专利名称：：Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及应用重组DNA技术制备的基因工程蛋白药物，具体说是从毕赤酵母中表达Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。这种融合蛋白可以作为治疗糖尿病药物的主要成分。
背景技术：
：Exendin-4是胰高血糖素样肽-l(GLP-1)类似物[1]。其合成类似物Exenatide，己经由Lilly公司开发，2005年通过FDA审批上市，商品名为Byetta，本品用于治疗P细胞机能尚好，暂不需要注射胰岛素，通过口服糖尿病治疗药已无法充分控制血糖水平的糖尿患者[2]。由于Exendin-4半衰期短，而且糖尿病患者用药几乎是终生的，因此需要多次长期给药(一天两次)。人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin,HSA)是血液中的一个非常重要的天然蛋白，在人血液循环中可以存在20天以上。研究表明将单个Exendin-4与人血清白蛋白基因融合表达的融合蛋白可降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期[3]。但是，将多个Exendin-4与人血清白蛋白基因融合表达的融合蛋白，是否能进一步延长其体内的作用时间国内外未见报道。Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白是利用基因工程技术制备而成的长效制剂。与Exendin-4相比，在体内的作用时间明显延长，可以减少给药次数，减轻病人治疗时的痛苦。
发明内容本发明的目的就是根据糖尿病患者终身用药的特点，进一步地延长Exendin-4在体内的作用时间，提供一种长效的Exendin-4融合蛋白，其结构可以表示成下列结构中的任何一种1)E-L1-E-L2-HSA;2)E-L1-E-L2-E-L3-HSA;3)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-HSA;4)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-HSA;5)E-Ll-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-E-L6-HSA;其中，E表示Exendin-4，HSA表示人血清白蛋白，Ll-6表示肽接头；添加的肽接头是为了防止潜在的结构域相互作用而影响融合蛋白的生物学功能和稳定性。本发明中肽接头选自具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]m的多肽，其中m为0,1,2，3，4，5或6;优选为l-2个重复序列。我们最优选的融合蛋白序列见SEQIDNo:l。为了达到上述目的，我们根据已经公开的Exendin-4氨基酸序列(www.expasv.org.Swiss-proentryP26349),采用酵母偏爱的密码子人工合成了含肽接头的exendin-4串联多肽基因。同时在5'端和3'端分别引入Xhol和BamHI的酶切位点。为得到编码融合蛋白的完整基因，将exendin-4串联多肽基因的pBlueScriptSK质粒，经Xhol和BamHI双酶切，经电泳后，切胶回收得到exendin-4串联多肽基因片段，再克隆到含有人血清白蛋白基因的pMD18-T载体中，然后按Invitrogen公司Pichiaexpressionkit的说明将融合基因插入到pPIC9质粒中，转化酵母菌GS115,经过筛选并表达得到高产菌种，经甲醇诱导表达融合蛋白，具体实施方案可以参考实施例1。收集的表达产物经亲和柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，得到了高纯度的Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。通过糖耐量实验证明Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白比单个Exendin-4与人血清白蛋白的融合蛋白的作用时间明显延长。本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的融合蛋白的方法。本发明的另一个目的是得到的纯化Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明的另外一个目的是得到Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白在制备减肥制品中的应用。本发明具有的特点是-1)采用酵母偏爱的密码子，人工合成了Exendin-4串联多肽的基因片断。2)采用的表达系统是毕赤酵母表达系统，其特点是该表达系统含有特有的强有力的AOX(甲醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基肉整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；外源基因表达产物可以直接分泌到发酵液中，有利于分离纯化；发酵工艺成熟，易放大。本发明中基因工程制备的Excndin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，经测定其对给药后正常小鼠糖耐量的影响和作用时间，结果表明它具有与单个Exendin-4多肽与人血清白蛋白的融合蛋白相近的作用效果，但其作用时间较单个Exendin-4多肽与人血清白蛋白的融合蛋白至少长1.5倍。比文献报道的Exendin-4的作用时间明显延长w。因融合蛋白具有产量大、易于提取、纯化方便、中间流程少、体内停留的半衰期长等特点，可以开发为新的糖尿病治疗药物。图1是本发明的亲和层析图谱实线为洗脱曲线，虚线为电导检测。图2是本发明的SOURCEPHE疏水层析图谱实线为洗脱曲线，虚线为屯导检测。图3是本发明的S印hadex凝胶层析图谱实线为洗脱曲线，虚线为电导检测。