专利名称：：含白蛋白为有效成分的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明提供了一种含有白蛋白为有效成分的药物组合物。本发明的组合物对于治疗如角膜和结膜损伤及干眼等疾病是有用的。本发明的组合物能增加眼表上皮粘蛋白的分泌，并能扩散油。此外本发明提供利用该组合物治疗角膜和结膜损伤、治疗干眼病、以及增加眼表上皮粘蛋白分泌的方法。
背景技术：
：角膜和结膜损伤是由表皮至上皮形成缺损而造成的。其原因可能包括病理因素如干性角膜结膜炎(干眼)、各种角膜结膜炎、过敏及微生物(例如病毒、细菌、真菌等)感染；化学因素如化学药品引起的细胞毒性以及酸和碱形成的腐蚀；物理因素如眼干燥、外界物质(例如隐形眼镜等)及热水造成的损伤等。近来报导眼组合物(例如氯化苯甲烃铵、氯丁醇等)和眼药(例如氨基糖苷类抗菌素、非甾类消炎药、碘苷、匹马菌素等)中的抗菌剂造成角膜上皮(角膜外层)损伤。目前，为治疗角膜和结膜损伤，施用硫酸软骨素、谷胱甘肽、透明质酸、纤连蛋白、EGF等，或为了补充泪液，也施用人造泪液，但这些治疗的效果仍不理想。干眼被定义为泪水质量下降或改变的一种疾病，而不论角膜和结膜损伤是否存在(YamadaetalGANKI43，1289-1293(1992))。有多种因素可导致干眼，但尚未发现合适的方法来恢复正常泪水的减少量。目前，为了治疗干眼，已使用人造泪液用于补充眼泪并使用硫酸软骨素、谷胱甘肽、透明质酸、纤连蛋白、EGF等以减轻主观症状，但效果仍不理想。从新近的研究看，据信正常眼表上皮表达粘蛋白样糖蛋白，这种糖蛋白积极参与维持泪膜。另外，已知从结膜生发细胞分泌的粘蛋白负责稳定泪膜。因此，由任何因素造成的眼表上皮缺损都可能诱发异常的眼粘蛋白分泌以及由此形成的不稳定泪膜。这种不稳定泪膜可能降低上皮和泪膜的相互作用水平，从而角膜和结膜损伤可能变得更加严重(NorihikoYokoiinGANKACHIRYONOKOTSUTOOTOSHIANA(眼科领域的治疗技术)FUMIOKOGURE编辑，KABUSHIKIKAISHANAKAYAMASHOTEN出版，东京，日本，26-27页(1995))。从上述观点可知，如果通过增加粘蛋白分泌或其他任何方式来稳定泪膜，就能治疗如角膜和结膜损伤或干眼等疾病。白蛋白是广泛存在于动植物组织或体液，如人血清、泪液中的一种蛋白。例如人血清白蛋白用于治疗血白蛋白减少、出血性休克等。在眼科领域，已知用白蛋白作为蛋白制品如纤连蛋白或干扰素的稳定剂。已建议用上述制品如纤连蛋白和干扰素来治疗角膜损伤(日本特开昭61-103838和平6-271478)，但人们尚未认识到白蛋白本身可有效治疗角膜和结膜损伤或干眼。发明的公开内容本发明提供了一种含白蛋白为有效成分的眼科药物组合物。本发明的组合物对于治疗角膜和结膜损伤是有用的。同时本组合物对治疗干眼有用。本发明组合物所用的白蛋白来源不作特别限制。但当白蛋白具有抗原性时，出现如过敏等问题，就不优选。优选使用人类来源的白蛋白例如人血清白蛋白。在本发明中优选使用人血清白蛋白而无任何特殊问题，此蛋白纯化到通常医药用所需的适宜纯度。即，优选那些含不低于80％白蛋白(在电泳分析中)的蛋白制品。为灭活病毒等，优选热处理得到的白蛋白。特别是，优选使用商业上作为药物销售的人血清白蛋白。在本发明中也优选由基因重组获得的微生物所生产的白蛋白。对于本领域技术人员，根据基因重组技术的生产方法是众所周知的。简单地说，可将含编码所需白蛋白(如人白蛋白)基因的载体导入宿主细胞使之转化。挑选和培养能产生所需蛋白的转化细胞，然后可以从培养上清液或细胞提取物中分离和纯化人白蛋白。宿主细胞的实例包括酵母、大肠杆菌等，这些细胞常常为本领域技术人员用来生产蛋白。为避免其中含病毒等，更加优选作为上述基因重组产物的白蛋白。