专利名称：人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法
技术领域：
本发明属于基础医学的细胞共培养，具体涉及一种人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法。
背景技术：
髓核细胞是人椎间盘组织中的主要细胞，对维持椎间盘正常形态具有重要的作用，相关研究发现退变的椎间盘中髓核细胞大量凋亡[Jones P, Gardner L, MenageJ, Williams GT, Roberts S:1ntervertebral disc cells as competent phagocytesin vitro:1mplications for cell death in disc degeneration.Arthritis research&therapy2008, 10(4):R86.] ； [Tschoeke SK, Hellmuth M, Hostmann A, RobinsonY,Ertel ff, Oberholzer A, Heyde CE:Apoptosis of human intervertebral discs aftertrauma compares to degenerated discs involving both receptor-mediated andmitochondrial-dependent pathways.Journal of orthopaedic research:officialpublication of the Orthopaedic Research Society2008, 26 (7): 999-1006.],椎间盘作为机体内最大的免疫赦免器官[Buckwalter JA MV, Boden SD, Eyre DR, WeidenbaumM: Rosemont:American Academy of Orthopaedic Surgeons, 2nd ed edn; 2000.],其凋亡与免疫细胞的影响密切相关。但目前尚无免疫细胞与椎间盘髓核细胞的共培养研究模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法即通过建立模型研究人椎间盘免疫赦免的作用机制。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:I)人髓核细胞分离及培养首先将髓核组织在无菌条件下分离，弃去其中的纤维环组织节软骨板，将剩余的髓核组织在室温下置于胰蛋白酶溶液中消化，随后离心弃去上清液，在室温下用II型胶原酶静止消化后，再离心，弃去上清液，细胞用PBS液冲洗离心后以45 μ m孔径的尼龙过滤网滤去剩余组织，计数板进行细胞计数；再以胎牛血清的DMEM/F12培养液将细胞接种于培养瓶内，置于37°C含CO2的培养箱中进行培养，每三天换液一次；2)人外周血巨噬细胞的分离及培养2.1)外周血单核细胞(PBMCs)分离利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的体积比将抽取的外周血加入RPM1-1640培养基并混匀，随后再以1:1的体积比缓慢加至细胞分离液Ficoll-Paque中，室温下以SOOXg离心30分钟，随后吸取白膜层即为外周血单核细胞；2.2)巨噬细胞分离及培养
将外周血单核细胞接种于含胎牛血清的RPM1-1640培养液的培养瓶中，置于37°C含C02的培养箱中进行培养，24h后，弃去培养瓶中上清液，即去除非粘附细胞，向剩余的粘附细胞中加入18ng/mL浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL浓度的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，培养5天后，得到的粘附细胞即为外周血巨噬细胞；3)人外周血⑶8+T细胞分离及培养利用⑶8+T-cell Positive Isolation Kit试剂盒,根据说明，对外周血淋巴细胞逐步分离，得到外周血中的⑶8+T细胞；4)人髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型采用半透膜孔径为0.4μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接触共培养模型，将第I步得到的髓核细胞与免疫细胞(即巨噬细胞或CD8+T细胞)按1:1的体积比共
培养；具体操作为:以1.5X106/孔的数目将髓核细胞接种于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液作为培养基；将1.5X IO6的巨噬细胞或⑶8+T细胞接种于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共养48小时后，根据实验目的对髓核细胞、巨噬细胞或CD8+T细胞进行相关检测。所述步骤I)将剩余的髓核组织先剪成I X Imm3碎块，在室温下置于质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化40min,随后以1000r/min离心5min,弃去上清液,于室温下用质量浓度为0.025%的II型胶原酶静止消化4h，再以1000r/min离心5min，弃去上清液，细胞再用PBS液冲洗3次，以1000r/min离心5min后以45 μ m孔径的尼龙过滤网滤去剩余组织，计数板进行细胞计数； 再以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液将细胞接种于培养瓶内，置于37°C含5%C02的培养箱中进行培养，每三天换液一次。将外周血单核细胞接种于含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液接种于培养瓶中，置于37°C含5%C02的培养箱中进行培养，24h后。本发明共培养模型较好模拟了体外人髓核细胞和免疫细胞相互作用，可为体外椎间盘免疫研究提供一种新的实验思路。发明人已在研究=FasL在椎间盘免疫赦免中的作用机制研究中，采用该共培养模型。此研究通过上调椎间盘退变患者髓核细胞中的FasL表达量，并与免疫细胞共培养后发现，FasL在髓核细胞中的上调可有效增加免疫细胞的凋亡比例。
具体实施例方式I)人髓核细胞分离及培养将收集的髓核组织在无菌条件下仔细分离，弃去纤维环组织节软骨板，将剩余的髓核组织剪成I X Imm3碎块，于室温下以浓度为0.25%的胰蛋白酶消化40min，随后低速离心(1000r/min) 5min,弃去上清液,于室温下用0.025%的II型胶原酶静止消化4h,低速离心(1000r/min) 5min后弃去上清液,细胞再用PBS液冲洗3次,低速离心5min,以45 μ m孔径的尼龙过滤网滤去剩余组织，计数板进行细胞计数。以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液将细胞接种于培养瓶内，置于37°C含5%C02的培养箱中进行培养。每三天换液一次，密切观察细胞生长状态。培养状态下的髓核细胞。
