Ltb-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法

专利名称：：Ltb-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法
技术领域：
：本发明属于医药工程的药物制剂领域，涉及一种LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，该制剂用于鼻腔免疫，提高了LTB佐剂的活性，增强了流感疫苗的免疫效果。
背景技术：
：流感是一种常见的高发性传染病，每年都会直接或作为原发疾病引起人的死亡。目前国内外普遍使用的流感疫苗多为流感注射疫苗，但注射疫苗存在很多缺点，疫苗通过注射免疫后能够产生高水平的体液抗体，但不能有效阻止流感病毒经呼吸道粘膜侵入体内，另外注射方式存在患者顺应性差、注射器和针头导致感染、疫苗需多次接种、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点。LTB是肠产毒性大肠杆菌分泌的一种热不稳定性肠毒素的B亚单位，它具有很强的黏膜免疫原性和黏膜佐剂活性，能有效地启动机体局部和全身的体液免疫和细胞免疫，已成为黏膜疫苗研究的重要佐剂。LTB作为疫苗佐剂，为了提高佐剂效应，与流感疫苗结合大多采用简单混合或融合蛋白的方式。LTB与流感疫苗简单混合免疫的方法比较简单，使用比较方便，但LTB作为佐剂抗原提呈性低，提高小鼠血清及黏膜的抗体水平有限，体液免疫和细胞免疫水平相对较低。采用蛋白融合的技术将LTB和流感疫苗形成融合蛋白来实现，但此方法专属性较强，操作复杂，纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，整个后处理过艺复杂，工艺量大；流感疫苗易受到酶的破坏而降解，制备工艺复杂且不具有普遍性，融合蛋白可能引入无关抗原，有免疫原性，不能多次给药。
发明内容本发明的目的是要解决现有技术存在的上述问题，提供一种LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，使LTB佐剂活性得到进一步增强，提高流感疫苗的免疫水平，既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部粘膜免疫，且可简化生产工艺，降低成本。本发明使用一种化学性质非常活跃的双功能试剂碳化二亚胺类化合物，利用它既可与羧甲基壳聚糖的羧基又可与LTB的氨基縮合的性质，合成LTB-羧甲基壳聚糖交联物，以交联物和流感裂解疫苗为原料，表面活性剂为辅料，通过单乳化法制备微球，反应过程为羧甲基壳聚糖-COOH+NH2—LTBR-NH-CH-R'>羧甲基壳聚糖—CO—NH—LTB+R-NH-CO-NH-R'为了达到本发明的目的所采取的具体技术方案是1、取羧甲基壳聚糖溶液和氯化钠溶液混合得混合水溶液，碳化二亚胺类化合物溶解于二甲基亚砜溶剂中，向混合水溶液中加入含有碳化二亚胺类化合物的二甲基亚砜溶液，搅拌3060分钟，48'C反应18小时，最终得混悬液，向混悬液中加入LTB的PBS缓冲液，pH6.58.0，48'C反应18小时，加入甘氨酸反应14小时，反应液过硅胶柱，洗脱液乙酸-水-丁醇，摩尔比为h13:48，收集产物；用流动去离子水透析2448小时，收集透析液的LTB-羧甲基壳聚糖交联物，LTB、甘氨酸、碳化二亚胺类化合物、氯化钠、羧甲基壳聚糖质量比为1:110:1~10:1~10:50~訓；2、取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液中，pH6.58.0，将流感裂解疫苗和表面活性剂溶解在LTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，流感裂解疫苗、表面活性剂与交联物的质量比为1:1050:画500;3、将第二步的水相加入到油相中，搅拌形成稳定的乳液；其中水相与油相的体积比为h5~20，搅拌4590分钟，转速为500~4000转/分钟；4、向第三步制得的乳液中加入浓度为130。/。(w/v)的固化剂，乳液与固化剂溶液的体积比l:12，继续搅拌13小时后停止；5、离心分离第四步制得的分散体系，分出下层的微球，洗涤，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。上述的碳化二亚胺类化合物是二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺、乙丙基碳化二亚胺或l-乙基-3(3，-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。上述的表面活性剂是Span20、Span40、Span60、Span80、吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。上述的油相是液体石蜡、花生油、玉米油、大豆油或橄榄油。上述的固化剂是甲醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。上述的离心分离时分别用石油醚和蒸馏水依次充分洗涤，并在室温下真空干燥。本发明的有益效果是通过本发明得到的LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的球形度好，不仅具有优良的生物相容性和生物粘附性，采用LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球对BALB/c小鼠进行鼻腔黏膜免疫试验，结果显示LTB能有效地启动机体局部和全身的体液免疫和细胞免疫，相比于其他免疫组，以LTB-羧甲基壳聚糖交联物为材料制备的流感疫苗鼻腔免疫微球，大大提高了LTB的佐剂作用，极大增强了机体局部和全身的体液免疫和细胞免疫效果。