专利名称：一种药物组合物在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及养血清脑颗粒在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用。
背景技术：
世界上脑血管疾病的平均发病率140 200/10万人口，平均死亡率100/10万人口，是 发病率和死亡率较高的病种。改善脑血管损伤对挽救生命和降低医疗财政都有着重要的意义。
缺血再灌注引起的脑血管损伤约占脑血管损伤原因的60%左右。缺血再灌注后，黏附于血管 内皮的白细胞释放大量过氧化酶和蛋白酶，损伤血管内皮细胞和基底膜，引起血管通透性增 加和血浆白蛋白漏出，造成血管周围组织的水肿。过氧化物刺激又可引起血管周围的肥大细 胞脱颗粒释放发炎性黏附和白蛋白外漏，血管周围组织的水肿从血管外压迫血管，血管内皮 细胞的肿胀和白细胞黏附，血小板积聚等都称为阻碍血流的因素，导致再灌注后不复灌的区 域形成。
养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛为主要成 分构成的中药复方制剂，1996年被中国国家食品与药品监督管理局(SFDA)作为治疗头痛， 眩晕和脑血管疾病的中药复方制剂，批准在中国临床应用。我们以往的研究已经证实了养血 清脑颗粒可以抑制自发性高血压和脑中风易发性大鼠的血压、延缓脑中风的发病时间、改善 脑血流量。但是，有关养血清脑颗粒对缺血再灌注引起的脑微循环障碍是否具有改善作用未 见报告，尤其是关于养血清脑颗粒抑制白蛋白外漏作用而改善微循环的研究也不曾报道。
发明内容
本发明提供了一种药物组合物在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用，尤其是在制备抑制 细静脉内白蛋白外漏药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物在制备预防和治疗白蛋白外漏所致微循环障碍药物中的 应用，尤其是在心脑血管药物中的应用。
本发明是通过以下方案实施
本发明的一种药物组合物在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用，其中组合物是由以下重量百分比含量的原料药制成，当归4 9% 川粤4~9% 白芍2~8% 熟地2~8% 勾藤 10~15% 鸡血藤10 15%夏枯草10 15% 决明子10~15% 珍珠母10~15% 元胡 4 9% 细辛0.5~2%。
本发明优选的药物组合物由以下重量百分比含量的原料药制成当归6.75%川芎 6.75% 白芍5.4% 熟地5.4% 勾藤13.5% 鸡血藤13.5% 夏枯草13.5% 决明子 13.5% 珍珠母13.5% 元胡6.75% 细辛1.34%。
本发明的药物组合物制成药学上可以接受的制剂，优选颗粒剂。
本发明的药物组合物制剂通过以下步骤制备
按上述比例取药材，加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙 醇，静置24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.3 1.4，出膏率为10%，取清膏、 蔗糖和糊精按l: 3: 1的比例制成颗粒。其中，制剂部分还可以按照常规的工艺方法制成其 它药剂学上的任何一种剂型。
经过大量的试验研究，发现本发明的药物组合物有抑制白蛋白外漏的作用，尤其是在制 备抑制细静脉内白蛋白外漏药物方面的应用。本发明药物组合物还可以用在制备治疗白蛋白 外漏所导致的微循环障碍药物中的应用，优选制备治疗心脑血管微循环障碍药物中的应用。
本发明通过对FITC标记白蛋白细静脉外漏的动态、连续、可视化观察，首次证明了中药 组合物预给药可以抑制缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉白蛋白血管的外漏。
缺血再灌注后由血管内皮细胞和黏附白细胞产生过氧化物是血管内皮细胞和血管基底膜 损伤和血浆白蛋白外漏的主要原因之一，同时本发明中扫描电镜观察的结果也表明再灌注1 小时后的沙鼠大脑皮层细静脉血管内皮细胞突起增多，连接间隙增宽，周围出现水肿，也促 使血浆白蛋白外漏。药物组合物的预给药则抑制了再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉血管内皮细 胞连接间隙的增宽，内皮相对变得光滑，其血管周围水肿减轻，从而减轻缺血再灌注后脑血 管内皮细胞的损伤，抑制缺血再灌注后脑血管的白蛋白外漏的作用，改善脑血管微循环作用。
本发明中扫描电镜观察的结果证明了药物组合物的预给药减轻缺血再灌注后脑血管内皮 细胞的损伤和药物组合物抑制缺血再灌注后脑血管的白蛋白外漏的作用可能与保护血管内皮 作用相关，而其保护血管内皮的作用可能与其抑制白细胞血管内皮的黏附和血管壁过氧化物 的产生有关。
下面结合试验例对本发明的有益效果进一步说明
试验例 一 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响 (一)实验方法1、材料
