专利名称：分泌高中和活性传染性法氏囊病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分泌高中和活性传染性法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体的杂交瘤细胞，属于生物技术领域，涉及抗体工程技术。具体为单克隆抗体杂交瘤细胞C128株具有优良的生产性能，分泌的单克隆抗体不仅中和效价高而且对不同动物源的IBDV毒株均具有高中和活性，可以用于传染性法氏囊病(IBD)发病动物的临床治疗。
背景技术：
传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的以侵害雏禽淋巴组织,特别是中枢免疫器官一法氏囊为主要特征的传染病。该病不但引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑制，使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败，是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。尽管采取了以免疫接种疫苗为主的综合性防控措施，但由于IBDV的生物学性质稳定、易变异以及多种禽鸟类可带毒传播，目前仍是危害养鸡业的主要传染病之一，由该病导致的经济损失巨大。IBDV是双RNA病毒科禽双RNA病毒属成员，基因组由大(A)小(B)两个节段组成，编码五种病毒蛋白:乂？1、￥ 2、￥ 3、￥ 4和￥ 5。VPl是病毒的非结构蛋白，是由B节段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶，与病毒RNA的复制和毒力有关。A节段(3.3 kb)含有2个部分重叠的开放阅读框(0RF)，其中较大的ORF编码多聚蛋白VP2-4-3，然后该蛋白进一步剪切加工成三个成熟蛋白VP2、VP4、VP3。VP2和VP3是病毒的结构蛋白，构成病毒衣壳。VP2占结构蛋白总量的51%，分子量为37 40kD，既是病毒的的主要结构蛋白又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异等有关。VP3和病毒RNA组成螺旋状的核蛋白复合物，位于病毒颗粒内部。VP4为病毒自身蛋白酶。另一个小ORF编码VP5，是病毒的非结构蛋白，与病毒的毒力和复制效率有关。目前，预防IBD的主要手段是疫苗免疫接种。低毒力的传染性法氏囊病活疫苗在有母源抗体存在的条件下难以达到理想的免疫效果，无法有效地抵抗IBDV野毒的感染。中等毒力的传染性法氏囊病活疫苗可突破母源抗体，有效激发免疫保护，有效地抵抗IBDV感染，但这些毒株会不同程度地造成法氏囊的损伤。活疫苗的使用存在着IBDV发生自然重配而产生变异强毒株的风险，变异强毒株与超强毒株(vvIBDV)的出现，以及野外IBDV毒株VP2基因变异引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移产生的抗原变异株，使传统的疫苗毒株不能提供完全有效的免疫保护，IBD疫苗免疫预防失败不断发生。在养鸡生产中，对IBD免疫预防失败的IBD发病动物进行治疗，可降低发病动物的死亡率，减少经济损失。目前，使用的IBDV卵黄抗体或高免血清治疗方法，因免疫动物与抗原存在着批次差异，不仅生产的不同批次的抗体效价不一致，更重要的是由于多种疫病可以通过卵黄垂直传播和血液水平传播，因此在卵黄抗体或高免血清生产过程中存在着蛋源性和血源性疫病传播的巨大风险，产生严重的生物安全问题。运用淋巴细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有特异性高、效价高、可大规模生产、便于质量控制等优点。应用具有高中和活性的IBDV单克隆抗体治疗IBD发病动物，可以克服目前使用的IBDV卵黄抗体或高免血清的诸多缺点，提高疗效。目前，有关分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株已有报道，部分细胞株分泌的单克隆抗体对IBDV具有中和活性，但中和效价低，对不同IBDV毒株的中和活性未见报道。本发明从IBD疫苗免疫预防失败的发病鸡法氏囊组织中分离IBDV当前流行强毒株为免疫原，运用淋巴细胞杂交瘤技术建立了 IBDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞库，通过IBDV中和试验筛选出了分泌高中和效价的单克隆抗体杂交瘤细胞C128株，分泌的单克隆抗体对鸡源IBDV强毒株、鸭源IBDV强毒株、鹅源IBDV强毒株以及IBDV弱毒疫苗株均具有高中和活性(达到101(1)，本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞C128株具有优良的生产性能，分泌的单克隆抗体不仅中和效价高而且抗IBDV毒株范围广，将本发明制备的高中和活性单克隆抗体治疗剂应用于IBD发病动物的临床治疗，不仅疗效显著，并且在单克隆抗体生产过程中没有引入外源 疫病的风险等生物安全问题。
发明内容
技术问题