另外解决了注射方式存在患者顺应性差、注射器和针头导致感染、疫苗需多次接种、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，该LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法条件温和，工艺简单易行，生产成本较低。BALB/c小鼠鼻腔黏膜免疫实验结果见下表；BALB/c小鼠鼻腔黏膜免疫实验结果示意表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注A:流感疫苗滴鼻免疫组，B:LTB+流感疫苗混合组分滴鼻免疫组，C:LTB+羧甲基壳聚糖流感疫苗微球混合组分滴鼻免疫组，D:LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球PBS缓冲液滴鼻免疫组，E:滴鼻PBS缓冲液对照组；LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球扫描电镜照片如图1所示。图1是LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球扫描电镜照片。具体实施例方式以下实例对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术方案的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段作出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。实例1取20y。(w/v)羧甲基壳聚糖溶液25mL和5%~/力氯化钠溶液2mL混合得混合水溶液，将l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶解于二甲基亚砜溶剂配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的浓度为5。/。(w/v)的二甲基亚砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的二甲基亚砜溶液2mL，搅拌30分钟，4°C反应1小时，最终得混悬液，向混悬液中加入l%(w/v)LTB的PBS缓冲液10mL，pH6.5，4。C反应3小时，加入l%(w/v)甘氨酸溶液10mL反应1小时，反应液过硅胶柱，洗脱液乙酸-水-丁醇，摩尔比为h1:4，收集产物。用流动去离子水透析24小时，收集透析液得LTB-羧甲基壳聚糖交联物。取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液配制成浓度为5。/。(w/v)的LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶液，pH6.5，取10mg流感裂解疫苗和100mg吐温80溶解在20mLLTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，将水相加入到100mL液体石蜡中，搅拌形成稳定的乳液；搅拌45分钟，转速为500转/分钟；向制得的乳液中加入5。/。(w/v)的三聚磷酸钠溶液130mL，继续搅拌1小时后停止；离心分离制得的分散体系，分出下层的微球，然后用石油醚洗涤3次，无菌蒸馏水洗涤3次，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。实例2取10M(w/v)羧甲基壳聚糖溶液40mL和10"/。(w/v)氯化钠溶液5mL混合得混合水溶液，将l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶解于二甲基亚砜溶剂配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的浓度为5M(w/v)的二甲基亚砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的二甲基亚砜溶液7.5mL，搅拌40分钟，6°C反应3小时，最终得混悬液，向混悬液中加入l%(w/v)LTB的PBS缓冲液5mL，pH7.0，5"C反应5小时，加入2%(w/v)甘氨酸溶液10mL反应2小时，反应液过硅胶柱，乙酸-水-丁醇，摩尔比为1:1.5:5，收集产物。用流动去离子水透析30小时，收集透析液得LTB-羧甲基壳聚糖交联物。取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液配制成浓度为10。/。(w/v)的LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶液，pH7.0，将流感裂解疫苗5mg和100mg的吐温80溶解在15mLLTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，将水相加入到200mL液体石蜡中，搅拌形成稳定的乳液；搅拌50分钟，转速为1000转/分钟；向制得的乳液中加入浓度为10%(w/v)的三聚磷酸钠溶液300mL，继续搅拌1.5小时后停止；离心分离制得的分散体系，分出下层的微球，然后用石油醚洗涤3次，无菌蒸馏水洗涤3次，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。