动物蒙古沙土鼠，雄性，体重65 90g，购于首都医科大学实验动物部，合格证号
SCXK (京)2000-0012。在北京大学医学部动物中心，按北京大学医学部实验动物处理规定， 自由进食饮水，单笼词养，温度22°。，相对湿度40%， 12小时切换灯源(早晨7点开灯)。
养血清脑颗粒实施例一的中药组合物制剂即养血清脑颗粒由天津天士力制药股份有限 公司生产，批号Z10960082。生产过程根据严格的现代生产工艺，药物成分标准化。养血清 脑颗粒的主要成分是当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛，实验前配 制成80mg/ml和160mg/ml的水溶液。
化学试剂Dihydrorhodamine 123 (DHR)购买于美国Eugene公司；异硫氰酸荧光素标 记白蛋白(FITC-albumin)购买于美国SIGMA公司;Rhodamine 6G perchlorate购买于美国 FLUKA公司；乌来糖(Urethane)购买于中国上海天莲精细化工有限公司生产。
2、 试验组和对照组的动物模型制备
(1) 缺血再灌注组
取20%乌拉坦，按2.0g/kg.bw的用量，经腹腔注射麻醉蒙古沙土鼠。在颈部正中切开， 分离气管，连接小动物呼吸机(ALC-V8)，在整个观察过程保持机械通气。特殊设计的闭合器
(一根细的聚乙烯导管和一根粗的塑料管组成的套索)放置在双侧颈总动脉而不影响血流。 暴露股静脉，插入并留置直径为5mm的聚乙烯导管。切开脑部皮毛，用手提式颅钻在前囟点 前开一3X3mm的颅窗。将37度的人工脑脊液连续滴加在颅窗上以保持大脑表面湿润。用连 接于荧光摄像机(C7190, HAMAMATSU， J邻an)的正立生物显微镜(DMLFS， LEICA， Germany), 用10倍物镜选择直径在30-50 um， 200um长没有明显弯曲的细静脉，在监视器上基础观察
(J2118A， TCL， Huizhou, China) 10分后，闭索蒙古沙土鼠双侧颈动脉(缺血)，30分后解 除闭索(再灌注)。连续观察并用连接于荧光摄像机刻录机(DVR-R25， Malata, China)记录 微循环动态60分钟。
(2) 假手术组
即不闭索双侧颈动脉，其它操作同缺血再灌注组。
(3) 养血清脑颗粒给药组
在缺血再灌注90分钟前,用灌胃管，灌胃给予养血清脑颗粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操 作同缺血再灌注组。
3、 测定方法
在基础观察前10分钟，将50mg/kg. bw的FITC标记的血浆白蛋白经股静脉缓慢推注。用波长488nm的氦氖激光束照射在开颅部位，用共聚焦显微镜系统观察并纪录在缺血前，以及再 灌注开始、10分、30分、60分时同一视野内细静脉内外FITC标记荧光图像。用图像分析软 件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)测定各个时间点细静脉内(Iv)和 血管外(Ii) FITC标记白蛋白的萤光强度。以缺血再灌注前的细静脉血管外的FITC萤光强 度(Ii)与细静脉血管内的FITC萤光强度(Iv)的比值为基础值，用各时间Ii/Iv的比值与 基础值的比表示FITC萤光强度的变化，以判定细静脉内白蛋白向血管外漏出的动态。
数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析oneiay analisis of variance (ANOVA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p〈0. 05为显著性差异。 (二)结果
图1是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠脑细静脉FITC标记白蛋白漏 出的图像。在缺血再灌注前，假手术蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙鼠和养血清脑颗粒+缺血再 灌注蒙古沙鼠均没有观察到FITC标记白蛋白漏出细静脉外。在再灌注60分时，假手术蒙古 沙鼠几乎没有观察到脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以观察到 FITC标记白蛋白的明显漏出。养血清脑颗粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后60分时，只 有少量FITC标记白蛋白的漏出于细静脉外。可见养血清脑颗粒组有明显抑制细静脉血浆白蛋 白外漏的作用
试验例二不同剂量的养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出影响
