专利名称：：一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法
技术领域：
：本发明属人工关节载抗生素骨水泥药物释放，具体涉及一种促进载抗生素骨水泥内药物的释放的方法。
背景技术：
：感染是人工关节置换术后最常见且最严重的并发症之一。尽管近年随着无菌技术、围手术期抗生素及外科医师无菌观念的不断发展，其发生率已降至1%-5%，但由于手术例数不断增加，感染例数仍迅速上升。美国每年50万例人工关节置换中，感染的例数高达5000-10000，平均每例治疗费用高达60000美元，病人需经历6-18个月的身心折磨。我国虽尚无大宗病例的统计数据，但由于庞大的人口基数和人口结构老龄化，对于人工关节置换术后感染的报道及治疗费用逐年剧增，并且后果堪忧，往往致残。传统的感染治疗方案包括人工假体取出、局部清创及长期大剂量静滴抗生素，但由于感染灶局部抗生素浓度低、异物导致局部免疫逃逸、菌株毒力高、细菌耐药、菌膜形成阻滞抗生素渗透，所以感染极易迁延或复发。此外引起感染的细菌谱不断变化，耐药菌株不断增加，致使临床敏感抗生素减少，感染越来越难治。众多患者需反复取出假体和清创，直至行关节融合甚至截肢，不仅延长住院时间、增加并发症和毒副反应风险，而且大大提高病残率和病死率，给病人、家庭乃至社会带来极大的痛苦和负担。使用载抗生素骨水泥防治人工关节置换术后感染在临床应用日益广泛。将骨水泥与抗生素混合，使抗生素自骨水泥表面和内部大量长期释放，有效地发挥抗生素的局部抗菌作用。运用于骨水泥的抗生素必须满足一定的特性(1)较高的热稳定性，耐受骨水泥聚合时的高温，(2)较强的水溶性，可溶解于体液中从而得到释放，(3)较高的化学稳定性，不会因接触血液、脓液及纤维素等而失去活性，(4)较低的过敏性和毒副作用，(5)对内植物相关感染的致病菌谱广泛敏感，天然耐药菌株较少，(6)较低的蛋白结合率，(7)合适的分子量和颗粒大小，易于从骨水泥中释放。各类抗生素中以氨基糖甙类和糖肽类效果最佳，应用最为成熟。与静滴抗生素相比，载抗生素骨水泥在降低血药浓度的同时，可显著提高感染灶局部的抗生素浓度。大量临床短、中期随访及基础研究显示，其在抗菌性能及毒副反应方面较传统的静滴抗生素具备显著的优势。目前FDA已批准部分商业化载抗生素骨水泥产品用于治疗人工关节置换术后感染，而用于预防人工关节置换术后感染的载抗生素骨水泥的商业化产品已在欧洲临床正式应用。但是近来药物基础研究显示，载抗生素骨水泥后期药物释放缓慢且有限，大部分包埋于骨水泥深部的抗生素永难释放。超长期的亚治疗浓度的局部抗生素易致细菌基因突变耐药和选择耐药，且对菌膜无效，此外其粗糙的表面可进一步作为细菌黏附分泌形成菌膜的载体，上述机制导致感染迁延甚至难治。临床长期随访数据显示，使用载抗生素骨水泥治疗人工关节置换术后感染，复发率仍可达4%-15.1%，60%-89%病原菌对原抗生素耐药。因此如何增强载抗生素骨水泥的局部药物释放，并采用一定的理化手段阻止病原菌耐药甚至形成菌膜已成为人工关节置换术后感染防治的研究关键。迫切需要开发一种新颖有效的防治人工关节置换术后感染的方法和装置。无疑它的研制成功将具有良好的应用前景和巨大的经济效益。
发明内容本发明的目的是提供一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，通过以下步骤实现取注射负荷一定抗生素浓度的丙烯酸骨水泥，置于含磷酸缓冲液(模拟体液条件)的容量瓶内，在容量瓶内注射微泡剂，将超声探头安置于容量瓶底部，启动超声发生装置，低频超声波作用于骨水泥周围体液或溶液，超声波频率应为20-100KHz，空间平均时间平均强度为20mW/cm2-3W/cm2，模式包括连续式和脉冲式，占空比应为20%-100%，调制脉冲频率应为lHz-lOKHz。