专利名称：：一种肥胖症或脂肪肝治疗药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肥胖症或脂肪肝治疗药物。
背景技术：
：淫羊藿常见于亚洲和地中海地区，是一种辛辣性观赏草本植物。中国人称之为淫羊藿，大致的意思为"放肆的山羊草"。淫羊藿是一个属，包括多种相关植物，其中一些已作为药用，包括箭叶淫羊藿、小檗科淫羊藿、大花淫羊藿和朝鲜淫羊藿。箭叶淫羊藿是一种重要的传统中草药，在中国、日本和韩国被广泛用作滋补药和抗风湿药，并被证明能有效治疗骨质疏松、心血管疾病和肿瘤。淫羊藿苷(ICA)(分子量为676)，一种黄酮醇糖苷，是箭叶淫羊藿的主要成分。近来有文献报道，分离于淫羊藿的淫羊藿苷是一个神经介素U2受体(NeuromedinU2Receptor,NMU2R)的强力激动剂，能选择性激活NMU2R。淫羊藿苷给予食物诱导的肥胖(DIO)小鼠可以抑制进食，并降低体重。NMU2R激动剂调节进食行为和能量平衡的分子机制和信号途径尚不清楚。激动剂的一个可能效应是通过促肾上腺皮质释放激素(CRH)信号途径。已经表明，经脑室内给予CRH也能抑制大鼠进食。在(CRH)敲除的小鼠，神经介素U(NeuromedinU，NmU)对抑制摄食、增加耗氧量、调节体重的作用完全消失。在下丘脑室旁核(ParaventricularNucleus,PVN)区发现含有CRH的神经元。另外，NmU能刺激下丘脑释放CRH。这些资料强烈提示，激活NMU2R可能增加CRH释放，调节进食行为以及能量内平衡。进一步的研究，如NMU2R敲除小鼠或NMU-2R/CRH双基因敲除小鼠的表型分析，可能有助于完全理解该受体的分子基础和生理学功能。近来文献报道，动物脂肪酸合成酶(FattyAcidSynthase,FAS)是肥胖和肿瘤的一个潜在治疗靶标。鉴定新的FAS抑制剂一直引起人们很大的兴趣。现已发现，黄酮类以可逆和不可逆方式抑制FAS。并且证实，一种绿茶生物活性黄酮类化合物表没食子儿(EGCG)，通过减少能量吸收，增加脂肪氧化，可以使DIO小鼠变瘦。而且还发现，FAS抑制剂(浅蓝菌素和一个合成化合物C75)经全身和脑室内处理小鼠，可抑制进食，显著减轻体重。C75抑制下丘脑前期信号神经肽Y的表达，以来普汀(抗肥胖药)依赖性方式发挥作用，似乎由丙二酰辅酶A介导。因此，FAS可能是饮食调节方面的一个重要链环，是一个潜在的治疗靶标。有文献报道(LiuJandLouYJ，JPharmBiomedAnal.2004Oct29;36(2):365-370;LiuJetal.，Pha謹zie，2005,60(2)，120—125)，淫羊藿苷已被生物转化，至少被转化成3种代谢产物淫羊藿次甙II(分子量为514)，淫羊藿素(分子量为368)以及去甲淫羊藿素(分子量为354)。但对淫羊藿素通过抑制FAS，从而抑制小鼠进食及减肥的研究未见报道。
发明内容本发明提供一种以淫羊藿素作为有效成分的肥胖症或脂肪肝治疗药物。肥胖症或脂肪肝治疗药物中也可含有治疗有效量的淫羊藿素及可药用载体和/或赋形剂。本发明人通过试验证明淫羊藿素是一个非常有效的FAS拮抗物，给DIO小鼠口服淫羊藿素可强烈抑制进食，显著减轻体重。小鼠试验显示，淫羊藿素给药可降低肝脏的脂肪变性，并具有减轻脂肪变性肝脏缺血/再灌注损伤的程度。淫羊藿素具有被开发成一种肥胖症或脂肪肝治疗药物的巨大潜力。淫羊藿素的制备参考文献报道(叶海涌等，浙江大学学报(医学版)，2005，34(2):131-136)简述如下将箭叶淫羊藿磨成粉末，用溶剂萃取，萃取物通过硅胶柱层析，用溶剂洗脱，可制得淫羊藿素前体淫羊藿苷。再按照下列示意的反应路线，将淫羊藿苷通过水解反应制得淫羊藿素。淫羊藿苷淫羊藿素淫羊藿素的药理试验l.