在此处，术语“角膜和结膜损伤”包括病理因素如干性角膜结膜炎(干眼)、各种角膜结膜炎、过敏和微生物(例如病毒、细菌、真菌等)感染，化学因素如化学药品引起的细胞毒性和酸碱造成的腐蚀，物理因素如眼干燥，外界物质(例如隐形眼镜等)及热水等，眼组合物(例如氯化苯甲烃铵、氯丁醇等)以及眼药(例如氨基糖苷类抗菌素、非甾类消炎药、IDU、匹马菌素等)所含的抗菌剂所引起的角膜和结膜损伤；角膜外层缺损；角膜磨损；角膜溃疡等。在此处，术语“干眼”不仅包括简单干眼(泪水减少)，其定义为“泪水质量降低或变化的一种疾病，而不论角膜和结膜损伤是否存在”，而且包括无泪、眼干燥、斯耶格伦综合症、干性角膜结膜炎、斯-约二氏综合症及眼疱疮、睑炎等多种干眼病。此外，术语“干眼”包括白内障手术后及伴随过敏性结膜炎的干眼，以及VDT(视觉显示终端)工作者的泪水减少和由例如空调引起房间干燥所致的无任何系统症状的泪水减少等于干眼样疾病。在此处，术语“治疗”指控制这些疾病的任何方法，包括这些疾病的预防、治疗和缓解，以及这些疾病发展的停滞或缓解。发明人进一步发现白蛋白增加眼表上皮粘蛋白的分泌。由此本发明进一步提供了一种药物组合物，用于增加眼表粘蛋白分泌，该组合物包含白蛋白为有效成分。此外发明人发现白蛋白具有扩散油的表面活性剂活性。这提示白蛋白的这种表面活性剂活性有助于眼表泪膜的稳定。本发明的药物组合物可以如下剂型存在如片剂、药丸、药粉、悬浮液、胶囊、栓剂、注射制品、药膏、眼药水等。特别优选局部施用眼药水。倘若本发明的组合物配制成眼药水，此组合物可包含含量大约1-1000mg/ml的白蛋白，更加优选大约10-1000mg/ml，进一步优选大约50-1000mg/ml。此外这种组合物包含一种药物可接受的稀释剂。在此处，“药物可接受的稀释剂”可以是本领域技术人员所知的用于眼组合物的任何稀释剂，例如水、生理盐水、人造泪液等。此外本发明的药物组合物可包括用于常规眼组合物的各种成分，如稳定剂、灭菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH调节剂、表面活性剂等。稳定剂的实例包括正常L型氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸等；葡萄糖和甘露糖等单糖；蔗糖和麦芽糖等双糖；甘露醇和木糖醇等糖醇，葡聚糖等多糖。灭菌剂的实例包括苄烷铵盐、洗必太盐及对羟基苯甲酸酯等。缓冲剂的实例包括硼酸、磷酸、乙酸和柠檬酸或其盐类。等渗剂的实例包括氯化钠、氯化钾和糖类等。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸钠和柠檬酸等。由于它是一种眼组合物，pH值优选从5至8。本组合物可按剂量大约1-100μl/眼施用，优选大约10-50μl/眼，更加优选大约30-50μl/眼。另一方面，本发明也提供了白蛋白用于生产本发明药物组合物的用途。另一方面，本发明也提供了一种角膜和结膜损伤的治疗方法，包括对需要这种治疗的患者施用有效量的白蛋白。在此处，术语“需要治疗角膜和结膜损伤的患者”包括真正有角膜和结膜损伤的病人和怀疑有以上损伤的病人。它不仅包括已实际确认有角膜和结膜损伤的病人而且包括怀疑有角膜和结膜损伤的病人以及很有可能发生这种疾病的病人，例如角膜移植术后的病人。另一方面，本发明提供了一种干眼治疗方法，包括对需要这种治疗的患者施用有效量的白蛋白。在此处，术语“需要干眼治疗的患者”包括患干眼病的病人和怀疑患干眼病的病人。在本发明的这些方法中，白蛋白和上述组合物所用的白蛋白可以是相同的。在本发明的这些方法中，白蛋白可作为本发明的药物组合物来施用。施药途径不限于但最优选眼局部施药。在本发明的这些方法中，白蛋白的“有效量”为良好的治疗所需的量，可依据病人症状、年龄、性别、体重、饮食、同时使用的其它药物以及医药领域技术人员了解的各种因素来选择最适量。除上述因素外，这种有效量也可以根据白蛋白的种类或活性而变动。有效量的确定是一种通常由医药领域技术人员完成的工作。在本发明的这些方法中，药物组合物可按大约1-100μl/眼的剂量施用，优选大约10-50μl/眼，更加优选约30-50μl/眼，每天约1-20次，更加优选每天大约5-10次，这并不意味着限制本发明的范围。