专利名称：淫羊藿苷作为制备治疗急性脑梗死病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的应用，特别涉及将淫羊藿苷作为制备治疗急性脑梗死 病药物的应用。
背景技术：
，
脑血管病是老年人的常见病、多发病，死亡率高，且病后多数患者留有不同 程度的残疾。当前，主要的临床治疗手段有溶栓、抗血小板聚集、脑保护等。因
时间窗的问题，早期溶栓受到限制；而抗血小板药物的应用更多着眼于脑梗死再 发的预防，因此，急性期治疗的焦点集中在脑保护治疗上。
缺血所致脑损害的发病机制目前仍不甚清楚，目前较为公认的可能机制为 氧化应急、兴奋性氨基酸毒性、炎性反应等，无论何种机制，疾病的最终病理过 程皆为神经细胞的死亡，且由于凋亡与死亡的共存即缺血后中心区的神经细胞坏 死和周围神经细胞的凋亡过程，可使病灶逐渐扩大加重病情进展。大量事实证明， 线粒体的结构和功能障碍引发自由基对细胞的损害(即氧化应激)在此过程中发 挥了重要的作用。当组织发生缺血、缺氧等病理改变时，可造成线粒体通透性增 加致使大量氧自由基的释放，且组织对自由基清除能力的下降(线粒体功能异常 引发能量代谢障碍)，最终导致氧自由基聚集。由于脑本身的生理和生化特性， 使其表现为对自由基异常敏感，过量自由基的存在可引起中枢神经系统结构和功 能的破坏。多年的研究表明，氧化应激能诱导神经细胞凋亡，是造成脑缺血后继发 性病理损害的主要机制之一。临床上，针对脑中风的氧化应激反应早期干预以适 度控制应激，已获得了一些令人满意的结果。因此，控制氧化应激以阻断细胞凋 亡信号的传导，寻找有效的缺血性脑损伤的保护措施显得颇为必要。而线粒体作 为活性氧最大的产生地，其功能的改善不仅从源头上减少了氧自由基的产生，同 时也能降低活性氧所造成的细胞损害，此对于发挥急性脑缺血再灌注损伤的保护 作用具有重要的意义。
在本发明之前，淫羊藿苷(icariin, Ica),它是从小檗科淫羊藿属植物中提取的有效成分,是一种黄酮醇苷类化合物，为中药中提取的单体化合物，在心 脑血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统、抗炎、抗骨质疏松、抗衰老、 抗肿瘤等方面均具有重要作用，它对心脑血管系统的影响，它能扩张血管，改善 微循环，增加血流量。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制将淫羊藿苷淫羊泰苷作为制备治疗 急性脑梗死病药物的应用。 本发明的技术方案是
淫羊藿苷作为制备治疗急性脑梗死病药物的应用，其主要技术特征在于将淫 羊藿苦单体经口服应用于急性脑梗死的治疗。
本发明利用淫羊楚苷具有的强大的抗氧化应激作用，且影响下游过氧化物酶 体增歹直物'激活受体y共;敫活因子la (peroxisome proliferator- activated receptor-y coactivator-l , PGC-la)的表达及活性，从而使多功能辅助活化因子的PGC-la 参与调节线粒体氧化代谢，并作为调控线粒体生物合成的关键环节，在某些生理 和病理条件下介导线粒体生物形成，从而在缺血性脑损伤中包括脑梗死发挥重要 的保护作用。
应用淫羊藿苷的机理
淫羊藿苷可抑制氧化应激；淫羊藿苷能上调PGC-la的表达；PGC-la对氧 糖剥夺神经元具有明显的保护作用。
淫羊藍芬主要通过调控PGC-la进而控制氧化应激发挥缺血性脑损伤中的保 护作用。
本发明的其他优点和效果将在下面继续说明。
图1---h鼠脑缺血后行为学结果图
图2—一TTC染色结果图。 图3—一脑含水量图。
图4一一淫羊蓬苷对OGD神经元发挥保护作用的浓度曲线图。 图5——淫羊藿香对0GD神经元发挥保护作用的时间曲线图。 图6——流式细胞仪检测神经元凋亡率图。图7——淫羊藿苷对MCA0脑组织PGC-la mRNA水平的影响图。 图8——淫羊藿苦对MCAO脑组织PGC-la蛋白水平的影响图。 图9——淫羊度苷对0GD神经元PGC-la mRNA水平的影响图。 图10—_淫羊蓉芬对0GD神经元PGC-la蛋白水平的影响图。
具体实施例方式
本发明首先从整体角度，通过行为学、病理学、梗死体积和水肿等方面验证 淫羊藿苷能改善缺血性脑损伤，从而证明淫羊蕾苷对缺血性脑损伤具有治疗作 用；其次，从整体到离体水平，用分子生物学等技术研究淫羊密苷发挥保护效应 过程中PGC-la作用，以证明淫羊藿苷是具有临床应用价值的治疗缺血性脑损伤 的药物。
实验发现，淫羊愛苷可通过上调缺血性脑损伤过程中PGC-la的表达进而发 挥保护效应。