体外试验a)淫羊藿素具有抑制细胞脂肪酸生成的活性为了证实淫羊藿素抑制脂肪酸生成的活性，用不同浓度的淫羊藿素处理前列腺癌细胞LnCAP5小时，定量测定2-14C标记的醋酸盐在细胞脂质中的掺入量。如图1所示，0.5pM淫羊藿素抑制脂肪生成大于50%。更高浓度淫羊藿素以剂量依赖性方式减少脂肪酸生成。处理24小时后则进一步降低。b)淫羊藿素通过抑制FAS活性以降低细胞中脂肪酸生成为了证实淫羊藿素是一个FAS抑制剂，用不同浓度的淫羊藿素预处理LnCAP细胞蛋白质提取物，然后定量测定2-14C标记的丙二酸单酰辅酶A在脂肪酸中的掾入量。如图2所示，0.5淫羊藿素在体外降低FAS酶活性，酶活性小于50%。Westernblot分析表明，淫羊藿素不影响FAS蛋白水平。因此证实抑制脂肪酸生成是抑制FAS酶活性的直接结果，而不是通过降低FAS表达实现的。2.淫羊藿素能使DIO小鼠强烈抑制进食和显著减轻体重本试验应用DIO模型评价淫羊藿素对来普汀(抗肥胖药)抵抗的肥胖模型的作用。通过喂养C57BL6/J小鼠高脂肪饮食诱导肥胖症，高脂肪饮食中60%总热量来自于脂肪。对照小鼠喂食低脂肪饮食，其中10%总热量来源于脂肪。7周后，喂养高脂肪饮食的小鼠体重增加76±7%，而对照小鼠体重仅增加34±4%。如图3所示，给予剂量为50mg/kg或100mg/kg淫羊藿素，第一天可使DIO小鼠摄食减少25%或50%。淫羊藿素处理小鼠的摄食抑制表现为剂量依赖性效应。但是，在整个试验过程中淫羊藿素处理小鼠的这种摄食抑制并未呈现时间依赖性。尽管如此，在整个试验过程中经淫羊藿素处理的DIO小鼠的体重不断减轻(见图4)。淫羊藿素处理动物的这种体重减轻具有剂量依赖性和时间依赖性。分析DIO小鼠身体组成的目的是确定淫羊藿素反复给药引起的体重减轻是否主要源于脂肪减少。如表1所示，在14天治疗期间内，用100mg/kg和50mg/kg淫羊藿素分别处理的DIO小鼠，其身体脂肪重量失重差别明显(-6.1g和-3.7g)。这些身体脂肪含量的差别正是淫羊藿素处理的DIO小鼠与对照小鼠之间体重差别的主要原因。3.淫羊藿素具有减轻脂肪变性肝脏缺血/再灌注损伤的程度通过组织学分析进一步证实淫羊藿素在保护脂肪变性肝脏免于缺血/再灌注损伤方面的作用。采用评定坏死的标准分析苏木素和伊红染色样本(图5)，每张切片观察5个高倍视野，评分范围从0(无凋亡)到4(融合病灶)。结果显示，治疗组动物的肝坏死指数为0.80(n=10)，较对照组的2.57(n=10)有显著下降，给药后肝坏死指数平均下降68.9%。为进一步鉴定淫羊藿素保护脂肪变性肝脏减轻缺血/再灌注损伤的能力，对口服淫羊藿素治疗组小鼠接受缺血/再灌注损伤，然后测定血清丙氨酸氨基转移酶水平，以确定淫羊藿素是否减轻了肝细胞损伤。血清丙氨酸氨基转移酶水平见图6，口服淫羊藿素小鼠治疗组的血清丙氨酸氨基转移酶水平明显降低，为92.3IU/ml(n=10),而口服赋形剂对照组为1170IU/ml(n=10)。结果证实，与对照组相比，口服淫羊藿素的治疗组可显著保护肝脏，减轻缺血/再灌注的损伤。与痩鼠相比，脂肪变性肝脏的小鼠对伴有肠充血的全肝缺血/再灌注更敏感。实验评估再灌注后24小时动物生存的情况治疗组的生存率为100%，而对照组为65%,显示生存率有显著增加。4.淫羊藿素能降低肝脏的脂肪变性淫羊藿素能使脂肪变性的肝脏降低缺血/再灌注损伤，为了阐明其作用机制，确定淫羊藿素是否减少ob/ob鼠的肝脏的脂肪变性，使用油红O染色的定量分级评分。试验结果显示，缺血/再灌注前，未操作的对照组鼠样本的脂肪变性百分比为50%，而淫羊藿素给药的治疗组鼠样本的脂肪变性百分比明显下降(18.5%)(图7)(n=6)。此外，淫羊藿素给药的肝脏从大泡性脂肪变改变为小泡性脂肪变。考虑到脂肪中可能有某些特别的成分对较高等级的脂肪变移植器官的衰竭的重要性，使用气相色谱氢焰离子化检测法测定肝脏的脂肪酸成分，软脂酸和亚油酸含量如图8和图9(以标准曲线下面积显示)所示。