在本发明的这些方法中，已用于治疗角膜和结膜损伤或干眼的人造泪液可与白蛋白同时施用。在此情况下，人造泪液可按通常用量和服法来施用。在本发明的另一方面，本发明提供了一种增加眼表上皮粘蛋白分泌的方法，包括对需要这种施药的患者施用有效量的白蛋白。根据本方法，可增加眼表上皮粘蛋白分泌，由此可稳定眼表面泪膜。在此处，“需要施药的患者”包括眼表粘蛋白分泌异常的患者以及因眼表上皮缺失而怀疑有眼表粘蛋白分泌异常的病人，例如干眼或角膜和结膜损伤的病人。在本发明的这种方法中，白蛋白可以以本发明的药物组合物进行施用。施药途径不受限制，但最优选的是对眼局部施药。在本发明的这种方法中，白蛋白的“有效量”是增加眼表粘蛋白分泌的量，可根据病人的症状、年龄、性别、体重、饮食、同时使用的其它药物以及医药领域技术人员了解的各种因素而选择最适量。除上述因素外，这种有效量也可以随白蛋白种类或活性而变动。这种有效量的确定是一种通常由医药领域技术人员完成的工作。在本发明的这种方法中，这种药物组合物可按约为1-100μl/眼的剂量施用，优选约为10-50μl/眼，更加优选约为30-50μl/眼，每天大约1-20次，更加优选每天约5-10次，这并不意味着限制本发明的范围。在本发明的这种方法中，已用于治疗角膜和结膜损伤或干眼的人造泪液可与白蛋白同时施用。在此情况下，人造泪液可按通常用量和服法来施用。制剂实施例在本申请的实施例中，使用由绿十字公司(日本大阪)生产的捐赠血液白蛋白制品。这些白蛋白制品的获得方法是使用根据Cohn′s冰冷乙醇分级分离法将作为原材料的供血者血浆进行分离/纯化而得到的白蛋白级分，依据下述制剂实施例1和2制备，并于60℃热处理10个小时。制剂实施例1(白蛋白含量25％)人血清白蛋白250mg/ml乙酰色氨酸钠5.37mg/ml辛酸钠3.32mg/ml制剂实施例2(白蛋白含量5％)人血清白蛋白50mg/gml乙酰色氨酸钠1.07mg/ml辛酸钠0.66mg/ml测试实施例1对具有角膜和结膜损伤的三位干眼病人(女64岁、女61岁和女34岁)的眼睛施用制剂实施例1的25％人血清白蛋白(白蛋白含量250mg/ml)，每天10次，剂量为30-50μl/眼。在施用白蛋白同时，施用人造泪液。在施药前后进行活体染色检查来估计角膜和结膜损伤的程度。象活体染色检查一样，进行玫瑰二碘曙红染色和荧光染色。玫瑰二碘曙红染色(RB)提供了角膜和结膜损伤的指标，通过估计球结膜和角膜的鼻侧和耳侧染色程度，按0-3(总分为9)来记分。荧光染色(F)提供了角膜损伤的指标。通过估计角膜损伤程度按0-3记分。在以上两种情况中，根据VanBijsterreld′s估测方法记分。在以上两种情况中，数值越高损伤越严重。结果示于表1。表1白蛋白施用的效果*除干眼外，该患者还患有上缘角膜结膜炎测试实施例2角膜移植术后具有角膜外层缺损的62岁男性右眼深入角膜移植术后，仍有角膜外层缺损，施用0.1％Hyaleinmini(商标)(含0.1％透明质酸)。然而未观察到任何效果，因此终止施用0.1％Hyaleinmini。此后对眼睛施用制剂实施例1的25％人血清白蛋白(白蛋白含量250mg/ml)一周，每天10次，剂量30-50μl/眼。施药开始后一周，形成角膜外层并且角膜外层的缺损好转了。测试实施例3角膜移植术后有角膜外层缺损的64岁女性左眼深入角膜移植术、边缘移植和羊膜移植后，荧光染色检测到角膜外层缺损。对这位病人的眼睛施用制剂实施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)4周，每天10次，剂量30-50μl/眼。施药开始后两周，荧光染色表明角膜外层缺损好转。施药开始后四周，未观察到染色，并且看到角膜外层缺损有明显的改观。测试实施例4患斯耶格伦综合症的72岁女性对患有角膜外层缺损并伴有斯耶格伦综合症的病人眼睛施用Intal(商标)(含色甘酸钠)、0.1％Flumetholon(商标)(含氟甲脱氧泼尼松龙)和人造泪液。