图4是融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析图谱1:分子量marker;2:融合蛋白。图5是融合蛋白的HPLC分析图谱图6是给药2小时后正常小鼠的糖耐量反应图7是给药16小时后正常小鼠的糖耐量反应图8是给药24小时后正常小鼠的糖耐量反应图9是给药38小时后正常小鼠的糖耐量反应图10是给药64小时后正常小鼠的糖耐量反应图11是给药72小时后正常小鼠的糖耐量反应具体实施例方式以下提供了实施例，以便进一步描述本发明。本发明的范围不是仅仅由以下实施例组成。本领域技术人员将理解，此处描述的特定试剂、设备和程序仅仅是说明性的，并没有以任何方式限制本发明。实施例l:融合蛋白表达质粒的构建E-LI-E-L2基因委托上海生物工程技术服务公司合成并克隆亍pBluescriptSK质粒，其中E为Exendin-4,LI为[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2，L2为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。序列如下GAGGAGGAGGCCGTCCGTCTTTTCATCGAGTGGCTGAAAAATGGAGGACCTTCCTCCGGAGCCCCT'TTTATTGAATGGTTGAAGAACGGTGGTCCATCTTCTGGTGCTCCACCACCATCTGGTGGTGGTGGATCC3'在其5'端和3'端分别存在XhoI酶切位点和BamHI酶切位点。为了将E-Ll-E-L2与HSA以融合蛋白的形式在毕赤酵母中分泌表达，将含E-LI-E-L2的pBluescriptSK质粒用XhoI和BamHI酶切，回收280bp左右的重组片段；将含有人血清白蛋白基因的重组质茅立pMD18-T-HSA用XhoI和BamHI酶切，回收2kb的大片段。用T4DNA连接酶连接两个片段，16'C过夜，转化进入DH5ot感受态细胞。用含氨苄青霉素的LB琼脂板，37'C培养过夜，筛选转化菌。挑取单克隆菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液中，37'C培养过夜，抽提含融合蛋白基因的pMD18-T重组质粒进行酶切鉴定。含融合蛋白基因的pMD18-T重组质粒用XhoI和EcoRI酶切，回收目的片段E-Ll-E-L2-HSA。将质粒pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，回收大片段。用T4DNA连接酶连接两个片段，16'C过夜，转化DH5a感受态细胞。转化菌铺于含氨苄青霉素的LB培养板上，37'C培养过夜。挑取单克隆菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37'C培养过夜，抽提含融合蛋白基因的pPIC9表达质粒进行酶切鉴定。重组的表达质粒委托TaKaRa公司测序。经测序分析证明，融合蛋白的基因序列是正确的(见SEQID2)。表达质粒通过电转化毕赤酵母GS115,筛选重组表达融合蛋白的工程菌。实施例2:融合蛋白的表达参考Pichiae邓ressionkit，将表达融合蛋白工程菌的阳性单克隆接种至100mlBMGY培养液，30。C/230rpm摇床培养过夜使OD6。o达到4-8。采用3000rpm/2分钟离心收集菌体，菌体重悬于50mlBMMY培养液中，置30'C/230rpm摇床培养。每24h加入甲醇至终浓度为0.7%,连续诱导3天，5000rpm/10分钟离心，收获上清液保存于-30'C。实施例3:融合蛋白的纯化按实施例2中获得的毕赤酵母发酵液，使用双蒸水进行稀释，使其电导与亲和平衡缓冲液相当，并调节pH为6.0-7.0，将稀释后的发酵液用0.45pm微孔滤膜过滤，再使用截留分子量为10000的超滤系统浓縮至小体积；然后在8ml/分钟流速下，用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为流动相，通过BlueSepharose6FastFlow柱(GEhealth)吸附融合蛋白，最后用20mM磷酸钠和2M氯化钠(pH7.0)缓冲液进行洗脱，再收集洗脱峰，检测波长设定为215nm，其中目标峰1为含有融合蛋白的表达产物(图l)。收集目标峰l样品，加入20mM磷酸钠和2M硫酸铵(pH7.0)，调节电导以及pH与疏水平衡缓冲液相当。用PhenylSepharoseHighPerformance柱(GEhealth)，在20mM磷酸钠和1.6M硫酸铵(pH7.0)缓冲液中吸附融合蛋白，采用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱蛋白，流速为5ml/分钟，检测波长设定为215nm，其中目标峰2为进一步纯化的融合蛋白(图2)。采用HiTrapDesalting柱(GEhealth)对上述含融合蛋白的组分进行脱盐处理，检测波长设定为215nm，其中目标峰3为脱盐后的融合蛋白(图3)。并用截流分子量为5000的超滤系统浓縮。实施例4:融合蛋白的鉴定实施例4aSDS-PAGE我们采用SDS-PAGE对融合蛋白进行鉴定，胶浓度为8%,实验结果表明，融合蛋白的分子量与我们预期一致，同时其SDS-PAGE纯度已经〉95。/。(见图4)，为进一步开发成奠定了基础。实施例4bHPLC纯度分析我们采用HPLC凝胶色谱检测其纯度，条件如下色谱柱:WatersProteinPak125A，7.8X300mm，分子量范围2000-80000lOOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH6.5)220nm0.5ml/ml流动相:UV检测波长:流速实验结果表明，融合蛋白的纯度己经>95%(图5)。实施例5:融合蛋白的活性检测实施例5a融合蛋白对正常小鼠的糖耐量实验正常ICR小鼠(购自浙江大学动物实验中心)，体重为18-22g，禁食不禁水12小时，然后皮下分别给予蒸馏水和纯化的融合蛋白，给药后2小时、16小时、24小时、38小时、64小时、72小时后小鼠的糖耐量反应。