本发明的丙烯酸骨水泥中负荷的抗生素包括氨基糖甙类、糖肽类抗生素、抗真菌类抗生素，氨基糖甙类抗生素包括庆大霉素、妥布霉素，糖肽类抗生素包括万古霉素、替考拉宁，抗真菌类抗生素包括两性霉素、酮康唑、克林霉素、达托霉素或利奈恶胺，抗生素负荷比例为1%-10%。本发明中采用的骨水泥为商业产品，包括Depuy的CMW系列、Biomet的Palacos系列和Septopal、Zimmer的Simplex系列等。其主要成分均为聚甲基丙烯酸骨水泥，由粉剂和液剂以2:1调配而成。以Depuy的CMWEndurance为例，粉剂由83%甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物和17%的聚甲基丙烯酸甲酯组成，液剂由94%甲基丙烯酸甲酯单体、3。/。的N-N二甲基对甲苯胺和3。/。的阻聚剂对苯二酚组成。本发明中负荷抗生素骨水泥的制备方法为将骨水泥粉剂与抗生素颗粒研磨精细并充分搅拌，将甲基丙烯酸液剂倒入粉剂混合物中，真空离心条件下充分搅拌至面团期时，采用高压骨水泥枪将骨水泥注射入动物长骨或聚四氟乙烯磨具内制备试件。本发明中采用的微泡剂为商业产品，包括Optison、Sonovue及国产全氟烷微泡。以Sonovue为例，由25mg白色粉末和59mg六氟化硫气体组成，使用时粉末内加入5ml生理盐水，振摇20s后形成微泡混悬液，浓度为lml微泡混悬液含六氟化硫8ul，pH为4.5-7.5，等渗。微泡平均直径为2.5um，90%微泡的直径低于6um，99。/。微泡的直径低于llum，动物使用剂量为0.04-0.08ml/kg。本发明的有益效果是1、本发明将低频超声波与载抗生素骨水泥联用，能大大提高载抗生素骨水泥药物释放的速度和总量，使细菌周围能迅速建立有效抑菌浓度并维持一定时间，充分发挥载抗生素骨水泥的抗菌效能；不仅能有效预防菌膜形成，而且能有效清除菌膜及其深部包埋的耐药菌。2、本发明中采用微泡剂，从而增加局部空化核浓度，能极大程度地提高局部超声波的空化强度，使超声波能更有效地发挥促载抗生素骨水泥药物释放作用及超声波与抗生素间协同抗菌作用。3、本发明中采用的载抗生素骨水泥及微泡剂均为成熟的商业产品，安全无毒，生物相容性较高。4、本发明通过释放超声能量，可以增强载抗生素骨水泥局部抗菌的效能，縮短痊愈时间，加速康复，降低感染迁延及复发的风险。5.本发明提供的一种促进载抗生素骨水泥内药物释放的方法，能提高载抗生素骨水泥药物释放的速度和总量，使细菌周围能迅速建立有效抑菌浓度并维持一定时间，充分发挥载抗生素骨水泥的抗菌效能。能有效预防菌膜形成，而且能有效清除菌膜及其深部包埋的耐药菌。大大增强细菌对抗生素的敏感性，恢复部分耐药菌对抗生素的敏感性，有效预防细菌的黏附并分泌菌膜，从而提高载抗生素骨水泥的抗菌效应，使载抗生素骨水泥技术应用更为广泛。图1为本发明实施例选用的低频超声发生装置工作原理图。图2为与单纯超声相比，微泡增强型超声的空化效应将产生更强的微声流和微射流，使更多药物自骨水泥内释放(A)，同时使细胞膜出现更多声穿孔，极大地促进万古霉素穿透细胞膜(B)，实现抗生素与低频超声间的协同抗菌作用。图3为体外条件下六组载抗生素骨水泥试件在浸泡8-24h内的药物释放量比较(11=8)，低频超声(频率25kHz,声强100mW/cn^或300mW/cm"能使药物释放提高13.03%-73.62%。图4为对照组、超声组和微泡超声组33611内药物释放时间曲线(11=3)，结果显示微泡增强型超声能在低频超声的基础上进一步提高载抗生素骨水泥的药物释放。图5为翻修术后30d患髋磁共振影像显示，相比对照组股骨近段水肿(A,C箭头所指低信号)，超声组股骨内为正常脂肪像(B、D箭头所指高信号)，且炎症范围大幅縮小(E,F内箭头所指范围)。