传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、热性、高度接触性传染病，是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。在养鸡生产中，对IBD免疫预防失败的IBD发病动物进行治疗，可降低发病动物的死亡率，减少经济损失。目前，使用卵黄抗体和高免血清治疗IBD，虽然可降低发病动物的死亡率，减少经济损失，但在卵黄抗体或高免血清生产过程中存在着蛋源性和血源性疫病传播的巨大风险，产生严重的生物安全问题。本发明的目的是提供一种分泌高中和活性IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株的建立是用近期从疫苗免疫失败的IBD发病鸡群中分离的现行流行毒株IBDV-AHl为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术建立的167株IBDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞库中获得的。用该杂交瘤细胞C128株制备的小鼠腹水，经病毒中和试验证明不仅中和效价高而且抗IBDV毒株范围广，应用于IBD发病动物的临床治疗，疗效显著，并且在单克隆抗体生产过程中没有引入外源疫病的风险等生物安全问题。
技术方案
一种分泌高中和活性传染性法氏囊病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞C128株，该杂交瘤细胞株于2013年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201322，分类命名:杂交瘤细胞。用所述杂交瘤细胞C128株制备的传染性法氏囊病毒单克隆抗体。所述的单克隆抗体可在制备传染性法氏囊病毒单克隆抗体治疗剂中得到应用。所述单克隆抗体治疗剂对鸡源IBDV强毒株、鸭源IBDV强毒株、鹅源IBDV强毒株以及IBDV弱毒疫苗株的中和效价高达101(1。所述单克隆抗体治疗剂可用于IBD发病动物的临床治疗。所述单克隆抗体治疗剂制备方法为，将杂交瘤细胞C128株注射到经BALB/c小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水，离心，收集上清液，灭活补体，过滤除菌，中和效价测定，稀释，加入稳定剂，分装，低温冻存。
有益效果本发明的特点和优点如下:
1.本发明使用的IBDV免疫原是从疫苗免疫预防失败的发病鸡法氏囊组织中分离的IBDV当前流行强毒株。2.本发明从建立的167株分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞C128株，用其制备的小鼠腹水抗体对IBDV的病毒中和效价高达101(1。3.本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对鸡源IBDV强毒株、鸭源IBDV强毒株、鹅源IBDV强毒株以及IBDV弱毒疫苗株均表现高中和活性，抗IBDV毒株范围广。4.本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体治疗剂，用于IBD发病动物的临床治疗，治愈率达96%，疗效显著，安全无不良副反应。于-20°C保存二年后抗体中和效价不降低，稳定性好。
具体实施例方式(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.1BDV抗原的制备从近期IBD疫苗免疫失败的发病鸡法氏囊组织中分离当前流行IBDV强毒株(王永山等，近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征，中国兽医科学，2008，38(12): 919-925)，感染4周龄的SPF鸡，采取死亡鸡的法氏囊组织，制成组织匀浆，冻融三次，9000rpm离心30min，取上清液，采用PEG沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，夹心ELISA检测纯化后病毒抗原，紫外分光光度计测定病毒浓度，-70°C保存备用。
2.动物免疫用纯化的IBDV作为免疫原，腹腔注射免疫6 8周龄雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，50yg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂(Sigma公司广品)乳化抗原,再免疫2次。3免后第7d断尾采血，用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选取血清抗体ELISA效价> IO6的小鼠，在融合前3d用不加佐剂的IBDV抗原经腹腔注射加强免疫。3.细胞融合采用PEG细胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5 1:10的比例，充分混勻，IOOOrpm离心lOmin，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40°C水浴预热，用ImL吸管在45s内加完预热至40°C的50% PEG4000(Sigma公司产品)ImL,边加边轻轻振荡,然后在90s内加入15mL预热至37°C的无胎牛血清的RPM1-1640培养基，室温静置lOmin，IOOOrpm离心lOmin，弃上清，加入含15%胎牛血清(FCS)(兰州民海公司产品)和HAT (Sigma公司产品)的RPM1-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5% CO2培养箱培养。3d后补加含HAT (Sigma公司产品)和15% FCS (兰州民海 公司产品)的RPM1-1640培养基，5d后改用含HT (Sigma公司产品)和15% FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养基，IOd后换成含15% FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。4.杂交瘤细胞的筛选按方阵法确定纯化IBDV抗原的包被浓度，用包被液为
