专利名称：：聚阳离子化合物在血管生成相关疾病中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及聚阳离子化合物在血管生成相关疾病中的应用。二
背景技术：
：血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。血管生成不仅广泛存在于各种生理过程中，如胚胎发育，创伤愈合，女性生理周期子宫内膜组织重建，同时，多种病理过程，如肿瘤的生长与转移、关节炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、牛皮癣、硬皮病、视网膜病变、艾滋病相关性疾病、中风、心脏病、溃疡和不育等都和血管生成密切相关。正常发育成熟的机体内，广泛存在这各种促血管生成因素和血管生成抑制因素，并保持一种有效的平衡的状态。促进血管生成的因素主要有生长因子及相关受体，如血管内皮生长因子、纤维原细胞生长因子、血小板生长因子，炎症因子如TGF-e，缺氧因素及其下游因子如HIF-1，血管生成相关癌基因如Ras，肿瘤抑制因子如p53，血管生成素及金属基质蛋白酶家族。抑制血管生成的因素主要有各种抗血管生成肽如恩度(endostatin)、血小板反应蛋白(thromnospondin)等,激素代谢物如血管他丁(angiostatin)、凋亡相关蛋白如金属基质蛋白酶组织抑制因子和白细胞介素家族如IL-12、IL-18等。而病理性血管生成正是源于体内这种促血管生成因素与血管生成抑制因素平衡的打破。病理性血管生成一般是由促血管生成因素增加和血管生成因子减少引起。新生血管为病理性组织的生长和恶化提供充足的营养和氧气，清除代谢废物和二氧化碳提供了解剖与组织基础。所以，抑制新生血管形成在治疗血管生成相关疾病具有极其重要的意义。尤其是，近年来的研究表明抑制血管生成能够有效抑制肿瘤的生长与转移。目前，已有一大批蛋白药物进入临床或临床试验，并取得了很好的效果，如恩度，IL-12等。白细胞介素-12(IL-12)被认为是获得性细胞免疫的主要调控因子，主要参与免疫调节与免疫清除，如肿瘤免疫和病毒感染免疫等。一方面，白细胞介素-12作为一个重要的免疫调节因子促进TH1细胞反应，促进CD8+T细胞分化，促3进CD4+T细胞存活与活化，并能够刺激T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)产生干扰素-Y(IFN-Y);另一方面，白细胞介素-12作为一个抗血管生成因子在多个环节上抑制血管的生成1、IL-12通过IFN-Y抑制肿瘤细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)，2、IL-12能够减少金属蛋白酶的产生，从而抑制血管内皮的基质重构，3、IL-12通过IFN-Y降低整合素aVe3(integinaVP3)对内皮细胞的活化，从而1T少内皮细胞的粘附与存活，4、IL-12通过激活淋巴细胞产生IP-10和Mig，再通过这些因子下调内皮细胞活化的各个环节相关的因子，从而抑制血管生成，5、IL-12还能直接作用于肿瘤细胞，直接下调VEGF基因表达，上调STAT-1、IRF-1、LMP2、Mig、单核细胞趋化蛋白-1、血管抑素等基因的表达，从而直接抑制血管生成，6、IL-12通过聚集招募自然杀伤细胞于新生血管处，促进新生血管内皮细胞的细胞溶解作用抑制血管生成。目前，白细胞介素-12除用于肿瘤的治疗外，还用于作为疫苗产生的佐剂。但是，白细胞介素-12作为一个蛋白药物存在着生产和保存成本较高，存在免疫慮性，体内半衰期短等缺点影响大规模应用。三
发明内容本发明需要解决的问题是公开了一种新的有效提高机体白细胞介素-12(IL-12)水平，从而有效阻断血管生成相关疾病的发展的方法，具体涉及聚阳离子化合物应用于血管生成相关疾病的治疗，在实施中具体应用于肿瘤的治疗和类风湿性关节炎的治疗。本发明涉及有效提高机体IL-12水平的化合物为聚阳离子化合物。本发明涉及聚阳离子化合物可以是支链聚合物、直链聚合物或者环状聚合物。本发明涉及的聚阳离子化合物为氨基化修饰多糖，氨基化修饰多肽，氨基化修饰蛋白或其它形式的多聚氨基化合物，聚合物为直链聚合物，支链聚合物或环状聚合物，聚合物的单体分子为相同分子或不同分子。本发明涉及的聚阳离子化合物的氨基为伯氨基，仲氨基或叔氨基，氨基化形式为单氨基化或多氨基化，连接方式和数量不受限制。