这两种脂肪酸大量存在于脂肪变性的肝脏，他们的含量在淫羊藿素给药后均明显下降，缺血/再灌注前对照组的脂肪酸成分软脂酸和亚油酸的标准曲线下面积各为6856和1823，而治疗组各为2116.6和689。试验证实淫羊藿素能降低肝脏中存在的脂肪酸量，即显著降低肝脏的脂肪变性。此外还进行了下列试验淫羊藿素在小鼠体内的药代动力学试验口饲给药的淫羊藿素在4个小鼠体内的药代动力学参数见表2,这些实验数据说明淫羊藿素能在体内保持一定的药物浓度，有利于治疗肥胖症或脂肪肝的效果。给药后淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验受试小鼠处死后进行病理分析，结果显示，以单次剂量1000mg/kg和多次剂量200mg/kg(Q2DX15)给予淫羊藿素，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。由以上药理试验的效果证明，来源于天然物质中草药箭叶淫羊藿的淫羊藿素具有抑制脂肪酸生成的活性；淫羊藿素是一个有效的FAS抑制剂，能通过抑制FAS活性以降低细胞中脂肪酸生成；淫羊藿素能使DIO小鼠强烈抑制进食和显著减轻体重，且体重减轻具有剂量依赖性和时间依赖性；淫羊藿素具有减轻脂肪变性肝脏缺血/再灌注损伤的程度，应用ob/ob小鼠模型测定了淫羊藿素对缺血/再灌注损伤标记物血清丙氨酸氨基转移酶，试验结果图6显示治疗组的血清丙氨酸氨基转移酶水平较对照组明显降低；淫羊藿素能降低肝脏中存在的脂肪酸量，即能显著降低肝脏的脂肪变性。此外，淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验结果也显示未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。因此淫羊藿素是一种有效的具有很大开发前景的肥胖症/或脂肪肝治疗新药，治疗药物中也可含有有效量的淫羊藿素及通常已知常规的可药用载体和/或赋形剂。例如Captisol，作物油，羧甲基纤维素钠。口服的有效剂量推荐为每天750-1000mg/体表面积M2，持续两周为一疗程。具体病例可由医师根据病情调整。表1淫羊藿素处理对DIO小鼠身体组成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注括号内为标准误差平均值。表2淫羊藿素在小鼠体内的药代动力学参数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>图1是LiiCAP细胞经淫羊藿素处理后的脂肪生成-淫羊藿素浓度曲线图。图2是LnCAP细胞经淫羊藿素处理后的脂肪酸合成酶-淫羊藿素浓度曲线图。图3是淫羊藿素抑制DIO小鼠摄食示图。图4是淫羊藿素治疗导致DIO小鼠体重减轻示图。图5是对照组和治疗组的坏死指数示图。图6是对照组和治疗组的血清丙氨酸氨基转移酶水平示图。图7是对照组和治疗组的脂肪变性百分比示图。图8是对照组和治疗组的肝脏中脂肪酸(软脂酸)的含量示图。图9是对照组和治疗组的肝脏中脂肪酸(亚油酸)的含量示图。具体实施方式实施例1淫羊藿素的制备(参见叶海涌等，浙江大学学报(医学版)，2005，34(2):131-136)取在中国南部山区采集获得的箭叶淫羊藿2kg磨成粉末，然后用95%乙醇(10L)萃取。获得250g浓縮原料，然后用2.5L氯仿、乙酸乙酯和n-丁醇进一步萃取。将8g乙酸乙酯萃取物和10gn-丁醇萃取物装入硅胶层析柱，用CHC13-MeOH-HC00H(15:1:0.5)和CHCl3_Me0H(8:2)分别洗脱。通过这一过程，可制得300mg淫羊藿素和去甲淫羊藿素前体淫羊藿苷。然后按照以下简要描述的方法将前体水解，即可制得淫羊藿素。溶液A:将80mg前体超声溶解于18ml甲醇溶液中；溶液B:500U(0.433g)纤维素酶溶于180ml(0.1mol/L)，pH5.0乙酸缓冲液中。