专利名称：络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因载体及制备方法
技术领域：
本发明涉及一类新型的非病毒基因药物载体，具体是涉及一类络合铂类抗肿瘤药物的非 病毒基因药物载体。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，攻克肿瘤一直是世界瞩目的研究热点。1995 年世界卫生组织对世界上近100种抗肿瘤药物进行了评价，顺铂抗肿瘤药物的疗效、市场等 综合评价位居第2位。据统计，在我国抗肿瘤化疗治疗方案中，以顺铂为主或有顺铂参加配 伍的抗肿瘤药物方案占所有化疗方案的70%-80%。由此可见，铂类抗肿瘤药物的疗效已经 为大家所公认，目前，已经有了三代的临床用药，其中第一代顺铂；第二代卡铀；第三 代奥沙利铂、奈达铂。还有很多正在研制阶段的铂类抗肿瘤新药，如环铂、乐铂、硫铂等。
基因药物治疗是近二十年来兴起的新型治疗方法，其基本策略是将外源基因通过各类载 体导入目的细胞并得到有效表达，从而达到治疗疾病的目的。在基因药物释放体系中，载体 的研究始终是研究的热点。目前普遍应用的病毒载体介导系统，虽然其有很高的基因转染效 率，但高的细胞毒性、较低的靶向性、DNA携带能力的限制性、生产包装及高价格等问题 限制了病毒载体的应用范围，尤其是1999年，美国基因治疗临床实验因使用腺病毒载体导 致"Jesse Gelsinger"死亡事件，使研究者在病毒类载体的临床使用上更为谨慎。相反，非 病毒性转基因载体具有免疫反应低，安全性能高，易于人工合成等特点，在基因药物的研究 中日益受到重视。随着人类基因组框架图的解析成功，更多的基因药物从实验室研究所阶段 进入临床实用阶段。
非病毒型基因载体存在着毒性、生物相容性、降解性等问题，目前有一种合成的材料聚 乙烯亚胺，实验发现分子量22000—25000的聚乙烯亚胺转染效率非常高，但是存在毒性和 降解性的问题，小分子量(600， 1200， 2000)的聚乙烯亚胺毒性小，易于在生物体内代谢， 但是几乎没有转染效率。
用聚乙二醇修饰聚乙烯亚胺(聚乙烯亚胺的PEG化)具有延长药物在体内的循环时间， 降低药物免疫原性、毒性，增加其水溶性及稳定性等优良特性。Kim课题组报导了 (Sagam，K; Kim, SW. A new synthesis of galactose-poly(ethylene glycol)-polyethylenimine for gene delivery to hepatocytes. Journal of Controlled Release, Volume 79, Issues 1-3, 19 February 2002, Pages 271-281 )用聚乙二醇修饰聚 乙烯亚胺提高了聚乙烯亚胺的转染效率，降低了聚乙烯亚胺的毒性。Petersen H等报导了(Petersen, H; Fechner， PM; Martin, AL, et al. Polyethylenimine-graft-poly(ethylene glycol) copolymers: influence of copolymer clock structure on DNA complexation and biological activities as gene delivery system. Bioconjugate Chem， Volumel3, 2002, Pages845-854)用聚乙二醇修饰聚乙烯亚胺可以提高其作为非 病毒基因药物载体的基因表达效率。
发明内容
本发明目的是提供一类新型的络合铂类抗肿瘤药物，并用聚乙二醇修饰聚乙烯亚胺的非 病毒基因药物载体。
本发明提供的络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因药物载体:是Pt-PEI-PEG或PEG-PEI-Pt 复合物，以聚乙烯亚胺(PEI)为骨架，连接聚乙二醇(PEG),络合铂(Pt)类抗肿瘤药物 构成；所述复合物的铂类化合物PEI物质的量摩尔比为1 5 : 1; PEG摩尔用量为PEI物 质的量的1 5%;组分所占摩尔百分比分别为Pt: 48.8 83.2 %， PEI: 16.5 49.8 %， PEG:
0. 17、2.44%。