A、B为患髋矢状面T1影像，C，D为患髋横断面T1影像，E，F为患髋横断面T2影像。图6为翻修术后30d对照组和实验组局部炎症的组织学比较。对照组(A,C，E)小血管(V)扩张，组织间隙充血水肿，伴大量炎症细胞浸润，纤维及肌肉排列紊乱。实验组(B，D，E)组织内无显著充血和水肿，炎性细胞较少，组织排列规则(HEX40)。(A)对照组疤痕，(B)实验组疤痕，(C)对照组肌肉，(D)实验组肌肉，(E)对照组骨髓，(F)实验组骨髓。图7为对照组、超声组和微泡超声组336h药物释放总量比较和24h后PBS细菌残留密度比较(n-3)，结果显示微泡增强型超声能在低频超声的基础上进一步提高载抗生素骨水泥的抗菌性能。图8为治疗24h后超声组细菌残留计数(A:稀释1000倍菌落计数为477,即活菌数为4.77X10S)和微泡超声组细菌残留计数(B:未稀释下菌落计数为197，无稀释)，结果显示微泡增强型超声能在低频超声的基础上进一步提高载抗生素骨水泥的抗菌性能。图9为三组试件的药释动力学曲线、拟合方程和浸泡14天后SEM(100x/200x)的表面形貌。图10为三组试件浸泡14天后SEM(1000x/2000x)的表面形貌。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1:本发明实施例选用低频超声波治疗仪为重庆精鹏电子有限公司，型号为DC20A超声波发射器，它有一壳体，壳体的前侧面有LCD显示屏，显示屏上有触摸屏输入、前侧上部有指示灯下部有键盘，其壳体的后背有电源连接端、探头连接器及对比度旋钮。LCD显示屏与处理器相连，可显示工作参数，状态，及实时时钟。触摸屏接触摸屏控制器后由处理器控制，实时时钟使用处理器集成的功能部件，超声信号发生器由处理器集成的D/A功能部件输出的模拟电压信号控制压控振荡器实现，超声信号的调制波频率占空比由处理器集成的PWM功能部件实现。超声信号发生器的输出连接到功率放大电路放大，最后输出到换能器上，换能器固定到患处合适位置，使得超声能作用到骨关节内部。具体参见图l，图2。本装置超声波频率范围调整为20-100KHz，空间平均时间平均强度是20mW/cm2-3W/cm2，调制频率为1Hz-10KHz，模式包括连续式和脉冲式，占空比为0%-100%。实施例2:体外条件下低频超声促进载抗生素骨水泥的药物释放。骨水泥粉剂40g分别和万古霉素2g或4g放入密闭容器，磁力搅拌24h(150转/分)使之均匀混合，加入固化液18.88g，充分搅拌成面团状后，注入预制模具(顶面正方形宽0.5cm，底面正方形宽1.5cm，高1.8cm)中铸型，室温下固化后取出即为万古霉素质量分数为5%、10%的六面体载抗生素骨水泥，重量分别为(2.16土0.03)g、(1.96土0.02)g，万古霉素含量分别为(83.08士1.27)mg、(160.42土4.20)mg。常压、室温和通风环境下放置24h，一次性环氧乙烷(400mg/L)常压下消毒2h。试件分别随机分成三组，每组8件5%对照组、5。/。100mW/cm2超声组、5%300mW/cm2超声组、10%对照组、10%100mW/cm2超声组、10%300mW/cm2超声组。浸泡于40ml磷酸盐缓冲溶液(PBS,含NaC18g、Na2HP042.38g、KH2PO40.19g，pH7.4)中8h后，分别给予不同强度的超声干预(频率25kHz,声强100mW/cm2或300mW/cm2)30min。保持探头与试件顶面的间距为2cm，超声前将探头浸入PBS内。六组试件均于浸泡后480、515、520、530、540、570、630min及24h采样100ul。每次采样前将PBS磁力搅拌(150r/s)1min，采样后补充新鲜PBS100ul。