本发明涉及的聚阳离子化合物在水中由于氨基质子化而带正电荷。本发明涉及聚阳离子化合物物分子量为360道尔顿到280万道尔顿。本发明的技术方案如下1.合成或购买聚阳离子化合物，得到一个聚阳离子化合物的库。2.通过将聚阳离子化合物刺激小鼠脾细胞,测定上清中IL-12浓度，筛选合适的聚阳离子化合物。3.将上面筛得的聚阳离子化合物用于肿瘤或者类风湿性关节炎的治疗。本发明所述聚阳离子化合物在肿瘤治疗中的应用1.将1(^个肿瘤细胞种植与ICR小鼠左腋侧皮下，建立肿瘤模型。2.植瘤同时，给与腹腔注射聚阳离子化合物治疗，或者注射甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照药物。3.每天称量老鼠体重衡量药物毒性，测量老鼠肿瘤直径评价抑瘤效果。4.两周后处死小鼠，取出肿瘤称重，甲醛固定液固定并做病理切片。本发明所述聚阳离子化合物在肿瘤转移治疗中的应用1.将106个S180肿瘤细胞经尾静脉注射入ICR小鼠体内，建立肿瘤转移模型。2.于建模同时，给与腹腔注射聚阳离子化合物治疗，或者注射甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照药物。3.每天称量老鼠体重衡量药物毒性，并统计小鼠存活率。4.三周后处死存活小鼠，摘取肺组织，沉重，甲醛固定液固定并做病理切片。本发明所述聚阳离子化合物在类风湿性关节炎治疗中的应用1.使用完全弗氏佐剂O.lml于SD大鼠右足跖部皮下注射，建立佐剂型关节炎模型。2.将聚阳离子于建立佐剂型关节炎模型同时进行腹腔注射，进行关节炎的干预性治疗，或者与佐剂注射2-3周后腹腔注射，对佐剂性关节炎进行治疗。3.治疗后每天测量大鼠脚踝肿胀程度，并进行评分，定期抽取血液用于测量血清炎症因子，定期进行X放射性影像学检查并进行评分，在治疗2周后处死大鼠，取右足做关节组织切片，评价治疗效果。本发明的有益效果是提供了一类新型抗血管生成药物，该类化合物的具体特征为阳离子高分子化合物，通过给与该类化合物，能够有效提高机体的IL-12的浓度，从而在多个关节能有效抑制关节炎症部位和肿瘤发生部位新生血管的形成，以达到抗炎和抗肿瘤的目的。该类抗血管生成药物为有机高分子，制备原料易于获取，制备条件温和，制备过程，并且所得产物简单性质稳定，易于保存和运输，方便使用。四图1:聚阳离子化合物刺激脾细胞悬液IL-12酶联免疫吸附测定(ELISA)实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>图2:聚阳离子化合物刺激ICR小鼠，血清IL-12酶联免疫吸附测定(ELISA)实验结果:l.空白对照，2.化合物2，3.化合物5，4.化合物6，5.化合物7，6.化合物10，7.化合物13，8.化合物15，9.化合物16，10.化合物19，11.化合物20，12.化合物21，13.化合物25，14.化合物27，15.化合物29。图3:化合物2应用于治疗佐剂型关节炎患足照片图1模型组，2治疗组，3正常对照组。图4:化合物5应用于治疗佐剂型关节炎评分图B模型组，參治疗组。图5:化合物27应用与预防佐剂型关节炎患足照片图l模型组，2干预组，3正常对照组。图6:化合物7应用与预防佐剂型关节炎评分图薩模型组，參干预组。图7:化合物9应用于肝癌小鼠模型的治疗肿瘤实物图l模型组，2MTX治疗组，3化合物9治疗组图8:化合物12应用于肝癌小鼠模型的治疗肿瘤瘤重图l模型组，2MTX治疗组，3化合物12治疗组。图9:化合物18应用于肺癌小鼠模型的治疗肿瘤实物图l模型组，2MTX治疗组，3化合物18治疗组。图10:化合物22应用于肺癌小鼠模型的治疗肿瘤抑瘤效果图1MTX治疗组，2化合物22治疗组。图11:化合物24应用于纤维肉瘤小鼠模型的治疗肿瘤实物图1模型组，2MTX治疗组，3化合物24治疗组。图12:化合物25应用于纤维肉瘤小鼠模型的治疗抑瘤曲线争模型组，A化合物25治疗组，圏MTX治疗组。图13:化合物26应用于纤维肉瘤肺转移小鼠模型的治疗肺实物图l化合物26治疗组，2模型组，3正常组，4MTX治疗组。图14:化合物29应用于纤维肉瘤肺转移小鼠模型小鼠生存曲线图翻模型组，參MTX治疗组，A化合物治疗组。五具体实施例方式本发明具体涉及聚阳离子化合物应用于治疗血管生成相关疾病，在具体实施过程中，主要涉及高效聚阳离子化合物的筛选，及将高效聚阳离子化合物应用于治疗血管生成相关疾病，如肿瘤(包括肝癌、肺癌、纤维肉瘤)、类风湿性关节炎等疾病。