本发明提供的络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因药物载体的制备方法是聚乙烯亚胺
(PEI)先与铂类化合物进行配位反应生成Pt-PEI配合物，再与聚乙二醇(PEG)发生反应， 生成Pt-PEI-PEG复合物；或PEI先与聚乙二醇PEG发生反应，生成PEG-PEI复合物，再与 铀类化合物配位反应，生成PEG-PEI-Pt复合物。
制备步骤如下
1、 Pt-PEI-PEG复合物的合成方法一
1) Pt-PEI配合物的合成将PEI和铂类化合物分别用10 50倍(摩尔/体积)量的无水乙 醇溶解，按铂类化合物PEI物质的量摩尔比为1 5 : 1;在搅拌的条件下，将铂类化合 物的乙醇溶液缓慢滴入PEI乙醇溶液中，继续搅拌反应1 4小时，得到Pt-PEI配合物的 悬浊液；过滤，乙醇挥发干后，制得Pt-PEI配合物；
2) Pt-PEI配合物的PEG化将Pt-PEI配合物用50 200倍(摩尔/体积)量的二氯甲垸溶 解；PEG用50 200倍(摩尔/体积)量的二氯甲烷溶解；PEG摩尔用量为PEI物质的量 的1 5%;在搅拌的条件下，将PEG的二氯甲烷溶液缓慢加入Pt-PEI的二氯甲垸溶液中， 继续搅拌反应l 4h，静置，二氯甲烷挥发干后，得到Pt-PEI-PEG复合物。
2、 PEG-PEI-Pt复合物的合成方法二
1) PEG-PEI复合物的合成将PEI用10 50倍(摩尔/体积)量的二氯甲烷溶解；PEG用 50 200倍(摩尔/体积)量二氯甲烷溶解；PEG摩尔用量为PEI物质的量的1 5%;在 搅拌的条件下，将PEG的二氯甲烷溶液缓慢滴入PEI的二氯甲烷溶液中，继续搅拌反应1 4h，得到PEG-PEI复合物溶液。 2) PEG-PEI复合物与钼类化合物配位反应将钼类化合物用10 50倍(摩尔/体积)量乙 醇溶解，按铂类化合物PEI物质的量摩尔比为1 5 : 1，在搅拌的条件下，将铂类化合 物缓慢滴入上述PEG-PEI复合物溶液中，继续搅拌反应1 4小时，静置，二氯甲烷和 乙醇挥发干后得到PEG-PEI-Pt复合物。
本发明所述的聚乙烯亚胺为432Da (直链型)、600Da、 1200Da、 2000Da、 25kDa等分 子量的聚乙烯亚胺中任一种。
本发明所述的铂类化合物为四氯化铂、二氯化铂、三氯化铂、顺铂、卡铂、奥沙利铂、 奈达铂等铂类化合物中任一种。
本发明所述聚乙二醇为2000Da、 3400Da、 5000Da、 10000Da、 12000Da、 20000Da等分 子量的聚乙二醇中任一种。
本发明中铂类化合物pei物质的量摩尔比为1 5 : l，表示铂类化合物的摩尔用量是
PEI物质的量的同等倍数到5倍之间的任一倍数。
本发明中PEG用量为PEI物质的量的1 5%，表示PEG的摩尔用量是PEI物质的量的 1%到5%之间的任一百分比。
本发明的技术效果
本发明得到的Pt-PEI-PEG复合物中有很多类似铂类抗肿瘤药物的结构。因为PEI的结 构呈树枝状，其结构的主体为…N-C-C-N-C-C…这样的重复结构，有丰富的氨基和亚氨基存 在，因而便于与Pt的配位反应且生成配合物的局部结构与铂类抗肿瘤药物非常相似，因此 能有铂类抗肿瘤药物的抗肿瘤作用。
本发明采用的聚乙烯亚胺PEI，具有3种不同的氨基形式，形成了不同的缓冲体系，氨 基的存在基本作用是结合DNA，扩展的功能是在携带DNA进入细胞时不同的氨基组合成不 同的缓冲对，能保护DNA免遭细胞质中的溶酶体降解。
本发明采用聚乙二醇修饰聚乙烯亚胺的技术得到的Pt-PEI-PEG复合物有较好的水溶性 和稳定性，该复合物还很具有药物进行聚乙二醇修饰后一般具有的其他优良特性，如延长药 物在体内的循环时间，降低药物免疫原性、毒性等等。
由于铂类化合物被有机大分子载体包被，从而使铂类药物的控制释放成为可能。又由于 铂类化合物与PEI配位以后，PEI上还有很多闲置的氨基和亚氨基，即使进行聚乙二醇修饰 后，PEI上还是有很多氨基或亚氨基剩余，这些基团的存在，使Pt-PEI-PEG复合物与基因药 物的复合成为可能，因而有望成为同时运载小分子抗肿瘤药物与基因药物的多功能载体，若再接上叶酸或其他配体，则可进一歩成为具有革巴向肿瘤作用的多功能复合物。
