专利名称：一种应用于组织工程椎间盘髓核构建的种子细胞接种方法
技术领域：
本发明属于组织工程椎间盘髓核的构建技术，具体涉及应用于组织工程椎 间盘髓核构建的种子细胞接种方法。
背景技术：
在组织工程椎间盘髓核的构建过程中，种子细胞的接种是一项关键技术， 接种方法的选择直接影响着种子细胞在支架材料上分布、上架率及细胞的生物 学活性，进而决定所构建组织的生物学功能。目前国内外文献报道的种子细胞 的接种方法很多，其中以静置法最为常用，该方法简单易行，但此法存在的最 大问题是细胞的上架率很低，并且所接种细胞在支架材料中的分布不均匀。于是研究者又尝试使用动态接种法进行接种，其中包括perfusion seeding (灌注 接种法)，spinner flask seeding (旋转接种法)，agitated seeding (搅动接 种法)等，但是这些方法的效率目前仍然存在争论，并且需要借助特殊的设备。 此外，其他接种方法，例如oscillatingperfusion (振荡接种法)，filtration seeding (过滤接种法)等操作比较复杂，且多受限于材料的形状。发明内容本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提出一种应用于组织工程椎 间盘髓核构建的种子细胞接种方法，其方法简单，并能提高种子细胞的上架率和种子细胞在支架内分布的均匀程度。本发明提出的应用于组织工程椎间盘髓核构建的种子细胞接种方法，采用 的种子细胞接种载体为透明质酸，该载体为正常椎间盘髓核的细胞外基质成分， 在整个髓核组织空间结构的维持，髓核组织细胞外基质的稳定，髓核细胞生物 学功能的发挥等方面起着关键的作用。本发明方法的步骤如下一种应用于组织工程椎间盘髓核构建的种子细胞接种方法，所述方法采用 的种子细胞接种载体为透明质酸，其步骤如下(1) 首先将人或动物的椎间盘髓核细胞与用不含血清的DMEM/F12培养液 配制的透明质酸溶液进行混悬，保证细胞悬液中髓核细胞的终浓度为1 X105-1X 1(f个/ml，透明质酸的终浓度为0. 001-0. 01mg/ml;(2) 将本身不含有透明质酸成分的组织工程髓核支架材料用不含血清的 DMEM/F12培养液浸泡后吸干水分，放入培养皿中待用；(3) 将歩骤(1)所制的细胞悬液缓慢滴加至支架材料，在37C°， 5%C02 的孵箱内静置；(4) 30分钟后将细胞-支架复合体移入到培养瓶中，缓慢加入10%胎牛血 清的DMEM/F12培养液，在37C。， 5%0)2培养条件下进行培养，每隔2-3日进行 换液，直到细胞在支架材料内进行增殖并合成细胞外基质，此时将细胞-支架复 合体移植入动物或人体内进行研究或治疗。应用上述种子细胞接种方法具有以下几方面的优点1.透明质酸为正常髓核组织基质成分，具有可降解性，无免疫原性，不激 活补体和促进种子细胞更好发挥生物学功能等特点，因而此接种方法更加的安全、仿生并且可以提高所构建组织的生物学性能。
2. 此种方法操作简单，无需借助特殊的设备，只需将种子细胞与一定浓度 的透明质酸混悬后滴注到本身不含有透明质酸成分的组织工程髓核支架材料上
静置即可。
3. 以往研究证明透明质酸是介导细胞与细胞外基质黏附以及细胞在细胞外 基质上伸展的重要分子，因而此基于透明质酸作为接种载体的接种法可以提高 种子细胞的上架率和种子细胞在支架内分布的均匀程度。
4. 透明质酸为正常髓核基质成分，具有良好的生物相容性，因而此接种方 法在组织工程髓核研制领域当中可以广泛应用。
5. 所应用的透明质酸价格便宜，因而此种方法经济实用，易于推广使用。
具体实施方式
实施例1:
1. 首先将分离培养的三周龄新西兰乳兔椎间盘髓核细胞与用DMEM/F12培养 液(无血清)配制的透明质酸溶液进行混悬，保证细胞悬液中髓核细胞的终浓度 为1X 105-1 X 1()6个/ml，透明质酸的终浓度为0. 001-0. 01mg/ml。
