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表3—6的结果我们可以看到，本发明方法所得的醋制柴胡乙酸乙酯提取物中柴胡皂苷a、c、d的峰面积之和最大(即图2b)，本发明方法所得的醋制柴胡正丁醇提取物中柴胡皂苷a、c、d的峰面积之和其次(即图2c)，而用传统方法得到的醋制柴胡正丁醇提取物中柴胡皂苷a、c、d的峰面积之和最小(即图2a)。即本发明方法得到的乙酸乙酯提取物的分泌胆汁效果优于本发明方法得到的正丁醇提取物，而本发明方法得到的正丁醇提取物又优于传统方法得到正丁醇提取物。权利要求1.从柴胡中获得提取物的方法，该方法包括如下步骤a)柴胡用醇渗漉，将醇蒸干，得流浸膏；b)将所得流浸膏用乙醇或水稀释成悬浊液，其特征在于，所述悬浊液依次分别用有机溶剂石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取，将乙酸乙酯层蒸干，得到柴胡乙酸乙酯提取物。2.从柴胡中获得提取物的方法，该方法包括如下步骤a)柴胡用醇渗漉，将醇蒸干，得流浸膏；b)将所得流浸膏用乙醇或水稀释成悬浊液，其特征在于，所述悬浊液依次分别用有机溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取，将正丁醇层蒸干，得到柴胡正丁醇提取物。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的柴胡为醋制柴胡。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，每lkg柴胡所需的有机溶剂的体积为0.2L0.8L。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，每lkg柴胡所需的有机溶剂的体积为0.4L。6.由权利要求1所述的方法制得的柴胡乙酸乙酯提取物。7.由权利要求2所述的方法制得的柴胡正丁醇提取物。8.药物组合物，含有权利要求6所述的柴胡乙酸乙酯提取物或权利要求7所述的柴胡正丁醇提取物，和药学上可接受的辅料。9.权利要求6所述的柴胡乙酸乙酯提取物或权利要求7所述的柴胡正丁醇提取物在制备利胆药物中的应用。全文摘要本发明提供一种从柴胡中获得提取物的方法，该方法包括如下步骤a)柴胡用醇渗漉，将醇蒸干，得流浸膏；b)将所得流浸膏用乙醇或水稀释成悬浊液，其特征在于，所述悬浊液依次分别用有机溶剂石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取，将乙酸乙酯层蒸干，得到柴胡乙酸乙酯提取物。本发明方法所得的柴胡乙酸乙酯提取物分泌胆汁的效果明显优于现有技术方法所得的柴胡正丁醇提取物。文档编号A61K125/00GK101284034SQ20071003935公开日2008年10月15日申请日期2007年4月11日优先权日2007年4月11日发明者刘全海,彤吴,姜仁吉,亮成,燕李,方杨,贺兴冬,帅陈,静陈申请人:上海医药工业研究院