本发明的优点①连接了铂类药物，有铂类抗肿瘤药物的功效；②进行了聚乙二醇修饰， 有聚乙二醇修饰产物的优良特性，如稳定性高、水溶性好、体内循环周期长以及毒性降低等 等；(D由于铂类药物被大分子有机物所包被，使铂类药物可以缓慢释放，达到药物控释的目 的；④还可进一步与基因药物复合，成为同时运载小分子药物与基因药物的多功能载体。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明进行详细的描述，但不限于实施例所公开的内容。 实施例l: PtCl4-PEI600-PEG3400复合物的合成(600、 3400等数字表示相应原料的分子量， 下同)。
1) PtCl4-PEI600配合物的合成
将0.2mmolPtCl4和0.2mmolPEI600分别用5mL无水乙醇溶解，在搅拌的条件下，将PtCl4 乙醇溶液缓慢滴入PEI600乙醇溶液中，继续搅拌反应lh，得到PtCl4-PEI600配合物的悬浊 液。过滤，固体自然挥干后收集备用。
2) PtCl4-PEI600配合物的PEG化
将上述制得的PtCl4-PEI600配合物固体全部溶解在30mL 二氯甲烷中，可略微加热，增 大其溶解度。再在搅拌的条件下，将PEG3400 (用量O.Olmmol)的二氯甲烷溶液(二氯甲烷 用量为lmL)缓慢加入其中，继续搅拌反应2h，静置，待二氯甲垸挥干后得到固体产物，即 PtCl4-PEI600-PEG3400复合物。 实施例2: PEG3400-PEI1200-PtCU复合物的合成。
1) PEG3400-PEI1200复合物的合成
将0.2mmolPEI1200用10mL 二氯甲烷溶解，0.002mmolPEG3400用0.4mL 二氯甲烷溶 解，在搅拌的条件下，将PEG3400 二氯甲烷溶液缓慢滴入PEI1200 二氯甲垸溶液中，继续 搅拌反应lh，得到PEG3400-PEI1200复合物溶液。
2) PEG3400-PEI1200-PtCl4复合物的合成
将0.4mmolPtCU用10mL无水乙醇溶解，在搅拌的条件下，将PtCl4乙醇溶液缓慢滴入 上述PEG3400-PEI1200复合物溶液中，继续搅拌反应2h，静置，待二氯甲垸和乙醇挥干后 得到略带粘性的固体产物，即PEG3400-PEI1200-PtCU复合物。 实施例3: PtCl2(NH3)2-PEI1200-PEG5000复合物的合成。 1) PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物的合成
将0.6mmol顺铀PtCl2(NH3)2用20mL无水乙醇溶解，0.2mmolPEI1200用5mL无水乙醇溶解，在搅拌的条件下，将PtCl2(NH3)2乙醇溶液缓慢滴入PEI1200乙醇溶液中，继续搅 拌反应3h，得到PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物的悬浊液。过滤，固体自然挥干后收集备用。 2) PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物的PEG化
将上述制得的PtCl2(NH3)2-PEI1200配合物固体全部溶解在30mL 二氯甲垸中，可略微加 热，增大其溶解度。再在搅拌的条件下，将PEG5000 (用量0.005mmol)的二氯甲垸溶液(二 氯甲烷用量lmL)缓慢加入其中，继续搅拌反应2h，静置，待二氯甲烷挥干后得到固体产 物，即PtCl2(NH3)2-PEI1200-PEG5000复合物。 实施例4: PEG5000-PEI600- PtCl2(NH3)2复合物的合成。
1) PEG5000-PEI600复合物的合成
将0.2mmolPEI600用10mL 二氯甲烷溶解，0.008mmolPEG5000分别用lmL 二氯甲烷溶 解，在搅拌的条件下，将PEG5000 二氯甲垸溶液缓慢滴入PEI600 二氯甲垸溶液中，继续搅 拌反应2h，得到PEG5000-PEI600复合物溶液。
2) PEG5000-PEI600- PtCl2(NH3)2复合物的合成
将1.0mmol顺铂PtCl2(NH3)2用30mL无水乙醇溶解，在搅拌的条件下，将PtCl2(NH3)2 乙醇溶液缓慢滴入上述PEG5000-PEI600复合物溶液中，继续搅拌反应4h，静置，待二氯甲 烷和乙醇挥干后得到略带粘性的固体产物，即PEG5000-PEI600-PtCl2(NH3)2复合物。
