专利名称：一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化方法，属于食品生物技术领域。
背景技术：
瑞士乳杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，主要用于干酪的制造。近年来研究发现瑞士乳杆菌有较强的乳蛋白水解活性，其菌株制作的发酵乳具有较强的降血压功能，主要是因为瑞士乳杆菌蛋白酶能水解蛋白产生多肽，即血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。ACE抑制肽作为一类具有抑制ACE活性的肽类物质，通过抑制ACE的活性，阻碍有升高血压作用的血管紧张素II的生成，同时抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，从而使高血压下降，达到降血压的功能。目前用于治疗高血压的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(如卡托普利、阿拉普利等)，都是一些化学合成物，因吸收排泄速度快，会引起咳嗽，肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用；而来源于乳蛋白的ACE抑制肽，其降压效果虽不及合成药物强烈，但无此副作用，
安全可靠。目前，关于利用瑞士乳杆菌蛋白酶直接水解乳蛋白制备ACE抑制肽有一些报导，但是利用游离的瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳蛋白存在一定的弊端:(1)酶不能重复利用；(2)难以将产物和酶分离，从而需要进一步纯化；(3)游离酶不易保存，易失活而增加成本等。这一系列弊端使ACE抑制肽的大规模生产存在成本高而不稳定的问题。本发明提供一种利用海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法。海操酸钠是由α -L-古洛糖醒酸钠(a -L-guluronate,简称G)和β -D-甘露糖醒酸钠(β -D-mannuronate,简称 Μ) 1、4连接的长链线性多糖,海藻酸盐分子链G块容易与Ca2+作用，2条分子链G块间形成一个洞，结合Ca2+外形成蛋盒模型，形成热不可逆凝胶，具有较好的生物相容性和生物可降解性，从而将瑞士乳杆菌蛋白酶固定化在凝胶网络中。利用海藻酸钠包埋与戊二醛交联的双重固定作用，可实现瑞士乳杆菌蛋白酶的重复利用，并为其它酶制剂的固定化提供研究基础；将固定化瑞士乳杆菌蛋白酶作为制备ACE抑制肽的载体，可实现ACE抑制肽的连续化生产。
发明内容
本发明的目的:本发明的目的是提供一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法，得到的固定化瑞士乳杆菌蛋白酶可重复利用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法是，瑞士乳杆菌经过液体培养后得到发酵液，发酵液离心分离得到菌体，将菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液中进行超声波破碎，破碎液离心后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶酶液。在蛋白含量为4mg/mL 12mg/mL的瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，海藻酸钠的终质量浓度为1.5% 2.0%,混匀后用注射器滴入氯化钙溶液中，固化洗涤后加入戊二醛溶液交联，再洗涤浙干，即得到固定化蛋白酶。上述方法中固定化步骤如下:在瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，37°C水浴搅拌混匀；用注射器吸取混合液，滴入0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球；4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.2% 0.8%的戊二醛溶液交联6h ;洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。本发明提供的海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法包括下列步骤:(I)瑞士乳杆菌菌体的制备:将-80°C冷藏的瑞士乳杆菌冻干粉接种于MRS液体培养基(蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐温-801g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，水合硫酸镁0.5g，水合硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，121°C高温灭菌20min)，连续活化3代，在37°C下扩大培养至生长对数期取出。4°C，4500r/min，离心20min，收集菌体。用pH7.1Tris-HCl缓冲液(50mmol/L)洗涤菌体，混匀后在4°C，4500r/min,离心20min,收集菌体,菌体重复洗漆3次,冷藏备用。(2)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备:用pH7.8Tris-HCl缓冲液悬浮瑞士乳杆菌菌体,搅匀后进行超声波破碎，破碎条件为破碎功率300W，破碎时间3s，间隔时间5s，共破碎200次。离心(4°C，4500r/min, 20min)后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液，_80°C冷冻保藏备用。(3)瑞士乳杆菌蛋白酶的固定:在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸钠，37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入
0.4%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。本发明的有 益效果:本发明提供了一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法。海藻酸钠是一种天然的多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。将瑞士乳杆菌蛋白酶用海藻酸钠和戊二醛协同固定后，可实现蛋白酶的重复利用，将其水解乳蛋白可以实现ACE抑制肽的规模制备。本发明提供了海藻酸钠和戊二醛协同固定蛋白酶的方法，较于传统海藻酸钠包埋法，本发明利用了戊二醛的交联作用，固定的蛋白酶更加牢固。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，常规的瑞士乳杆菌均可用于本发明，下面实施例所用的具体菌株，是为了举例说明本发明，不是对本发明技术方案的限制。实施例1( I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备将瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus ATCC15009)接种于 MRS 培养基(蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐温-801g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g,柠檬酸三铵2g，水合硫酸镁0.5g，水合硫酸锰0.05g,蒸馏水1L，121 °C高温灭菌20min)，连续活化三代，培养温度为37°C，培养时间为16-24h (瑞士乳杆菌生长对数期)。将活化后的瑞士乳杆菌进行扩大培养，培养温度为37°C，24h后取出，40C，4500r/min,离心20min,收集瑞士乳杆菌菌体。用pH7.1 (50mmol/L) Tris-HCl缓冲液洗漆菌体,重复洗漆3次,瑞士乳杆菌菌体保藏备用。取瑞士乳杆菌菌体，用pH7.8Tris-HCl缓冲液重新悬浮，菌体与缓冲液比例为Ig: 30mL,搅匀后在300W，破碎时间3s，间隔时间5s的超声波破碎条件下破碎200次。将破碎液于4°C, 4500r/min,离心20min,取上清液即为蛋白酶液,在冷冻条件下保藏备用。(2)海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白含量为8mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠，37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例2瑞士乳杆菌蛋白酶的制备条件同实施例1中(I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备。