2. 将I型胶原海绵支架材料用DMEM/F12培养液(无血清)浸泡后尽量吸干 水分，放入培养皿中待用。
3. 将第1步所制的细胞悬液缓慢滴加至支架材料，在37C。， 5%0)2的孵箱内
内静置。
4. 30分钟后将细胞-支架复合体移入到培养瓶中，缓慢加入DMEM/F12培养液 (含10%胎牛血清)，在37C° ， 5%0)2培养条件下进行培养，每隔2-3日进行换液，直到细胞在支架材料内进行增殖并合成细胞外基质，此时将细胞-支架复合体移 植入兔椎间盘退变动物模型体内进行研究。实施例21. 首先将分离培养的人椎间盘髓核细胞与用DMEM/F12培养液(无血清) 配制的透明质酸溶液进行混悬，保证细胞悬液中髓核细胞的终浓度为1X105-1X 1(f个/ml，透明质酸的终浓度为0. 001-0. 01mg/ml。2. 将聚磷酸钙支架材料用DMEM/F12培养液(无血清)浸泡后尽量吸干水 分，放入培养皿中待用。3. 将第1步所制的细胞悬液缓慢滴加至支架材料，在37C°， 5%0)2的孵箱内静置。4. 30分钟后将细胞-支架复合体移入到培养瓶中，缓慢加入DMEM/F12培养液 (含10%胎牛血清)，在37C。， 5%0)2培养条件下进行培养，每隔2-3日换液，直到细胞在支架材料内进行增殖并合成细胞外基质，此时将细胞-支架复合体移植 入病人已摘除髓核组织的退变节段椎间盘内进行治疗。 上述各例中使用的DMEM/F12培养液由Hyclone公司提供。
权利要求
1. 一种应用于组织工程椎间盘髓核构建的种子细胞接种方法，所述方法采用的种子细胞接种载体为透明质酸，其步骤如下(1)首先将人或动物的椎间盘髓核细胞与用不含血清的DMEM/F12培养液配制的透明质酸溶液进行混悬，保证细胞悬液中髓核细胞的终浓度为1×105-1×106个/ml，透明质酸的终浓度为0.001-0.01mg/ml；(2)将本身不含有透明质酸成分的组织工程髓核支架材料用不含血清的DMEM/F12培养液浸泡后吸干水分，放入培养皿中待用；(3)将步骤(1)所制的细胞悬液缓慢滴加至支架材料，在37C°，5％CO2的孵箱内静置；(4)30分钟后将细胞-支架复合体移入到培养瓶中，缓慢加入10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，在37C°，5％CO2培养条件下进行培养，每隔2-3日进行换液，直到细胞在支架材料内进行增殖并合成细胞外基质，此时将细胞-支架复合体移植入动物或人体内进行研究或治疗。
2、根据权利要求1所述的应用于组织工程椎间盘髓核构建的种子细胞 接种方法，其特征在于所述支架材料为本身不含有透明质酸成分的组织 工程髓核支架材料，选自I型胶原海绵支架材料、聚磷酸钙支架材料、藻 酸盐支架材料、壳聚糖及其衍生物支架材料、聚羟基乙酸支架材料、聚乳酸支架材料。
全文摘要
本发明提出一种应用于组织工程椎间盘髓核构建的种子细胞接种方法，采用的种子细胞接种载体为透明质酸，接种步骤为首先将人或动物的椎间盘髓核细胞与透明质酸溶液进行混悬，再将支架材料用培养液浸泡后吸干水分待用，然后用细胞悬液缓慢滴加至支架材料，静置，最后将细胞-支架复合体移入到培养瓶中，缓慢加入培养液培养，直到细胞在支架材料内进行增殖并合成细胞外基质，即可移植入动物或人体内进行研究或治疗。该方法简单，具有更加的安全、仿生并且可以提高所构建组织的生物学性能，提高种子细胞的上架率和种子细胞在支架内分布的均匀程度等优点。
文档编号A61L27/38GK101285052SQ20081006960
公开日2008年10月15日 申请日期2008年4月29日 优先权日2008年4月29日
发明者跃 周, 李长青, 博 黄 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院