(一) 试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组养血清脑颗粒0^g/kg+缺血再灌注组，养血清脑颗0. 8g/kg + 缺血再灌注组在缺血再灌注90分钟前，分别用灌胃管，灌胃给予养血清脑颗粒水溶液 0. 4g/kg. bw和0. 8g/kg. bw，其它操作同试验例一。
3、 测定方法同试验例一
(二) 结果
图2表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.紐/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉FITC标记白蛋白漏出的连续变化。假手术组在本观察期间，脑细静脉FITC标记白蛋白的仅有少量的漏出。缺血再灌注 组从再灌注开始就可观察到FITC标记白蛋白的漏出，并持续增加。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺 血再灌注组在再灌注60分显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。 养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再灌注30分以后显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静 脉FITC标记白蛋白的漏出。
试验例三养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细胞超微结构的影响
(一) 试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组同试验例一
3、 投射电镜标本的制备
在再灌注60分钟后，经左心室以10ml/分钟灌注生理盐水将血管内的血液冲洗干净后， 以3ml/分钟的速度灌注固定液，固定液成分为4%甲醛，2%戊二醛，0. 1M磷酸缓冲液。 灌注40分钟后，然后迅速取下整个大脑，冠状切面切成卜2mm厚组织片，然后转移到3%戊 二醛固定液中4。C固定过夜，然后用0. 1M磷酸缓冲液冲洗三次，再用1%俄酸固定液41:固定 2小时。再用系列丙酮脱水，用Epon812树脂包埋剂包埋，6CTC孵育48小时。然后进行修 块，切成60nm厚的组织片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，再用JEM-1230透射电镜观察(JEM 1230， JEOL, J印an) o
4、 扫描电镜标本制备
灌流后迅速取下整个大脑，切成大约几个毫米宽的小方薄片。先用戊二醛固定2小时， 用O. 1M磷酸缓冲液冲洗，再用O. 1M磷酸缓冲液配置的0A固定2小时，用系列酒精脱水， 标本移入醋酸戊酯。样品放在干燥器样品盒，用C02临界点干燥法，使样品干燥而不变形。用 导电胶将样品粘在样品托上，然后在离子镀膜仪中镀金3分钟，以使样品表面导电。最后在 扫描电镜JSM-5600LV(JSM-5600LV, JE0L， Japan)下观察。
(二) 结果
图3是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠再灌注60分后 的大脑皮质毛细血管的透射电镜和扫描电镜的图象。图a， b， c是透射电镜图像，假手术组a可以观察到血管内皮光滑，血管周围组织的无水肿现象。缺血再灌注组b可以观察到血管 周围组织出现明显水肿。养血清脑颗粒+缺血再灌注组c可以观察到血管周围水肿明显减轻。 图d, e， f是扫描电镜图像，假手术组d蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮光滑，内皮细胞 间连接紧密。缺血再灌注组e蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮可以观察到血管内细胞众多 的隆起，内皮细胞连接处，细胞间相互嵌合的指状突起肥大，且内皮表面出现许多突起的小 泡。养血清脑颗粒+缺血再灌注组f蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮较光滑，连接处指状突 起和小泡明显减少。
图1养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响
图2不同剂量养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响 图3蒙古沙鼠再灌注60分后的大脑皮质毛细血管的透射电镜和扫描电镜的图象。 其中图l中所示Sham:假手术组，I/R:缺血再灌注组，CG+I/R:养血清脑颗粒+缺血再
灌注组；图2中CG0.4+I/R:养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，CG0.8+I/R:养血清脑颗
粒0.8+缺血再灌注组。图3中所示的图a、 b、 c是投射电镜图象，图d、 e、 f是扫描电镜图
象；CJ:细胞连接；V:小囊泡。
具体实施例
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本 发明的限制。