一边搅拌一边将溶液A缓慢加入溶液B中，然后将所得混合物在37°C的振荡水浴中孵育过夜，以充分水解连接在前体上的葡萄糖和鼠李糖。第二天用三份等体积(约200ml)的乙酸乙酯萃取，并将有机物层在旋转蒸发仪上真空干燥得淫羊藿素(150mg)。实施例2用(2-14C)醋酸盐掺入法测定淫羊藿素对细胞脂肪酸生成的抑制活性用不同浓度的淫羊藿素处理LnCAP细胞5小时或24小时后，2-"C标记的醋酸盐(57mCi/mmol;2)iCi/dish;AmershamBiosciences)加入LnCAP细胞培养基中。孵育4小时后，收集细胞和培养基，重悬离心收集的细胞于O.SmlPBS。应用BlighDyer法(SwinnenJ.V.etal.，Endocrinology1996;137:44684474)抽提脂类，通过闪烁计数法定量测定细胞脂类的(2-14C)醋酸盐掺入量。获得的结果被标准化为样品蛋白质含量。淫羊藿素处理LnCAP细胞后脂肪生成-淫羊藿素浓度曲线图见图l。实施例3淫羊藿素对LnCAP细胞提取物脂肪酸合成酶活性抑制的试验利用LnCAP细胞蛋白抽提物测定FAS酶活性(BrusselmansK.etal.,JBiolChem.2005Feb18;280(7):5636-5645)。通过离心收集LnCAP细胞，重悬于低渗缓冲液中(lmMEDTA，20mMTris-HCl,pH7.5)，然后应用BCA法(Pierce)测定样品蛋白质含量。等量的蛋白(50pg)与不同浓度的淫羊藿素(0.03-30pm)置于2.5ml磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)，在37。C预孵育30分钟。之后加入20nl反应液[2.5mMNADPH，1.25mM乙酰-辅酶A，1.25mM丙二酰-辅酶A,0.02mM[2-"C]丙二酰-辅酶A(60mCi/mmol;PerkinElmerLifeSciences)],37。C再孵育15分钟，加入3ml冰冷的lM盐酸/甲醇混合液(6:4,V/V)终止反应，并用石油醚抽提脂肪酸，通过闪烁计数分析掺入2-"C的丙二酰辅酶A。结果如图2所示。实施例4用淫羊藿素治疗DIO小鼠抑制进食和减轻体重的试验用高脂肪饮食(D12492)或低脂肪饮食(D12450B)(ResearchDiets,NewBrunswick,NJ)喂养C57BL6/J小鼠7周，制备DIO小鼠。高脂肪饮食中60%热量是脂肪，以猪油为主，而低脂肪饮食只有10%热量来源于脂肪。每周2次称重。7周后，喂养低脂肪饮食的小鼠体重增加34±4%，而喂养高脂肪饮食的小鼠体重增加>70%，被定义为DIO小鼠。适应7天后，小鼠被随机分成3个组第一组为对照组，每天腹腔内注射赋形剂1%羧甲基化纤维素钠，共10天。第二组和第三组为治疗组，用淫羊藿素(以1%羧甲基化纤维素钠配制)治疗，每天口服，分别为50mg/kg和100mg/kg，共10天。每天数次监视摄食情况，共5天。每天测定体重1次，共2周。抑制迸食和减轻体重结果见图3和图4。身体组成分析(见表1):处死动物，动物尸体贮存在-80'C。分析时取出，除去胃肠道，剩余尸体在6(TC干燥。湿重与干重的差即为尸体水重。应用索克斯雷特萃取器和石油醚萃取脂质测定干尸的脂肪量(ChenRZetal.,EurJPharmacol.2004Jul8;495(1):63-66)。萃取后干重即为无脂肪余重。去除内脏的尸重减去脂肪重即为无脂肪重。实施例5用淫羊藿素治疗ob/ob小鼠(肥胖小鼠，n型糖尿病动物模型)脂肪变性肝脏缺血/再灌注损伤的试验动物喂养6-8周成年雄性ob/ob小鼠(25-28g)购自Jackson实验室(BarHarbor，ME)。每笼4只，在温度、光线均可控的房间内饲养，明暗周期为12小时，自由饮食。