0.05 mo I/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对纯化的IBDV抗原进行倍比稀释，用稀释至400倍的IBDV抗原量包被ELISA板，100 μ L/孔，置4 °C包被过夜，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10%小牛血清的PBST封闭每孔，200 μ L/孔，37°C放置2h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将融合后12d的细胞上清、1:1600稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1600稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100 4 17孔，37°〇作用lh，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG (本实验室自制)，100 μ L/孔，37°C放置lh，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入TMB底物，100 μ L/孔，室温避光显色5 IOmin ;每孔加入50 μ L 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD45tlnm值，以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD45tlnm值，当阴性参考血清的OD45tol值兰0.1，阳性参考血清的OD45tlnm值与阴性参考血清的OD45tol值的比值3 2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N ^ 2.1的检测孔判为阳性，隔2 3d后再检测一次，对两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。5.杂交瘤细胞的克隆化首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含15% FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37°C，5 % CO2培养箱中培养，4 5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8 9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD45tlnm值较接近。将克隆化的IBDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存。经过 20次的细胞融合、筛选、克隆、鉴定，建立了 167株稳定分泌IBDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞库。6.腹水的制备将灭菌的液体石蜡腹腔注射8 10周龄的BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.5mL /只，7天后，将杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(含2X106 5X106个杂交瘤细胞)，7 10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000 rpm离心10 min，收集上清，分装后于-20°C保存备用。7.病毒中和试验用建立的167株稳定分泌IBDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备的腹水，分别进行IBDV中和试验，进一步筛选分泌中和效价高、且抗IBDV毒株范围广的单克隆抗体杂交瘤细胞株。7.1鸡源IBDV强毒株的病毒中和试验测定鸡源IBDV强毒株(王永山等，近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征，中国兽医科学，2008，38(12):919-925)的TCID5(I。采用固定病毒稀释抗体的方法，将CEF细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将10倍系列稀释的各株单克隆抗体小鼠腹水分别与等体积含200 TCID5tl的IBDV悬液混合均匀，37°C作用I h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立IBDV及正常CEF细胞对照，置37°C，5%C02温箱培养，观察结果。