实例3取10。/。(w/v)羧甲基壳聚糖溶液30mL和2。/。(w/v)氯化钠溶液5mL混合得混合水溶液，l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶解于二甲基亚砜溶剂配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的浓度为5。/。(w/v)的二甲基亚砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的二甲基亚砜溶液5mL，搅拌60分钟，8°C反应，6小时，最终得混悬液，向混悬液中加入l%(w/v)LTB的PBS缓冲液5mL,pH7.5，8"C反应7小时，加入5%(w/v)甘氨酸溶液5mL反应3小时，反应液过硅胶柱，洗脱液乙酸-水-丁醇，摩尔比为l:2.5:6，收集产物。用流动去离子水透析36小时，收集透析液得LTB-羧甲基壳聚糖交联物。取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液配制成浓度为12.5M(wA0的LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶液，pH7.5，将流感裂解疫苗5mg和200mg的吐温80溶解在10mLLTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，将水相加入到100mL液体石蜡中，搅拌形成稳定的乳液；搅拌70分钟，转速为3000转/分钟；向制得的乳液中加入浓度为10。/。(w/v)的三聚磷酸钠溶液180mL，继续搅拌2.5小时后停止；离心分离制得的分散体系，分出下层的微球，然后用石油醚洗涤3次，无菌蒸馏水洗涤3次，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。实例4取15。/。(w/v)羧甲基壳聚糖溶液50mL和10。/。(w/v)氯化钠溶液5mL混合得混合水溶液，l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶解于二甲基亚砜溶剂配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的浓度为10。/。(w/v)的二甲基亚砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的二甲基亚砜溶液2mL，搅拌50分钟，6°C反应5小时，最终得混悬液，向混悬液中加入l%(w/v)LTB的PBS缓冲液10mL，pH8.0，4t:反应1小时，加入2%(w/v)甘氨酸溶液10mL反应1小时，反应液过硅胶柱，洗脱液乙酸-水-丁醇，摩尔比为1:1:8，收集产物。用流动去离子水透析24小时，收集透析液得LTB-羧甲基壳聚糖交联物。取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液配制成浓度为10y。(w/v)的LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶液，pH7.5，将流感裂解疫苗10mg和300mg的吐温80溶解在40mLLTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，将水相加入到400mL液体石蜡中，搅拌形成稳定的乳液；搅拌45分钟，转速为4000转/分钟；向制得的乳液中加入浓度为5%(w/v)的三聚磷酸钠溶液600mL，继续搅拌1小时后停止；离心分离制得的分散体系，分出下层的微球，然后用石油醚洗涤3次，无菌蒸馏水洗涤3次，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。实例5取20M(w/v)羧甲基壳聚糖溶液50mL和10。/。(w/v)氯化钠溶液10mL混合得混合水溶液，l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶解于二甲基亚砜溶剂配制成l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的浓度为10。/。(w/v)的二甲基亚砜溶液，向混合水溶液中加入l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的二甲基亚砜溶液10mL，搅拌60分钟，8°C反应8小时，最终得混悬液，向混悬液中加入l%(w/v)LTB的PBS缓冲液10mL，pH8.0，8'C反应8小时，5%(w/v)甘氨酸溶液20rnL反应4小时，反应液过硅胶柱，洗脱液乙酸-水-丁醇，摩尔比为1:3:8，收集产物。用流动去离子水透析48小时，收集透析液得LTB-羧甲基壳聚糖交联物。取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液配制成浓度为20M(w/v)的LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶液，pH8.0，将流感裂解疫苗1Omg和500mg的吐温80溶解在25mLLTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，将水相加入到500mL液体石蜡中，搅拌形成稳定的乳液；搅拌90分钟，转速为4000转/分钟；向制得的乳液中加入浓度为5%(w/v)的三聚磷酸钠溶液1000mL，继续搅拌3小时后停止；离心分离制得的分散体系，分出下层的微球，然后用石油醚洗涤3次，无菌蒸馏水洗涤3次，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。