具体如下。 实施例l:
淫羊藿苦单体，白色粉状，规格是10g/瓶，干燥保存于O-5'C;临用时用少 量无水乙醇助溶(体积比小于5%),超纯水配制为lmg/ml原液，IO(TC水浴加热溶 解。
实施例2:
在体实验根据小鼠体重计算所需用量，抽取原液后灌胃；后续离体实验，将
淫羊藿苷原液根据所需浓度作相应的稀释。
实验1:体内研究证明淫羊藿苷对缺血性脑损伤具有治疗作用
成年雄性C57小鼠，体重20 - 30克，随机分为正常对照组和脑缺血再灌注 组，脑缺血再灌注组按当前普遍认可的线栓法制作大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注模型，在缺血2h的基础上再灌注22h， 通过行为学、病理学、梗死体积和水肿程度证明淫羊泰苷对缺血性脑损伤具有治 疗作用。 1)材料和方法
治疗组术前灌服以淫羊藿苷(100mg/kg/d),对照组予以等量生理盐水，然 后制作大脑中动脉缺血动物模型，术后同样方法每天用药，持续至24h、 48h、72h和7天分别处死小鼠。
行为学检测采用longa评分法神经功能缺损评分0分无神经损伤 症状；l分不能完全伸展对侧前爪；2分向对侧转圏；3分向对侧倾倒；4 分不能自发行走，意识丧失。
TTC染色缺血后24小时、72小时和7天的脑组织在^L交叉前后等分间隔 2rara连续作5个脑冠状切片，将其放入提前预热在37° C的1%TTC溶液中避光 30min,期间小心翻动几次，染色后正常組织为红色，脑梗塞组织为白色，将脑 片平面置于刻度纸上，用数码相机照相后输入计算机，采用Sigma Scan Pro5. 0 (Jandel， San Real, CA, USA)软件计算相应的梗塞体积。
脑含水量取缺血后24小时、72小时和7天的小鼠立即断头处死，取出脑 组织，沿大脑中线迅速分离成缺血侧和对照侧大脑半球，并立即称湿重，然后迅 速将大脑半球组织块放入电热烘箱中，100° C烘烤72h，再称干重。如前所述， 脑水胂含量按下列公式计算脑组织含水量(％)=(湿重-干重)/湿重xl00%。 2)结果
(1) 行为学结果longa评分结果提示，在缺血24小时、48小时、72小时 和7天，淫羊度苷可显著减轻缺血所致神经功能缺损，如图1所示。
(2) TTC染色结果在缺血24小时、72小时和7天，与MCA0组相比，淫羊 愛苷的应用均能显著减小坏死体积，其中以72小时最为明显，如图2所示。
(3)脑含水量与对照组相比，MCA0组的脑含水量在24h、 72h明显增加，而 在7天组间无显著差异存在；与MCA0组比较，淫羊藿苷可显著减少24h和72h 缺血组织的脑含水量，如图3所示。
实验2:体外研究证明淫羊藿苷对0GD神经元具有保护作用 1)材料和方法
原代皮层神经元培养:怀孕15-17d野生型昆明小鼠，断颈处死后，取其胚 胎，置于盛有冷HBSS的培养皿中，分离大脑皮层，1X胰酶消化后，置多聚赖氨 酸处理后的24孔培养板中培养，2 ~ 3 x 106细胞/ml，每2-3d部分换液，共培养 10-14d。细胞培养在无血清、无酚红和无雌激素的培养液(Neurobasal加上 Hepes、 B27和谷氨酰胺)中，37°C， 5°化02培养箱。
神经元细胞活力检测使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测神经元的细胞活力。向100m 1培养液/孔中加入mtt, 37 'c,5%c02的培养箱中继续培养 6h ，然后倾去全部培养液,每孔中加入lOOjnl dms0溶液,摇床上摇动至蓝紫色 的结晶完全溶解，酶标计数仪测定各组0d值。
神经元凋亡率检测Annexin-V/PI双染法使用流式细胞仪4企测神经元凋亡 率。收集神经元离心(2000rpm离心5min); PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心 5min)收集1 5xl()5细胞;加入500 n L的Binding Buffer悬浮细胞；力口入5mL Annexin V-FITC混勻后，加入5 m L Propidium Iodide,混匀；室温、避光、反 应5 ~ 15min;流式细J包4义;险测。 2)结果
① 剂量曲线提示淫羊楚苷可显著提高OGD神经元的细胞活力，并呈明显的剂 量相关，当浓度达到0.8mg/l后逐渐进入平台期，如图4所示；时间曲线显示， 在0GD后6h、 12h、 24h和48h,淫羊蓉苷均有明显的^f果护作用，此种差异以24h 最为显著，如图5所示。据此，后续研究均选取浓度为0. 8mg/1、 OGD后24h的 神经元为研究对象。