在167株IBDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株中，杂交瘤细胞C128株制备的小鼠腹水对鸡源IBDV强毒株的中和效价最高，中和效价为10'7.2鸭源IBDV强毒株的病毒中和试验测定鸭源IBDV强毒株(周宗安等，传染性法氏囊病病毒的生态学与流行病学研究[J].中国兽医学报，1998，18(5):43(Γ433.)的TCID50 0采用固定病毒稀释抗体的方法，将CEF细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将杂交瘤细胞株C128制备的小鼠腹水10倍系列稀释，与等体积含200 TCID50的鸭源IBDV强毒株悬液混合均匀，37°C作用I h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立IBDV及正常CEF细胞对照，置37°C，5%C02温箱培养，观察结果，杂交瘤细胞C128株制备的小鼠腹水对鸭源IBDV强毒株的中和效价为10'7.3鹅源IBDV强毒株的病毒中和试验测定鹅源IBDV株(周宗安等，传染性法氏囊病病毒的生态学与流行病学研究.中国兽医学报，1998，18(5):430 433 )的TCID5tl。采用固定病毒稀释抗体的方法，将CEF细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将杂交瘤细胞株C128制备的小鼠腹水10倍系列稀释，与等体积含200 TCID50的鹅源IBDV强毒悬液混合均匀，37°C作用I h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立IBDV及正常CEF细胞对照，置37°C，5%C02温箱培养，观察结果，杂交瘤细胞C128株制备的小鼠腹水对鹅源IBDV强毒株的中和效价为10'7.4 IBDV弱毒疫苗株的病毒中和试验测定IBDV弱毒疫苗B87株(南京天邦生物科技有限公司产品)的TCID5tlt5采用固定病毒稀释抗体的方法，将CEF细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将杂交瘤细胞C128株制备的小鼠腹水10倍系列稀释，与等体积含200TCID50的IBDV疫苗毒悬液混合均匀，37°C作用I h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立IBDV及正常CEF细胞对照，置37°C，5%C02温箱培养，观察结果，杂交瘤细胞株C128制备的小鼠腹水对IBDV弱毒疫苗株的中和效价为101(1。8杂交瘤细胞株C128的生物学特性
8.1杂交瘤细胞株染色体分析用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取SP2/0骨髓瘤细胞和阳性杂交瘤细胞培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1 μ g/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4 5h。用5mL 37°C预温的
0.075mol/L KCI低渗液将细胞吹起混匀，置37°C温箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸为3:1)1 mL， 边滴加边混匀，IOOOrpm离心lOmin。弃上清留细胞沉淀，用5mL固定液将细胞吹起，37°C作用30min，IOOOrpm离心lOmin，重复上述操作一次。细胞沉淀用ImL固定液悬起混匀，用滴管吸取悬液I滴，滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆萨染液染色lOmin，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为94条，而骨髓瘤细胞的染色体的数量为54飞4条，小鼠脾细胞染色体数量为40条，证明所获得的此杂交瘤细胞株是两种细胞融合的结果。8.2分泌抗体稳定性测定将获得的杂交瘤细胞C128株进行连续培养传代50次、液氮冻存与复苏试验，用IBDV抗体间接ELISA方法连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价均为104，证明此杂交瘤细胞株C128能持续稳定地分泌抗IBDV单克隆抗体。8.3单克隆抗体的亚类测定用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(购于Thermoscientific公司)测定杂交瘤细胞C128株分泌单克隆抗体的亚类，结果显示,该单克隆抗体亚类为IgGl K。8.4单克隆抗体的效价测定用间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞C128培养上清ELISA效价为104，腹水ELISA效价为IO12/病毒中和效价为101CI。