实例1到实例5中所述的l-乙基-3(3'-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺可以用二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺或乙丙基碳化二亚胺代替；实例1到实例5所述的吐温80可以用Span20、Span40、Span60、Span80、吐温20、吐温40或吐温60代替；实例1到实例5所述的液体石蜡可以用花生油、玉米油、大豆油或橄榄油代替；实例1到实例5所述的三聚磷酸钠可以用甲醛、戊二醛、香草醛、硫酸钠或柠檬酸钠代替(权利要求1、一种LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，其特征是1.1、取羧甲基壳聚糖溶液和氯化钠溶液混合得混合水溶液，碳化二亚胺类化合物溶解于二甲基亚砜溶剂中，向混合水溶液中加入含有碳化二亚胺类化合物的二甲基亚砜溶液，搅拌30～60分钟，4～8℃反应1～8小时，最终得混悬液，向混悬液中加入LTB的PBS缓冲液，pH6.5～.0，4～8℃反应1～8小时，加入甘氨酸反应1～4小时，反应液过硅胶柱，洗脱液乙酸-水-丁醇，摩尔比为1∶1～3∶4～8，收集产物；用流动去离子水透析24～48小时，收集透析液的LTB-羧甲基壳聚糖交联物，LTB、甘氨酸、碳化二亚胺类化合物、氯化钠、羧甲基壳聚糖质量比为1∶1～10∶1～10∶1～10∶50～100；1.2、取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液中，pH6.5～8.0，将流感裂解疫苗和表面活性剂溶解在LTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，流感裂解疫苗、表面活性剂与交联物的质量比为1∶10～50∶100～500；1.3、将第二步的水相加入到油相中，搅拌形成稳定的乳液；其中水相与油相的体积比为1∶5～20，搅拌45～90分钟，转速为500～4000转/分钟；1.4、向第三步制得的乳液中加入浓度为1～30％(w/v)的固化剂，乳液与固化剂溶液的体积比1∶1～2，继续搅拌1～3小时后停止；1.5、离心分离第四步制得的分散体系，分出下层的微球，洗涤，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。2、根据权利要求1所述的LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，其特征是所述的碳化二亚胺类化合物是二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺、乙丙基碳化二亚胺或l-乙基-3(3，-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。3、根据权利要求1所述的LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，其特征是所述的表面活性剂是Span20、Span40、Span60、Span80、吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。4、根据权利要求1所述的LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，其特征是所述的油相是液体石蜡、花生油、玉米油、大豆油或橄榄油。5、根据权利要求1所述的LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，其特征是所述的固化剂是甲醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。6、根据权利要求1所述的LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，其特征是离心分离时分别用石油醚和蒸馏水依次充分洗涤，并在室温下真空干燥。全文摘要一种LTB-羧甲基壳聚糖鼻腔免疫微球的制备方法，是以碳化二亚胺类化合物为交联剂，以LTB和羧甲基壳聚糖为主要原料合成LTB-羧甲基壳聚糖交联物；将流感裂解疫苗和表面活性剂溶解于LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶液中，与油相物质混合，经搅拌形成稳定的乳液后加入固化剂水溶液，搅拌沉淀后分离洗涤，真空干燥后即得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球。该微球生物相容性和生物黏附性好，经鼻腔免疫大大提高了LTB的佐剂活性，增强了流感疫苗的机体局部和全身的体液免疫及细胞免疫效果；同时克服了传统注射流感疫苗造成的患者顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低。文档编号A61K47/36GK101530395SQ20091001050公开日2009年9月16日申请日期2009年2月25日优先权日2009年2月25日发明者畅苏,亮赵,马洪林申请人:亮赵