② 流式细胞仪检测神经元死亡率与前结果相一致，淫羊藿苷可显著减少0GD 所致细胞凋亡，如图6所示。
实验3:体内外研究淫羊藿苷发挥缺血保护作用过程中对PGC-la的影响 1)材料和方法
实时荧光定量PCR :引物为PGC-la (Sense primer: 5'-TGACACAACGCGGACAGAA-3', Anti-sense primer: 5'- GGTAGGTGATGAAA CCATAG -3',), p-actin ( Sense primer: 5，-GGCACCACACYTTCTACAATG-3，， Anti-sense primer: 5，-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAAC-3，，)；探针为PGC-la: 5'FAM + TGAGAGACCGCTTTGAAGTTTTTG + TAMRA3' ， p-actin : 5 ， -FAM+TGTGGCCCCTGAGGAGC ACCC-3'
根据分子生物学技术常规，提取脑组织中总RNA，反转录为cDM,再作实时荧光 定量PCR。反应条件95° C 5分钟1个循环，95° C 30秒、60° C 1分钟40
个循环。
Western Blot:大脑皮质组织研磨后提取蛋白并定量，100g/L SDS-PAGE 凝胶80ug蛋白/孔，恒流40mA电泳，恒压100V电转膜2h，将蛋白转印至PVDF膜。50g/L脱脂奶粉于室温封闭lh,分别加入稀释的一抗4。C孵育过夜。TBST洗膜后， 加入相应的HRP标记二抗，28。C孵育90min, TBST洗膜，加入化学发光试剂至膜上 3min，最后曝光、显影。 2)结果
① 淫羊藿苷对MCAO脑组织PGC-la水平的影响
实时定量PCR 4企测显示与缺血对照组相比，淫羊藿普可增加PGC-la mRNA 的表达水平，且具有时间依赖性，在缺血后72h和7d与单纯缺血组相比具有显 著性差异，如图7所示。
Western Blot ;险测显示与mRNA水平相一致，PGC-la蛋白水平在缺血对照 组与淫羊藿苷组间在各时间点(24小时、72小时和7天)均存在显著性差异， 且PGC-la有随时间延长逐渐升高的趋势，如图8所示。
② 淫羊藿苷对OGD神经元PGC-la水平的影响 实时定量PCR检测显示与对照组相比，OGD过程中PGC-la raRM水平呈上升
趋势；而淫羊藿芬的应用愈加增加PGC-la mRNA的表达，与单纯OGD组存在显著 差异，如图9所示。
Western Blot ;险测显示与mRNA水平相一致，PGC-la蛋白水平在对照组与OGD 组和OGD组与OGD淫羊度苷干预组间均存在显著性差异，如图10所示。
权利要求
1.淫羊藿苷作为制备治疗急性脑梗死病药物的应用，其特征在于将淫羊藿苷单体经口服应用于急性脑梗死的治疗。
2. 根据权利要求1所述的淫羊密脊作为制备治疗急性脑梗死病药物的应用，其 特征在于无水乙醇助溶淫羊泰苷，体积比小于5%,超纯水配制为lmg/ml原液， IO(TC水浴加热溶解。
3. 根据权利要求1所述的淫羊藿苷作为制备治疗急性脑梗死病药物的应用，其特 征在于其口服应用剂量为100mg/kg。
全文摘要
本发明涉及一种将淫羊藿苷作为制备治疗急性脑梗死病药物的应用。本发明技术方案是将淫羊藿苷单体经口服应用于急性脑梗死的治疗，无水乙醇助溶淫羊藿苷，体积比小于5％，超纯水配制为1mg/ml原液，100℃水浴加热溶解，口服应用剂量为100mg/kg。本发明克服了治疗急性脑梗死病药物存在的各种缺陷。本发明成功地将淫羊藿苷转用作治疗急性脑梗死病药物，利用抗氧化应激作用，且影响下游过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisomeproliferator-activated receptor-γcoactivator-1，PGC-1α)的表达及活性，从而使多功能辅助活化因子的PGC-1α参与调节线粒体氧化代谢，并作为调控线粒体生物合成的关键环节，在某些生理和病理条件下介导线粒体生物形成，从而在缺血性脑损伤中包括脑梗死发挥重要的保护作用。
文档编号A61P9/10GK101590071SQ20091003295
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者张辰宇, 运 徐, 朱海荣 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院