淫羊藿素给药淫羊藿素用1%羧甲基纤维素钠粉剂配制。治疗组按100mg/kg口月艮5天。对照组用1%羧甲基纤维素钠口服5天。缺血/再灌注按照文献(ChavinKDetal.，JBiolChem，1999;274:5692-5700;ChavinKDetal.，AmJTransplant,2004;4:1440-1447)进行肝脏缺血/再灌注。简述如下，戊巴比妥麻醉小鼠(50mg/kg)，小切口打开腹腔，暴露肝脏。以无创伤血管夹钳闭肝门造成缺血。局部缺血15分钟后解除血管夹，关闭腹腔，缝合切口。将小鼠转至温控的笼子中恢复，自由饮食。组织学染色试验苏木素和伊红染色如文献所述(PreeceA.，AManualforHistologicTechnicians.3rded.Boston,Mass:CarolinaPress;1985)，坏死的分级依照一个改良的评分标准(0-4)(NeilDAetal.,Transplantation,2001;71:1566-1572)。每张切片分析与中央静脉有关的5个高倍视野。图5是对照组和治疗组的肝坏死指数示图。血清丙氨酸氨基转移酶测定在麻醉状态下开胸，从右心房收集全血，室温放置15分钟待凝固，室温3500g离心5分钟，收集血清。然后测定血清丙氨酸氨基转移酶活性，以RJ/ml表示。测定结果见图6。红油O染色试验红油O染色如文献所述(LunaLG,editor,ManualofHistologicStainingMethodsoftheArmedForcesInstituteofPathology.3rded.NewYork,NY:McGraw-HillBlakistonDivision;1968)。使用红油O染色的定量分级评分，图7是对照组和治疗组的脂肪变性百分比示图。实施例6脂肪变性肝脏中的脂肪酸含量测定肝脏的脂肪酸含量测定使用气相色谱氢焰离子化检测法(GC/FID)(参见FioriniRNetal.,Hepatology，2003;38:562A)简述如下将肝脏样本制成匀浆，氯仿-甲醇(2:1)混合物提取脂质。匀浆经有机分离滤器分离，去除水分和肝脏匀浆。加入BF3-10n/。甲醇进行催化反应，将脂肪分解成自身成分脂肪酸甲酯。然后将试管置于蒸气浴45分钟，促使反应完成。样本经氮蒸气干燥后，盖封，冷冻(-8(TC)备用。分析前将其重新溶解于甲醇(500pl)，使用Agilent7683自动进样器进样，进样口选择脉冲不分流模式，Agilent6890气相色谱仪，DB-5(内径30mmx0.25mm，薄层厚度0.25)毛细管柱。柱温保持在70°C2分钟，而后温度以每分钟15'C的梯度增至300°C，保持12分钟。氢焰离子化检测法检测。色谱峰通过对比FAME标准鉴定，肝脏的脂肪酸成分软脂酸和亚油酸含量数据显示为曲线下面积，以总蛋白校正。图8和图9分别是对照组和治疗组肝脏中脂肪酸软脂酸和亚油酸的标准曲线下面积示图。权利要求1.一种肥胖症或脂肪肝治疗药物，其特征在于该药物是以淫羊藿素作为有效成份。2.如权利要求1所述的肥胖症或脂肪肝治疗药物，其特征在于该药物中含有治疗肥胖症或脂肪肝的有效量的淫羊藿素及可药用载体和/或赋形剂。全文摘要一种以淫羊藿素作为有效成分的肥胖症或脂肪肝治疗药物。药理试验效果证明淫羊藿素是一个有效的脂肪酸合成酶抑制剂；淫羊藿素能对DIO小鼠强烈抑制进食和减轻体重；淫羊藿素能降低肝脏的脂肪变性；淫羊藿素具有减轻脂肪变性肝脏缺血/再灌注损伤的程度。且淫羊藿素对小鼠的急性毒性试验显示无毒性。因此淫羊藿素是一种具有很大开发前景的肥胖症或脂肪肝的治疗新药。文档编号A61P3/04GK101284000SQ200710039289公开日2008年10月15日申请日期2007年4月10日优先权日2007年4月10日发明者南张,殷正丰,邱日辉申请人:殷正丰;张南;邱日辉