样本离心(3000转/分，5min)后用免疫偏振荧光法(FPIA)测定样本内万古霉素浓度。测定前先用万古霉素质控试剂盒行精确性和准确性测定，再以万古霉素标准曲线试剂盒绘制标准曲线。浸泡后24h的药物浓度与8h的药物浓度的差值乘以40ml即为该16h的药物释放参见图3，结果显示，10%100mW/cm2超声组和10%300mW/cm2超声组在超声干预开始后3550min内药物释放达到峰值，5090min后释放逐渐缓慢，90min后保持缓慢、平稳的释放。其余四组在超声干预后16h内药物释放始终保持缓慢、平稳，无明显波动。16h内10%100mW/cm2超声组和10%300mW/cm2超声组的药物释放分别较10%对照组增加了71.77%、73.62%，差异存在统计学意义；5%100mW/cm2超声组和5%300mW/cm2超声组的药物释放分别较5%对照组增加了13.03%、23.78%，差异无统计学意义。上述结果表明，体外条件下，低频超声能有效促进载抗生素骨水泥的药物释放，提高局部药物浓度和有效抑菌浓度维持时间，该项技术可进一步用于体内研究。实施例3:体外条件下微泡增强型低频超声促进载抗生素骨水泥的药物释放。采用例2的制备方法制备载抗生素骨水泥碟形试件(直径10mm，厚度5mm)。试件浸泡于37°C的10ml无菌PBS中。试件分3组对照组、超声组(频率46kHz,开关时间比40min:10min,声强300mW/cm2)、微泡超声组(Sonovue，质量分数0.025%,局部添加)。保持探头与试件顶面的间距为2cm，超声前将探头浸入PBS内。每24h更换PBS，补充初始浓度的微泡剂和导声胶。浸泡14d内，每日采样100ul并离心(3000r/s,5min)，免疫偏振荧光法测定万古霉素浓度，计算每24h的药物释放量。参见图4，结果显示，与低频超声组比较，微泡增强超声组的万古霉素总释放量增加了141.4%,有效抑菌浓度维持时间(7;MK;)超过336h。上述结果表明，体外条件下，微泡增强型低频超声能在普通低频超声的基础上，进一步促进载抗生素骨水泥的药物释放，进一步提高局部药物浓度和有效抑菌浓度维持时间。实施例4:动物体内条件下低频超声促进载抗生素骨水泥的药物释放。采用例2的制备方法分别制备载抗生素骨水泥的髋臼试件(直径6mm，高10mm的圆柱体)和股骨试件(直径3mm，高20mm的圆柱体)，万古霉素质量分数均为7.5%。髋臼试件和股骨试件的重量分别为(300.6士6.9)mg、(200.9±2.3)mg，万古霉素含量分别为(14.3士0.3)mg、(9.6士0.1)mg。成年健康雌性新西兰大白兔16只，体重(1.86±0.46)kg。体积分数为2.5%的硫贲妥钠3-4.5ml肌内注射。以左侧股骨外测转子为中心做长约4cm的弧形切口，沿股骨后缘切开股二头肌和内收长肌进入髋关节，咬除股骨头保留股骨距2mm。将股骨骨水泥试件插入股骨髓腔至末端与截骨面平齐，将髋臼骨水泥试件放入髋臼内并固定。术后动物分笼饲养，肢体随意活动。16只动物随机分为两组，每组8只。超声组给予超声干预术后O、5、11、23、47、71、95和119h分别给予1次，每次30min。超声前于探头表面及兔左侧髋关节皮肤均匀涂抹耦合胶约10ml，探头与皮肤紧贴。两组均于术后0.5、1、1.5、2、3、6、12、24、48、72、96和120h采集关节腔引流液并记录容积，于术后2、3、6、12、24、48、72、96和120h采集新鲜尿液并记录容积。术后4周处死动物，取出骨水泥试件，清除黏附的软组织，在密闭清洁容器内手工磨挫至粉末，以0.9mm方孔的标准筛滤过，倒入200mlPBS中于37。C下洗脱24h，取表面洗脱液100W，离心(3000转/分，5min)后，免疫偏振荧光法测定标本内万古霉素浓度。