实施例一 药物组合物制剂
(1)取当归67.5g，川芎67.5g，白芍54g，熟地54g，勾藤135g，鸡血藤135g，夏枯草135g， 决明子135g，珍珠母135g，元胡67.5g，细辛14.5g;
(2)将上述药材加水提取3次，每次l小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇，静 置24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.4，出膏率为10%，取清膏、蔗糖和糊 精按l: 3: 1的比例制成颗粒剂125袋。 实施例二药物组合物制剂
(1)取当归80g，川萼80g，白芍80g,熟地80g，勾藤120g，鸡血藤120g，夏枯草120g,决明子120g，珍珠母120g，元胡70g，细辛10g;
(2)将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇，静 置24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.3，出膏率为10%，取清膏、蔗糖和糊 精按l: 3: 1的比例制成片剂200片。
实施例三中药组合物制剂
(1) 取当归40g，川芎40g，白芍20g，熟地20g，勾藤100g,鸡血藤100g，夏枯草100g， 决明子100g，珍珠母100g，元胡70g，细辛10g;
(2) 将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇，静 置24小时沉淀，取上清液浓缩成浸膏，相对密度为1.3，出膏率为10%，取清膏、蔗糖和糊 精按l: 3: 1的比例制成胶囊100粒。
权利要求
1、一种药物组合物在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用，其中，所述的组合物是由以下重量百分比含量的原料药制成当归4～9％川芎4～9％白芍2～8％熟地2～8％勾藤10～15鸡血藤10～15％夏枯草10～15％决明子10～15％珍珠母10～15％元胡4～9％细辛0.5～2％。
2、 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物是由以下重量百分比含量的原 料药制成当归6.75% 川芎6.75% 白芍5.4% 熟地5.4°/。 勾藤13.5% 鸡血藤 13.5%夏枯草13.5% 决明子13.5% 珍珠母13.5% 元胡6.75% 细辛1.34%。
3、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的白蛋白是指细静脉内白蛋白。
4、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的抑制白蛋白外漏是指改善白蛋白外漏所导 致微循环障碍。
5、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的抑制白蛋白外漏是指改善白蛋白外漏所导 致冠心病。
6、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的抑制白蛋白外漏是指改善白蛋白外漏所导致脑微循环障碍。
7、 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的药物组合物制成药学上可以接受的制剂。
8、 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的药物组合物制成颗粒剂。
9、 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物是按照下列方法制成按比例取药材，加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇， 静置，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.3 1.4，制成制剂。
全文摘要
本发明涉及医药领域，尤其是涉及药物组合物在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用。本发明通过对缺血再灌注引起沙鼠大脑皮层细静脉内FITC标记白蛋白细静脉外漏的动态、连续、可视化观察，首次证明了药物组合物预给药可以抑制缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉白蛋白血管的外漏，是理想的预防和治疗白蛋白外漏所致的微循环障碍药物。
文档编号A61K36/185GK101428093SQ20071015007
公开日2009年5月13日 申请日期2007年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者徐想顺, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司