然而未观察到角膜外层缺损的好转，终止施药。然后对病人眼睛施用制剂实施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)4周，每天6次，剂量30-50μl/眼。施药开始后四周，未观察到角膜外层缺损。测试实施例5患斯耶格伦综合症的45岁女性对患有角膜和结膜损伤并伴有斯耶格伦综合症的病人眼睛施用制剂实施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)4周，每天10次，剂量30-50μl/眼。在施药前后，进行活体染色检查(玫瑰二碘曙红染色和荧光染色)来估计角膜和结膜损伤程度。活体染色检查的过程如下将2μl含1％玫瑰二碘曙红和1％荧光素的混合液，用微吸管准确地滴入病人的下眼睑，让病人眨眼几次，然后观察眼睛。用狭缝灯的白光测定玫瑰二碘曙红染色(RB)，用钴蓝灯测定荧光染色(F)。染色程度从0至9记分。结果示于表2。表2白蛋白施用效果</tables>测试实施例6对三位干眼病人(女64岁、女61岁和女34岁)的眼睛施用制剂实施例1的25％人血清白蛋白(白蛋白含量250mg/ml)，每天10次，剂量30-50μl/眼。在施用白蛋白同时，对眼睛施用人造泪液。在施药前后，估计病人的主观症状并记分。主观症状包括眼痛、眼干感觉和眼异体感觉。病人自已估计这些症状。最严重的主观症状记分为100分，最好或正常为0。结果示于表3。表3施用白蛋白后主观症状的改善除干眼外患者还患有上缘角膜结膜炎测试实施例7对伴有斯耶格伦综合症的干眼病人(74岁女性)的眼睛施用制剂实施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)8周，每天6次，剂量30-50μl/眼。8周后，主观症状包括眼痛、眼干感觉和眼异体感觉几乎完全消除。终止施用白蛋白。测试实施例8研究白蛋白增加眼上皮粘蛋白分泌的能力根据常规细胞培养条件，用途10％(w/v)人血清白蛋白(SIGMA)的TCM199培养基(GIBCO)培养CCL细胞(结膜上皮细胞株)24小时。对照组中，细胞用不含人血清白蛋白的TCM199培养基培养。从培养容器中用胰酶-EDTA收集培养细胞，用多聚甲醛固定30分钟，并用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次。用正常羊血清封闭得到的细胞(4℃，30分钟)，封闭细胞与小鼠抗粘蛋白抗体(Mucl)反应(4℃，30分钟)，然后用PBS冲洗3次。细胞再与FITC标记的抗小鼠IgG抗体反应(4℃，30分钟)，然后用PBS冲洗3次。通过流式细胞方法采用Epics(ColterCo.)对获得的细胞进行检测，以确定产生粘蛋白的细胞(阳性细胞)占总细胞的比例。结果示于表4。表4白蛋白增加粘蛋白分泌</tables>根据结果，在培养基中加入白蛋白明显提高结膜上皮粘蛋白分泌的能力。测试实施例9白蛋白扩散油的能力在人造泪液中加入10％(体积)的蓖麻油。油与溶液分离并形成油滴。在此系统中，加入10％(人造泪液的体积比，v/v)的5％白蛋白溶液，油扩散至水相表面并且油滴消失。此实施例提示白蛋白可作为表面活性剂，防止泪液由眼表面蒸发。工业实用性本发明的药物组合物、方法和用途对于治疗角膜和结膜损伤及干眼是有用的。本发明的药物组合物、方法和用途对增加眼表上皮粘蛋白分泌同样有用。权利要求1.一种治疗角膜和结膜损伤的药物组合物，该组合物包含白蛋白为有效成分。2.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。3.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的组合物适于作为眼药水使用。4.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的组合物含10-1000mg/ml白蛋白。