结果显示，(l)引流液药物浓度方面，对照组于术后3h达到峰值(27.52土12.97)Mg/ml，超声组于术后lh达到峰值(71.15土34.11)Mg/ml，超声组峰值高于对照组(t-3.360，PO.01)。两组药物浓度在达到峰值后均急骤下降，术后24h起下降速度渐缓，术后3d基本稳定。对照组有效抑菌浓度的维持时间为(54.28±26.22)h、超声组为(52.81±13.93)h，两组差异无统计学意义。两组分别于术后5d、4d开始出现部分标本的药物浓度低于FPIA测量低限(O.lPg/ml)，术后6d两组均无法获得引流液标本。超声组药物浓度在术后0.5、1、1.5和2h均明显高于对照组(t:4.764,4.284，5.487,2.848，P<0.05)，其余时间点两组浓度差异无统计学意义。(2)尿液药物浓度方面，对照组于术后24h达到峰值(2.59±2.34)Mg/ml，超声组于术后6h达到峰值(2.16士0.94)Pg/ml，两者间差异无统计学意义。两组药物浓度在达到峰值后均缓慢下降，分别于术后3d、2d开始出现部分标本的浓度低于FPIA测量低限。超声组药物浓度在术后2、6和12h均高于对照组^3.020,3.136,2.594,P<0.05)，其余时间点两组间差异无统计学意义。术后ld和5d两组药物释放总量如表l所示，超声组的药物释放集中于术后ld内，术后2-5d几乎无药物释放。(3)残余药量方面，对照组溶出药物(17539.15±2288.45)Mg，达原万古霉素载荷量的72.63%;超声组溶出药物(13160.70±2446.45)Mg，达原万古霉素载荷量的55.07%。对照组溶出药物量与超声组比较差异有统计学意义(1=3.697，PO.Ol)。表1.术后1d和5d对照组和超声组的万古霉素的释放量(；±s,n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述结果表明，体内条件下，低频超声能有效促进载抗生素骨水泥的药物释放，提高局部药物浓度、有效抑菌浓度维持时间和载抗生素骨水泥的药物利用率，该项技术可进一步用于临床研究。实施例5:动物体内条件下低频超声与载抗生素骨水泥的协同抗菌作用。采用例4的制备方法制备载抗生素骨水泥。金黄色葡萄球菌ATCC13565，36.5°C下培养1824h，等渗盐水配成菌液，比浊管稀释至1X109CFU/mL，4。C冰箱保存。成年健康雌性新西兰大白兔16只，术前ld称重，测肛温，取静脉血检测C-反应蛋白、血沉、血尿素氮和血肌酐。动物髋关节腔内注射0.1mL菌液，距外侧粗隆顶点以远4cm的股骨后侧骨面凿一直径4mm的骨缺损，插入一枚3.5mmX20.0mm不锈钢钉，注射O.lmL菌液，骨腊封闭骨缺损。围手术期不予抗生素。术后30d行清创术。术前记录肛温，取静脉血，测定C-反应蛋白和血沉。左侧股骨外侧粗隆为中心切开各层组织，取股骨头圆韧带及不锈钢钉，行菌株鉴定。彻底清创，股骨髓腔内及髋臼内分别置入载抗生素骨水泥。围手术期不予抗生素。动物随机分成2组(11=8):对照组和超声组(超声频率25kHz，输出声强300mW/cm2，术后0h、5h、11h、23h、47h、71h、95h禾P119h给予治疗，每次30min)。术后30d测定体重，根据Lazarettos标准对动物感染的临床表现进行评分。患髋在矢状面及横断面行核磁共振检查。术后30d处死动物。髋臼周围取肌肉1±央(约0.5g)、疤痕1块(约0.5g)和关节液200W，股骨取近端1/3皮质和骨髓(约0.3g)，每份均分为2等份。1份放入营养肉汤内24h扩增细菌，除骨皮质使用碾磨机磨成粉末外，其余用组织匀浆器行均质处理，再接种于琼脂培养基，36.5。C下培养48h后观察，如出现疑似菌落生长，即接种至血平板，甘露醇发酵实验和血浆凝固酶实验鉴定菌株。