2)人外周血巨噬细胞分离及培养2.1)外周血单核细胞(PBMCs)分离外周血单核细胞分离采用密度梯度离心法，利用肝素抗凝管抽取志愿者外周血15mL,以1:3比例加入RPM1-1640培养基并混匀，随后再以1:1比例缓慢加至细胞分离液(FicolΙ-Paque)上。室温下以800Xg离心30分钟。随后吸取白膜层即为外周血单核细胞。2.2)巨噬细胞分离及培养将上一步收集的外周血单核细胞以含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液接种于培养瓶中，置于37°C含5%C02的培养箱中进行培养。24h后，弃去培养瓶中上清液，即去除非粘附细胞，向剩余的粘附细胞中加入18ng/mL浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和 20ng/mL浓度的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，培养5天后，得到的粘附细胞即为外周血巨噬细胞。利用流式细胞仪以PE标记的CD68抗体检测巨噬细胞纯度。3)人外周血⑶8+T细胞分离及培养CD8+T细胞采用免疫磁珠法分离,利用Q)8+T-cell Positive Isolation Kit试剂盒，根据说明，对外周血淋巴细胞逐步分离，得到90%外周血中的CD8+T细胞。利用流式细胞仪以APC标记的⑶8a抗体检测⑶8+T细胞纯度。4)人髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型。采用半透膜孔径为0.4 μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接触共培养模型，将第I步得到的髓核细胞与免疫细胞(即巨噬细胞或CD8+T细胞)按1:1的体积比共
培养；具体操作为:以1.5X106/孔的数目将髓核细胞接种于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液作为培养基；将1.5X IO6的巨噬细胞或⑶8+T细胞接种于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共养48小时后，根据实验目的对髓核细胞、巨噬细胞或CD8+T细胞进行相关检测。
权利要求
1.人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法，其特征在于: 1)人髓核细胞分离及培养 首先将髓核组织在无菌条件下分离，弃去其中的纤维环组织节软骨板，将剩余的髓核组织在室温下置于胰蛋白酶溶液中消化，随后离心弃去上清液，在室温下用II型胶原酶静止消化后，再离心，弃去上清液，细胞用PBS液冲洗离心后以45 μ m孔径的尼龙过滤网滤去剩余组织，计数板进行细胞计数； 再以胎牛血清的DMEM/F12培养液将细胞接种于培养瓶内，置于37°C含CO2的培养箱中进行培养，每三天换液一次； 2)人外周血巨噬细胞的分离及培养 2.1)外周血单核细胞(PBMCs)分离 利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的体积比将抽取的外周血加入RPM1-1640培养基并混勻，随后再以1:1的体积比缓慢加至细胞分离液Ficoll-Paque中，室温下以800Xg离心30分钟，随后吸取白膜层即为外周血单核细胞； 2.2)巨噬细胞分离及培养 将外周血单核细胞接种于含胎牛血清的RPM1-1640培养液的培养瓶中，置于37°C含C02的培养箱中进行培养，24h后，弃去培养瓶中上清液，即去除非粘附细胞，向剩余的粘附细胞中加入18ng/mL浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL浓度的巨噬细胞集落刺激因子( M-CSF)，培养5天后，得到的粘附细胞即为外周血巨噬细胞； 3)人外周血⑶8+T细胞分离及培养 利用⑶8+T-cell Positive Isolation Kit试剂盒,根据说明，对外周血淋巴细胞逐步分离，得到外周血中的CD8+T细胞； 4)人髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型 采用半透膜孔径为0.4 μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接触共培养模型，将第I步得到的髓核细胞与免疫细胞(即巨噬细胞或CD8+T细胞)按1:1的体积比共培养； 具体操作为:以1.5X IO6/孔的数目将髓核细胞接种于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液作为培养基；将1.5X IO6的巨噬细胞或⑶8+T细胞接种于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共养48小时后，根据实验目的对髓核细胞、巨噬细胞或CD8+T细胞进行相关检测。
2.根据权利要求1所述的人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法，其特征在于:所述步骤I)将剩余的髓核组织先剪成I X Imm3碎块，在室温下置于质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化40min,随后以1000r/min离心5min,弃去上清液,于室温下用质量浓度为0.025%的II型胶原酶静止消化4h，再以1000r/min离心5min，弃去上清液，细胞再用PBS液冲洗3次，以1000r/min离心5min后以45 μ m孔径的尼龙过滤网滤去剩余组织，计数板进行细胞计数； 再以含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液将细胞接种于培养瓶内，置于37°C含5%C02的培养箱中进行培养，每三天换液一次。
3.根据权利要求1所述的人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法，其特征在于:将外周血单核细胞接种于含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液接种于培养瓶中，置于37°C含5%C02的培养箱中进行培养，24h后。
全文摘要
人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法，即通过建立模型研究人椎间盘免疫赦免的作用机制。本发明共培养模型较好模拟了体外人髓核细胞和免疫细胞相互作用，可为体外椎间盘免疫研究提供一种新的实验思路。发明人已在研究FasL在椎间盘免疫赦免中的作用机制研究中，采用该共培养模型。此研究通过上调椎间盘退变患者髓核细胞中的FasL表达量，并与免疫细胞共培养后发现，FasL在髓核细胞中的上调可有效增加免疫细胞的凋亡比例。
文档编号C12N5/0783GK103215223SQ201310085259
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者王海强, 刘志恒, 李新奎, 李昂, 高扬, 孙振, 陈宇飞, 张威林, 张泳照, 万中元 申请人:中国人民解放军第四军医大学