在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白浓度为4mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例3瑞士乳杆菌蛋白酶的制备条件同实施例1中(I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白浓度为12mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例4瑞士乳杆菌蛋白酶的制备条件同实施例1中(I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白浓度为8mg/mL)中加入0.45g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例5瑞士乳杆菌蛋白酶的制备条件同实施例1中(I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白浓度为8mg/mL)中加入0.75g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例6瑞士乳杆菌蛋白酶的制备条件同实施例1中(I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白浓度为8mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.2%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例7瑞士乳杆菌蛋白酶的制备条件同实施例1中(I)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备。在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液(蛋白浓度为8mg/mL)中加入0.6g海藻酸钠,37°C水浴搅拌混匀，4°C条件下静置备用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球。4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.6%的戊二醛溶液交联6h。洗涤浙干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。实施例8(I)固定化瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳清蛋白称取一定量的WPC-80乳清浓缩蛋白按6% (W/V)将其溶解，65°C加热lOmin，降至所37°C,调至pH7.5,然后加入固定化瑞士乳杆菌蛋白酶进行水解，[E]/[S] (w/w)为15,在恒温水浴振荡器中酶解8h，水解过程中不断加入浓度为0.lmol/L的NaOH维持pH值，记下消耗的NaOH量，用于水解度的计算，酶解8h后将反应体系在100°C加热20min灭酶，离心后(4500r/min，20min)取上清液进行ACE抑制率的检测。终产品水解度为6.104%, ACE抑制率为59.64%。(2)乳清蛋白水解度的测定乳清蛋白水解度测定采用pH-Stat法，按下式计算出乳清蛋白的水解度:DH% =B (Mb) (I/ a ) (1/Mp) (1/htot) X 100式中:B为NaOH的体积(mL) ；Mb为NaOH的浓度(mol/L);对乳清浓缩蛋白而言，I/ α为2.27 ；ΜΡ为蛋白质的质量(g) ;htot为每克原料蛋白质中妝键的晕摩尔数，对于乳清浓缩蛋白而言，该值取8.8。(3) ACE抑制活性测定先对测定样品(水解液)进行处理，用50%乳酸调节pH至3.4 3.6，离心(5000r/min, 15min,4°C)收集上清液,再用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.3,离心(5000r/min,15min，4°C)收集上清液备用。用含有0.3mol/L NaCl 的 0.lmol/L 硼酸盐缓冲液(pH8.3)将 Hip-His-Leu 配成
5.0mmol /I,的溶液。在 10mT,试管中加入 200 μ L 的 5.0mmo 1/LHip-HiS-Leu 溶液和 80 μ L 的样品(按上述方法处理后的水解产物)，于37°C下保温3分钟后，再加入20 μ LACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.lU/mL)，混匀后在37°C下保温30分钟，再加入250 μ L的1.0moI/L的盐酸溶液以终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，经15秒种振荡混匀后，静置5分钟，用移液管吸取1.0mL的醋酸乙酯层，120°C烘箱烘干，加入1.0mL蒸馏水，混匀后在228nm处测定吸光度。ACE 抑制率=[(B-A) /B] X 100%
其中A为添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度；B为不添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度。
权利要求
1.一种瑞士乳杆菌蛋白酶的固定方法，其特征是，瑞士乳杆菌经过液体培养后得到发酵液，发酵液离心分离得到菌体，将菌体悬浮于TriS-HCl缓冲液中进行超声波破碎，破碎液离心后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液；在蛋白含量为4 mg/mL 12 mg/mL的瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，海藻酸钠的终质量浓度为1.5 % 2.0 %，混匀后用注射器滴入氯化钙溶液中，固化洗涤后加入戊二醛溶液交联，再洗涤浙干，即得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法，其特征是固定化步骤如下:在瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，37°C水浴搅拌混匀；用注射器吸取混合液，滴入0.1 mol/L的氯化钙溶液中，立即成球；4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗漆小球后加入0.2% 0.8%的戍二醒溶液交联6h ;洗漆浙干,得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法，其特征在于包括下列步骤: (1)瑞士乳杆菌菌体的制备:将_80°C冷藏的瑞士乳杆菌冻干粉接种于MRS液体培养基，连续活化3代，在37°C下扩大培养至生长对数期取出；4°C，4500r/min，离心20min，收集菌体；用50mmol/L、pH 7.1Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，混匀后在4°C，4500r/min，离心20min,收集菌体，菌体重复洗涤3次，冷藏备用； (2)瑞士乳杆菌蛋白酶的制备:用pH7.8 Tris-HCl缓冲液悬浮瑞士乳杆菌菌体,搅匀后进行超声波破碎，超声破破碎功率为300W，破碎时间3s，间隔时间5s，共破碎200次；.4°C，4500r/min，离心20 min后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液，_80°C冷冻保藏备用； (3)瑞士乳杆菌蛋白酶的固定:在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸钠，.37°C水浴搅拌混，4°C条件下静置备用；用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入.0.lmol/L的氯化钙溶液中，立即成球；4°C条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h，洗涤浙干， 得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。
全文摘要
本发明公开了一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法。瑞士乳杆菌在液体MRS培养基中培养至生长对数期，取发酵液离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液重新悬浮菌体，搅匀后进行超声波破碎，离心取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液。将海藻酸钠与瑞士乳杆菌蛋白酶液混匀，用注射器吸取混合溶液滴入氯化钙溶液中，成球固化洗涤后加入戊二醛溶液交联，再洗涤沥干，即得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。
文档编号C12N11/10GK103146674SQ201310084959
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者郭宇星 申请人:南京师范大学