另1份用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察局部炎症表现。根据Riegels-Nielsen标准对动物的感染及炎症程度进行评分。超声组于术后6h、12h、24h、2d、3d、4d、5d采集颈动脉血1mL，离心(3000转/分，5min)后，FPIA测定血药浓度。处死前采静脉血3mL，检测血尿素氮和血肌酐。参见图5、图6，结果显示，全部动物均存活，清创术前动物的肛温(38.7土0.4。C)、C-反应蛋白(0.61士0.08mg/L)及血沉(1.44士0.56mm/h)恢复正常。术中取材细菌培养显示16例髋臼和股骨髓腔均存在感染，经鉴定感染菌株与接种细菌为同一批，无杂菌污染。(l)Lazarettos感染评分方面，超声组(1.3士1.0)低于对照组(3.0士0.8)(t二3.862,P〈0.01)，(2)E-MRI方面，超声组患髋炎症信号范围较对照组显著减小。术后30d对照组(1.60士0.40kg)与超声组体重(1.89士0.26kg)间的差异无统计学意义(t4.748，P>0.05)。(3)组织学方面，对照组6例动物的5份组织细菌培养为阳性，8例动物的组织镜下存在炎症表现；超声组8例动物的5份组织细菌培养为阴性，2例动物的组织镜下存在炎症表现。Riegels-Nielsen感染评分超声组(1.8±1.3)低于对照组(6.4±2.4)(t=4.737,PO.01)。(4)血药浓度和肾功能方面，超声组术后5天内血药浓度低于0.1mg/L。超声组清创术后30d的血尿素氮值(211.3士35.1mg/L)及血肌酐值(14.2士1.0mg/L)与建模前相比(222.0士128.3mg/L，13.0±4.0mg/L)，差异无统计学意义(t=0.157，0.574，P>0.05)。上述结果表明，体内条件下，低频超声与载抗生素骨水泥间存在协同抗菌效应，从而提高了载抗生素骨水泥局部的抗菌效率，同时该技术对动物机体无明显毒副作用，是一种安全且高效的抗菌治疗技术，可进一步用于临床研究。实施例6:体外条件下微泡增强型低频超声与载抗生素骨水泥的协同抗菌作用。TSB培养基内配制标准金葡菌液，浓度为1X10"CFU/ml，菌液分为3组，对照组，超声组和微泡超声组，其中微泡超声组中，于无菌培养板内加入10ml菌液、0.25mlSonovue微泡剂和6Mg万古霉素，予以超声治疗(超声频率46kHz,开关时间比40min:10min，声强300mW/cm2)，24h后采集TSB100W，连续梯度稀释法计数活菌，重复5遍。参见图8、图9，结果显示，超声组24h后TSB内细菌密度下降了1034CFU/ml，微泡超声组24h后TSB内细菌密度下降了1078CFU/ml，感染清除率超过99.999%。上述结果表明，体外条件下与普通低频超声比较，微泡增强型低频超声与载抗生素骨水泥间的协同抗菌效应更强，从而进一步提高了载抗生素骨水泥局部的抗菌效率，该技术可进一步用于体内研究。实施例7制备质量分数(抗生素与骨水泥粉剂的质量比值)为10%的VLBC圆柱体试件直径19mm，高度6mm，表面积924.73mm2，重量(2.247士0.135)g，含万古霉素(0.143土0.008)g，骨水泥表面积与溶液体积比(Surfaceareaovervolume,A/V)0.23cnT1。常压、室温和通风环境下放置24h，筛选合格试件，环氧乙烷灭菌。超声治疗仪输出频率为46.5kHz，空间平均时间平均输出功率密度为1200mW/cm2，占空比为50%，调制脉冲频率为250kHz，辐照模式分间断辐照(开机40min+关机10min的周期循环)或连续辐照。辐照前校准输出功率和超声频率。