5.一种治疗干眼的药物组合物，该组合物包含白蛋白为有效成分。6.根据权利要求5的药物组合物，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。7.根据权利要求5的药物组合物，其中所说的组合物适于作为眼药水使用。8.根据权利要求5的药物组合物，其中所说的组合物含10-1000mg/ml白蛋白。9.一种增加眼表上皮粘蛋白分泌的药物组合物，该组合物包含白蛋白为有效成分。10.根据权利要求9的药物组合物，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。11.根据权利要求9的药物组合物，其中所说的组合物适于作为眼药水使用。12.根据权利要求9的药物组合物，其中所说的组合物含10-1000mg/ml白蛋白。13.一种治疗角膜和结膜损伤的方法，该方法包括对需要这种治疗的患者施用有效量的白蛋白。14.根据权利要求13的方法，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。15.根据权利要求13的方法，其中所说的白蛋白以眼药水形式施用。16.根据权利要求13的方法，该方法包括施用一种含1-1000mg/ml白蛋白和药物可接受的载体的药物组合物。17.一种治疗干眼的方法，该方法包括对需要这种治疗的患者施用有效量的白蛋白。18.根据权利要求17的方法，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。19.根据权利要求17的方法，其中所说的白蛋白以眼药水形式施用。20.根据权利要求17的方法，该方法包括施用一种含1-1000mg/ml白蛋白和药物可接受的载体的药物组合物。21.一种增加眼表上皮粘蛋白分泌的方法，该方法包括对需要这种施药的患者施用有效量的白蛋白。22.根据权利要求21的方法，其中所说的白蛋白是人类来源的白蛋白。23.根据权利要求21的方法，其中所说的白蛋白以眼药水形式施用。24.根据权利要求21的方法，包括施用一种含1-1000mg/ml白蛋白和药物可接受的载体的药物组合物。25.白蛋白在生产治疗角膜和结膜损伤的药物组合物中的用途。26.根据权利要求25的用途，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。27.根据权利要求25的用途，其中所说的药物组合物适于作为眼药水使用。28.根据权利要求25的用途，其中所说的药物组合物含10-1000mg/ml白蛋白。29.白蛋白在生产治疗干眼的药物组合物中的用途。30.根据权利要求29的用途，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。31.根据权利要求29的用途，其中所说的药物组合物适于作为眼药水使用。32.根据权利要求29的用途，其中所说的药物组合物含10-1000mg/ml白蛋白。33.白蛋白在生产增加眼表上皮粘蛋白分泌的药物组合物中的用途。34.根据权利要求33的用途，其中所说的白蛋白是人类来源白蛋白。35.根据权利要求33的用途，其中所说的药物组合物适于作为眼药水使用。36.根据权利要求33的用途，其中所说的药物组合物含10-1000mg/ml白蛋白。全文摘要本发明提供了一种治疗角膜和结膜损伤及干眼的药物组合物,该组合物含白蛋白为有效成分。这种药物组合物对增加眼表上皮粘蛋白分泌同样有用。本发明进一步提供了角膜和结膜损伤及干眼的一种治疗方法,包括对需要这种治疗的患者施用有效量的白蛋白。此外,本发明提供了白蛋白在生产本发明的药物组合物中的用途。文档编号A61K38/00GK1195296SQ97190706公开日1998年10月7日申请日期1997年4月17日优先权日1996年4月19日发明者坪田一男申请人:株式会社·R-技术上野,坪田一男