小鼠的糖耐量反应实验如下灌服葡萄糖溶液2g/kg(10mg/ml)，使用血糖仪(艾康生物技术有限公司)测定灌服葡萄糖后10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟时血液中的葡萄糖浓度，然后绘制耐糖曲线图。给药后2小时、16小时、24小时、38小时、64小时和72小时后小鼠糖耐量反应的实验结果分别见图6、图7、图8、图9、图10和图11(其中Nl表示单个Exendin-4和人血清白蛋白的融合蛋白，由我们自己实验室表达制备，给予剂量为0.18mg/20g小鼠；N2表示两个Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，给予剂量为0.2mg/20g小鼠)。我们从图6-11中可以观察到灌服葡萄糖后，血糖浓度的峰值时间在10-20分钟，90分钟后基本上恢复到初始水平。从图6中，我们可以观察到N1在2小时时，已有降血糖作用，但是与对照组比较，没有统计学意义(p>0.05);从图7中可以看出，在16小时时出现了明显的降血糖作用(p〈0.05)，然后在24小时后，已经没有明显的控制血糖作用(p>0.05)，因此其作用时间约为24小时。从图6-ll中，我们可以观察到N2起效较快，在2小时时，与对照组比较，已经出现明显的控制血糖作用。然后，在16小时、24小时、38小时、64小时时仍然有明显的控制血糖峰浓度的作用，但是在72小时时，已经没有控制血糖峰浓度的作用；因此，N2的作用时间持续64小时以上，其反应时间延长了至少1.5倍。因此，我们可以看出，Exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白体内作用时间明显延长。实施例6:融合蛋白在制备减肥制品中的应用从文献中w,我们可以看到Exendin-4能够明显降低食欲，从而控制动物的体重。我们在实施例5a的小鼠实验中，也观察到Exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白有明显的食欲抑制作用。控制体重需要长时间达到目的，因此，我们制备的Exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白，适合于用来制备减肥制品。本发明涉及的部分参考文献1.JEng,WAKleinman,LSinghetal.Isolationandcharacterizationofexendin-4,anexendin-3analogue,fromHelodermasuspectumvenom.Furtherevidenceforanexendinreceptorondispersedacinifromguineapigpancreas.丄Biol.Chem.1992,267(11):7402-7405.2.JohnB.Buse,RobertR.Henry,JennyHanetal.Effectsofexenatide(exendin-4)onglycemiccontrolover30weeksinsulfonylurea-treatedpatientswithtype2diabetes.DiabetesCare2004,27:2628-2635.3.YanshanHuang,ZhiChen,YiqiongChenetal.Preparationandcharacterizationofanovalexendin-4humanserumalbuminfusionproteinexpressedinP/ch/apasto〃—s.丄peptidescience.2007Nov12.PMID17994612.[Epubaheadofprint]4.AAYoung,已RGedulin,SBhavsaretal.Glucose-loweringandinsulin-sensitizingactionsofexendin-4:studiesinobesediabetic(ob/ob，db/db)mice,diabeticfattyZuckerrats,anddiabeticrhesusmonkeys(/Wacacamu/a斷Diabetes.1999,48:1026-1034.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>GinArg290LysAla305PheAlaGluCysLeuAlaLysGlu370GluVal385AspPheAspValAspTyrThrLeu450LysVal465lieLysGinAsnThrProLysCys530TyrLeu545ProValArgArgLysGluLeuSer610LeuVal625MetAsp275LeuTrpGluCysLys355CysGluValPheSer435GluPheGinAlaThr515CysSerSerProPhe595GluLysAspLysAlaValHis340TyrCysAsnGluLeu420ValLysAspAsnLeu500LeuLysValAspCys580AsnLysHisPheCysValSer325GlylieGluAspSer柳GlyValCysGluCys485LeuValHisValArg565PheAlaGluLysAlaAlaAla310LysAspCysLysGlu390LysMetLeuCysPhe470GluValGluProLeu550ValSerGluArgPro630AlaSer295ArgLeuLeuGluPro375MetAspPheLeuAla455LysLeuArgValGlu535AsnThrAlaThrGin615LysPhe280LeuLeuValLeuAsn360LeuProValLeuLeu440AlaProPheTyrSer520AlaGinLysLeuPhe600lieAlaValGinSerThrGlu345GinLeuAlaCysTyr425ArgAlaLeuGluThr505ArgLysLeuCysGlu585ThrLysThrGluLysGinAsp330CysAspGluAspLys410GluLeuAspValGin490LysAsnArgCysCys570ValPheLysLysLysPheArg315LeuAlaSerLys二eu395AsnTyrAlaProGlu475LeuLysLeuMetVal555ThrAspHisGinGlu635CysGly300PheThrAsplieSer380ProTyrAlaLysHis460GluGlyValGlyPro540CeuGluGluAlaThr620GinCys285GluProLysAspSer365HisSerAlaArgThr445GluProGluProLys525CysHisSerThrAsp605AlaLeuLysArgAlaPheLysValArg350SerCysLeuGluArg430TyrCysGinTyrGin510ValAlaGluLeuTyr590lieLeuLysAlaAlaGlu320HisThr335AlaAspLysLeulieAlaAlaAla400AlaLys415HisProGluThrTyrAlaAsnLeu480LysPhe495ValSerGlySerGluAspLysThr560ValAsn575ValProCysThrValGluAlaVal640AspAsp9<image>imageseeoriginaldocumentpage10</image>权利要求1.一种Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于其结构可以表示成下列结构中的任何一种1)E-L1-E-L2-HSA；2)E-L1-E-L2-E-L3-HSA；3)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-HSA；4)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-HSA；5)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-E-L6-HSA；其中，E表示Exendin-4，L1-6表示肽接头，HSA表示人血清白蛋白。2.权利要求l的融合蛋白，其特征在于其结构可以表示成下列结构E-LI-E-L2-HSA。3.权利要求l-2的融合蛋白，其特征为肽接头选自富含甘氨酸的多肽。4.权利要求l-2的融合蛋白，其特征为肽接头选自具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]m的多肽，其中m为0，1，2，3，4，5或6。5.权利要求1-2的融合蛋白，其特征为融合蛋白可以表示成E-LI-E-L2-HSA，Ll为[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2，L2为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，氨基酸序列[SEQIDl]如下所示；<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>ValValLeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCysGluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeuValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThrProThrLeuValGluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValValLeuAsnGinLeuCysValLeuHisGlulysThrProValSerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGluArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGinL_euLysAlaValMetAspAspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGlyLeu06.—种制备权利要求l-5任意一项融合蛋白的方法，其特征在于包含以下步骤(1)将编码权利要求l-5任意一项融合蛋白的基因序列通过表达载体，导入酵母菌或大肠杆菌中表达；(2)随后将含有权利要求l-5任意一项融合蛋白的发酵液通过亲和柱层析、疏水层析、和凝胶柱层析顺序组合纯化，制备得到融合蛋白。7.权利要求6所述的制备融合蛋白方法，其特征在于所述酵母菌为毕赤酵母:。8.权利要求6，7所述的制备融合蛋白方法，其特征在于所述毕赤酵母为GS115。9.权利要求6-8所述的制备融合蛋白方法，其特征在于所述编码基因转入酵母中时，所述表达载体为pPIC9。10.权利要求6-9所述的制备融合蛋白方法，其特征在于所述亲和层析柱填料为BlueS印harose。11.权利要求6-9所述的制备融合蛋白方法，其特征在于所述疏水层析柱填料为PhenylS印harose。12.权利要求1-5的任意一项融合蛋白在制备用于糖尿病治疗药物中的用途。13.—种适用于治疗糖尿病的药物制剂，其特征是包含权利要求1-5的任意一项融合蛋白。14.权利要求13的药物制剂，其特征在于该药物制剂为注射剂。15.权利要求13的药物制剂，其特征在于该药物制剂通过鼻腔或肺部给药。16.权利要求1-5的任意一项融合蛋白在制备减肥制品中的用途。全文摘要本发明涉及Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法和用途。我们通过基因工程的方法表达了exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白在体内显示出长效的控制血糖活性，克服了exendin-4多肽在体内半衰期较短的问题，并且制备方便。该融合蛋白可以用于制备糖尿病治疗药物和减肥制品。文档编号A61K9/08GK101525386SQ200810060038公开日2009年9月9日申请日期2008年3月5日优先权日2008年3月5日发明者孔建龙,徐小蓉,徐海达,朱小娟,王安行,盛灵通,健秦,管其君,詹金彪,乐陆,黄建松申请人:浙江华阳药业有限公司