搭建体外超声辐照下VLBC的药释模型，烧杯四周及底面放置吸声橡胶，换能器浸入PBS内，调节升降器和刻度梁使试件在换能器的菲涅耳区域内，保持与换能器的间距为lcm。烧杯内为40ml的PBS，烧杯口密封防止PBS蒸发，换能器输出电缆通过夹具垂直固定于横梁、并与超声仪相连，烧杯置入37。C水浴中。将VLBC试件随机分为三组(n二7):空白对照组、1200mW/cn^连续辐照组、1200mW/cm丌司断辐照组，后两组于浸泡后0~336h予以超声辐照。取部分试件(11=4)行药释动力学实验。三组试件于浸泡后24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336、672h取出试件，PBS150rps磁力搅拌lmin，采样lOOpl，样本3OOOrps离心5min，免疫偏振荧光法测定PBS内万古霉素的浓度(AbbottLaboratoriesUSA，TDxFLx快速血药浓度测定仪，测定范围0-100^ig/ml，最低有效浓度0.5pg/ml)。试件取出后蒸馏水冲洗、干燥，置于新鲜40tnlPBS中继续超声辐照。万古霉素对葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为2pg/ml，梯形法计算r>MIC。万古霉素释放量(吗)=万古霉素浓度(Hg/ml)x40(ml)。三组取剩余VLBC试件(n-3)行材料表面形貌观察。浸泡336h后，试件脱水干燥，真空镀膜仪喷金，扫描电镜(FEI，USA，SIRION100)低、高倍放大率下观察试件表面的微结构特征。对照组、超声连续辐照组、超声间断辐照组的VLBC试件的即时药释曲线和累积药释曲线见图。三组药释均遵循丙烯酸骨水泥药释的经典双模式:24h内呈爆发性药释，此后药释缓慢持久。三组曲线均于24h达峰，分别始于59.5h、47.8h、228.8h药物浓度低于MIC，分别于96h、120h、>336h药物浓度低于0.5pg/ml。三组间r>MIC、24h释放药量、336h累积释放药量和释放率、336~672h释放药量的统计学比较见表l:(i)超声间断辐照组7;MK:较对照组及超声连续辐照组分别提高137.27h(P<0.05)、149.79h(P<0.05)，超声连续辐照组r顺c较对照组下降11.71h(P<0.05);(ii)超声间断辐照组24h释放药量较对照组及超声连续辐照组分别提高1.29mg(P<0.01)、1.16mg(P<0.01)，超声连续辐照组与对照组间差异无统计学意义(=0.66);(iii)超声间断辐照组336h累积释放药量较对照组及超声连续辐照组分别提高2.68mg(P<0.01)、2.61mg(P<0.01)，超声连续辐照组与对照组间差异无统计学意义(P^.87);(iv)超声间断辐照组336~672h亚抑菌浓度释放量较对照组及超声连续辐照组分别下降0.15mg(P<0.01)、0.18mg(P<0.01)，超声连续辐照组与对照组间差异无统计学意义(P-0.25)三组VLBC累积药释拟合曲线及参数见图9、图10。三组采用指数增长至最大值模型拟合效果均理想(拟合优度0.9970.998)，拟合优度均有统计学意义(F-l928.39-18032.31，P<0.01)。表2三<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>§:根据每组4个样本的r>MIC求得均值和标准差*:超声组与对照组两两比较差异有统计学意义秩和检验的chi-square值参见图9、图10，低倍放大率下，对照组可见骨水泥表面粘附的万古霉素颗粒(白色箭头)，偶见细小缝隙(黑色箭头)，长度约为5~10nm，无明显圆孔和交联孔隙；超声连续辐照组除细小缝隙外，骨水泥表面及孔隙内仍可见粘附的万古霉素颗粒(白色箭头)，少量圆孔(黑色箭头)散在分布，直径约为1080,;超声间断辐照组除细小缝隙外，可见大量圆孔密集分布，直径约为8030(Him，其深度不一(黑色箭头)，伴有交联孔隙，骨水泥表面及孔隙内未见万古霉素颗粒残留，孔隙密度较对照组和超声连续辐照组显著提高。