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权利要求
1、一种络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因药物载体，是Pt-PEI-PEG或PEG-PEI-Pt复合物，其特征是以聚乙烯亚胺为骨架，连接聚乙二醇，络合铂类抗肿瘤药物构成；所述复合物的铂类化合物∶PEI物质的量摩尔比为1～5∶1；PEG摩尔用量为PEI物质的量的1～5％；各组分所占摩尔百分比分别为Pt48.8～83.2％，PEI16.5～49.8％，PEG0.17～2.44％。
2、 权利要求1所述的络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因药物载体的制备方法，其特征是所 述Pt-PEI-PEG复合物载体的合成歩骤如下* Pt-PEI配合物的合成将PEI和铂类化合物分别用摩尔/体积为10 50倍量的无水乙醇 溶解，按铂类化合物PEI物质的量摩尔比为1 5 : 1的用量；在搅拌的条件下，将铂 类化合物的乙醇溶液缓慢滴入PEI乙醇溶液中，继续搅拌反应1 4小时，得到Pt-PEI 配合物的悬浊液；过滤，乙醇挥发干后，制得Pt-PEI配合物；* Pt-PEI配合物的PEG化将歩骤1制得Pt-PEI配合物和PEG分别用摩尔/体积为50 200 倍量的二氯甲烷溶解；按PEG摩尔用量为歩骤1中PEI物质量的1 5M的用量；在搅拌 的条件下，将PEG的二氯甲垸溶液缓慢加入Pt-PEI的二氯甲垸溶液中，继续搅拌反应l 4小时，静置，二氯甲垸挥发干后，得到Pt-PEI-PEG复合物。
3、 权利要求1所述的络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因药物载体的制备方法，其特征是所 述PEG-PEI-Pt复合物载体的合成歩骤如下* PEG-PEI复合物的合成将PEI用摩尔/体积为10 50倍量的二氯甲烷溶解；PEG用摩 尔/体积为50 200倍量二氯甲垸溶解；PEG摩尔用量为PEI物质的量的1 5%的用量； 在搅拌的条件下，将PEG的二氯甲垸溶液缓慢滴入PEI的二氯甲烷溶液中，继续搅拌反 应1 4小时，得到PEG-PEI复合物溶液。* PEG-PEI复合物与铂类化合物配位反应将铂类化合物用摩尔/体积为10 50倍量乙醇 溶解，按铂类化合物PEI物质的量摩尔比为1 5 : 1，在搅拌的条件下，将铂类化合物 缓慢滴入上述PEG-PEI复合物溶液中，继续搅拌反应1 4小时，静置，二氯甲烷和乙 醇挥发干后得到PEG-PEI-Pt复合物。
4、 根据权利要求2或3所述载体的制备方法，其特征是所述的PEI为直链型432Da、 600Da、 1200Da、 2000Da或25kDa的聚乙烯亚胺中任一种。
5、 根据权利要求2或3所述载体的制备方法，其特征是所述的铂类化合物为四氯化铂、 二氯化铂、三氯化铂、顺铂、卡铂、奥沙利钼或奈达铂的铀类化合物中任一种。
6、根据权利要求2或3所述载体的制备方法，其特征是所述的PEG为2000Da、 3400Da、 5000Da、 10000Da、 12000Da、 20000Da的连接有功能基团的聚乙二醇中任一种。
全文摘要
一种络合铂类抗肿瘤药物的非病毒基因药物载体，是Pt-PEI-PEG或PEG-PEI-Pt复合物载体，以聚乙烯亚胺为骨架，连接聚乙二醇，络合铂类抗肿瘤药物构成；所述复合物的各组分所占摩尔百分比分别为Pt48.8～83.2％，PEI16.5～49.8％，PEG0.17～2.44％。制备方法是由铂类化合物与PEI进行配位，再与PEG发生反应，生成Pt-PEI-PEG复合物载体；或由铂类化合物与PEG-PEI复合物配位反应，生成PEG-PEI-Pt复合物载体。具有抗肿瘤药物的功效，稳定性高、水溶性好、体内循环周期长以及毒性降低优点。
文档编号A61P35/00GK101293102SQ20081006258
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月17日 优先权日2008年6月17日
发明者峻 周, 汤谷平, 胡秀荣, 璐 赵 申请人:浙江大学