8.5单克隆抗体的间接免疫荧光试验实验在24孔细胞培养板中进行。将鸡源IBDV强毒株、鸭源IBDV强毒株、鹅源IBDV强毒株和IBDV弱毒疫苗B87疫苗株分别接种到CEF细胞，培养72h病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20°C预冷的无水乙醇ImL/孔，4°C固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞培养上清液，200 μ L/孔，37°C孵育lh，PBS洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(购买于武汉博士德生物工程有限公司)，200yL/孔，37°C孵育lh，PBS洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体均能与鸡源IBDV强毒株、鸭源IBDV强毒株、鹅源IBDV强毒株和IBDV弱毒疫苗株感染的CEF细胞反应，产生荧光，而与正常CEF细胞无荧光，证明单克隆抗体对IBDV的特异性。8.6单克隆抗体对SPF法氏囊组织的反应性用ELISA包被液(0.05 mo I/L pH
9.6碳酸盐缓冲液)将SPF鸡法氏囊组织悬液抗原稀释500倍，包被ELISA板，100 μ L/孔，置4°C包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以10 %小牛血清封闭每孔，200μ L/孔，37°C放置2h ;PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液、免疫小鼠阳性血清(1:1600稀释)和小鼠阴性血清(1:1600稀释)，加入相应孔内，100 yL/孔，37°C作用90 min ;PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入I: 2000稀释的酶标羊抗鼠IgG, 100 μ L/孔，37°C放置60min ；PBST洗涤5次，每次5min,最后一次拍干；加入TMB 底物，100μ L/孔,室温避光显色5 10 min;每孔加入50yL 2 mo I/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD45tlnm值，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液和小鼠阴性血清的OD45tol值均小于0.1，表明单克隆抗体与SPF法氏囊组织无反应性，进一步证明了单克隆抗体对IBDV的特异性。(二)单克隆抗体治疗剂的制备与检验
1.单克隆抗体治疗剂的制备将液体石蜡注射入8 10周龄BALB/c小鼠，7天后，将杂交瘤细胞株C128注射小鼠腹腔，每只注射2 X IO6 5 X IO6个杂交瘤细胞，7 10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000 rpm，离心10 min，收集上清。单克隆抗体腹水经56°C、30 min处理，离心，收集上清液，灭活补体，过滤除菌，用PBS稀释，加入适宜稳定剂，分装，置-20°C保存备用。2.单克隆抗体治疗剂的效力试验将30日龄SPF鸡(南京天邦生物技术有限公司)随机分成若干组，用IBDV强毒株感染，感染后，肌肉注射不同剂量的单克隆抗体治疗剂，逐日观察，观察临床表现、检测IBDV。实验同步设立不注射单克隆抗体治疗剂对照组。结果:单克隆抗体治疗组中的鸡未出现IBD临床症状，IBDV检测阴性；对照组出现IBD临床症状，死亡率90%，IBDV检测阳性。3.单克隆抗体治疗剂的安全性试验为了检验该制剂的安全性，将5倍的治疗剂量肌肉注射SPF鸡，逐日检测试验鸡的体温、精神状态以及饮食等表现，试验鸡无不良副反应。4.单克隆抗体治疗剂的稳定性试验将分装的单克隆抗体治疗剂，分别置于37°C、4°C、-20°C保存，经不同的保存时间后，取样，用病毒中和试验测定效价。其中置-20°C保存二年后的单克隆抗体治疗剂，中和效价仍为io1C1。(三)单克隆抗体治疗剂的临床应用
将制备的单克隆抗体制备的治疗剂用于养殖场IBD发病鸡的治疗，采用肌肉注射的方法，并辅以对症治疗，治 愈率为96%。
权利要求
1.一种分泌高中和活性传染性法氏囊病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞C128株于2013年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:C201322，分类命名:杂交瘤细胞。
2.用权利要求1所述杂交瘤细胞C128株制备的传染性法氏囊病毒单克隆抗体。
3.用权利要求2所述的单克隆抗体制 备的传染性法氏囊病毒单克隆抗体治疗剂。
全文摘要
本发明涉及一种分泌高中和活性传染性法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，属于生物技术领域。本发明从建立的分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞C128株，用其制备的小鼠腹水单克隆抗体对IBDV的中和效价高达1010。本发明的杂交瘤细胞C128株分泌高中和活性IBDV单克隆抗体不仅中和效价高而且抗IBDV毒株范围广，用于传染性法氏囊病(IBD)发病动物的临床治疗，疗效显著，安全无不良副反应。本发明的杂交瘤细胞C128株制备的单克隆抗体治疗剂，保存二年后中和效价不降低，稳定性好。
文档编号C12R1/91GK103232974SQ20131008519
公开日2013年8月7日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者王永山, 吴晓悠, 诸玉梅, 夏兴霞, 毕振威, 潘群兴, 王晓丽, 欧阳伟, 董晨红 申请人:江苏省农业科学院