高倍放大率下，对照组可见骨水泥表面粘附万古霉素颗粒(白色箭头)；超声连续辐照下，万古霉素颗粒可脱离骨水泥表面，但孔隙内仍可见万古霉素颗粒粘附(白色箭头)；超声间断辐照下，万古霉素颗粒脱离骨水泥表面，同时孔隙内未见万古霉素颗粒粘附。无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域的技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而并非以任何方式限制本发明的应用范围。所以本发明的主要范围将由附属的权利要求及其等同体来确定。权利要求1.一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，其特征是通过以下步骤实现取注射负荷抗生素的丙烯酸骨水泥，置于含磷酸缓冲液或体液的容量瓶内，在容量瓶内注射微泡剂，将超声探头安置于容量瓶底部，启动超声发生装置，低频超声波作用于骨水泥周围体液或溶液，超声波频率应为20-100KHz，空间平均时间平均强度为20mW/cm2-3W/cm2，模式包括连续式和脉冲式，占空比应为20％-100％，调制脉冲频率应为1Hz-10KHz。2.根据权利要求l所述的一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，其特征是:所述丙烯酸骨水泥中负荷的抗生素包括氨基糖甙类、糖肽类抗生素、抗真菌类抗生素，抗生素负荷比例为1%-10%。3.根据权利要求1所述的一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，其特征是所述负荷抗生素骨水泥的制备方法为将市售骨水泥粉剂与抗生素颗粒研磨精细并充分搅拌，将甲基丙烯酸液剂倒入粉剂混合物中，粉剂和液剂调配比例为2:1，真空离心条件下充分搅拌至面团期时，采用高压骨水泥枪将骨水泥注射入聚四氟乙烯磨具内制备而成。4.根据权利要求1所述的一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，其特征是所述微泡剂为商业产品，包括Optison、Sonovue及国产全氟垸微泡。5.根据权利要求2所述的一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，其特征是氨基糖甙类抗生素包括庆大霉素、妥布霉素，糖肽类抗生素包括万古霉素、替考拉宁，抗真菌类抗生素包括两性霉素、酮康唑、克林霉素、达托霉素或利奈恶胺。全文摘要本发明提供一种促进载抗生素骨水泥局部药物释放的方法，将负荷抗生素的丙烯酸骨水泥置于含磷酸缓冲液的容量瓶内，注入微泡剂，将超声探头安置于容量瓶底部，启动超声发生装置，超声波频率应为20-100KHz，空间平均时间平均强度为20mW/cm<sup>2</sup>-3W/cm<sup>2</sup>，模式包括连续式和脉冲式，占空比应为20％-100％，调制脉冲频率应为1Hz-10KHz。本发明能提高载抗生素骨水泥药物释放的速度和总量，并维持一定时间，能有效预防菌膜形成，增强细菌对抗生素的敏感性，有效预防细菌的黏附并分泌菌膜，从而提高载抗生素骨水泥的抗菌效应，使载抗生素骨水泥应用范围更为广泛。文档编号A61L27/54GK101288781SQ200810060270公开日2008年10月22日申请日期2008年4月10日优先权日2008年4月10日发明者严世贵,蔡迅梓申请人:浙江大学