1.聚阳离子化合物库的准备1.1经糖胺衍生物缩合制备多糖胺将单糖胺类衍生物按文献报道方法縮合制得多糖胺，控制反应条件和反应时间，控制产生多糖胺的大小及支链。以化合物l为例，将商业购置2，3-二乙酰氧基-6-二氨基乙氧基-l，4内醚-e-D-阿洛糖溶于双蒸水中配得2.5%-12.5%的溶液，加入Lewis酸作为催化剂，如PF3或BF3.Et2O0.1。/。-0.5Q/。反应24小时，透析纯化冻干即得本品粉末备用。1.2经多糖修饰制备多糖胺将多糖按文献报道方法与多胺类化合物縮合制得多糖胺，以葡聚糖为例，将0.5g葡聚糖溶于25ml无水二甲亚砜(DMSO)，用约0.11.5gN，N-羰基二咪唑与多胺基衍生物如乙二胺，精胺等缩合后透析即得葡聚糖胺类衍生物。或者将0.5g葡聚糖溶于25mlPPBS缓冲液中，加入高碘酸钾(KI04)0.01-l.Og氧化后糖醛后多胺基衍生物如乙二胺，精胺等经希夫碱反应缩合得到葡聚糖胺类衍生物。1.3经氨基酸衍生物縮合制备聚阳离子衍生物—将商业购得氨基酸衍生物用多肽合成仪经挂接，去保护，中和，縮合等步骤合成聚阳离子多肽，然后经断裂与去保护释放，透析纯化冻干即得聚阳离子多肽。1.4经蛋白质修饰制备其阳离子化衍生物将商业购买蛋白质用縮合剂与多胺类衍生物縮合，形成阳离子化的蛋白质。以明胶为例，明胶溶于PPBS，制成2%的明胶溶液，加入縮合剂如EDC，或是DCC，以及多胺基衍生物如乙二胺、精胺，调节反应体系pH至5以下，反应24小时，透析即得阳离子化明胶。2.聚阳离子化合物应用脾细胞悬液进行活性筛选在无菌条件下分离小鼠脾脏，用手术刀将脾脏切lmn^左右小块，然后用一次性注射器内芯研磨，过80目筛网，1000卬m/min离心，红细胞裂解液裂解红细胞，1000rpm/min离心，最后用含10%小牛血清1640细胞培养液悬浮脾细胞，调节细胞密度成106/ml备用。将上述聚阳离子化合物用生理盐水配成10mg/ml聚阳离子化合物储液备用。以普通葡聚糖或白蛋白为阴性对照，每105细胞中加入10ng聚阳离子化合物，37'C，5。/。C02条件下培养24小时。然后离心细胞，收集上清液，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定上清液中白细胞介素-12(IL-12)的浓度，筛选合适的化合物，结果如图l所示，聚阳离子化合物都具有有效剌激脾细胞分泌IL-12的能力，强弱不等。3.聚阳离子化合物体内药效评估将上述聚阳离子化合物的储液稀释以750ug/kg的剂量经腹腔注射ICR小鼠，8小时后测定小鼠血清中白细胞介素-12(IL-12)水平。同样。以普通葡聚糖或白蛋白为阴性对照。结果如图2所示，聚阳离子化合物都具有刺激机体白细胞介素-12上升的能力，强弱不等。4.应用聚阳离子化合物治疗佐剂型关节炎按文献报道方法建立大鼠佐剂性关节炎模型，即完全弗氏佐剂0.lml于SD11大鼠右足跖部皮下注射，2-3周后建成佐剂型关节炎模型。建模成功后，将关节炎大鼠随机分成2组即治疗组和对照组，分别给予相应处理即治疗组400ug/kg的化合物2和5治疗，对照组400ug/kg生理盐水治疗。每天给药一次，并测量右足厚度，并作疾病严重程度评分，评分标准为各关节病变按04共五级评分法0级无红肿；l级关节稍红肿；2级关节轻度红、肿、热；3级关节中度红、—肿、热、轻度功能障碍；4级关节重度红、肿、热、严重功能障碍。关节炎分数(AS)为每只鼠各关节病变分数的总和。如图3和图4所示，治疗剂量的化合物2或5都能明显抑制疾病发展，有效控制疾病症状。5.应用聚阳离子化合物预防佐剂型关节炎将化合物7和27用生理盐水溶解，配得1.0mg/ml储液备用。按文献报道方法建立大鼠佐剂性关节炎模型，即完全弗氏佐剂0.lnil于SD大鼠右足跖部皮下注射，并于建模当日，将大鼠随机分成2组即干预组和对照组，分别给予干预组250mg/kg化合物7或27治疗，对照组250ul/kg生理盐水治疗。每天给药一次，并测量右足厚度，并作疾病严重程度评分，评分标准为同实例3。如图5和图6所示，经化合物7和27干预治疗，关节炎症状明显减轻，绝大部分部分大鼠未能正常发病，说明聚阳离子化合物不仅能有效治疗类风湿性关节炎，并能有效阻断发病，即聚阳离子化合物能够阻断类风湿性关节炎的发生发展。6.应用聚阳离子化合物治疗;肝癌小鼠模型将小鼠肝癌H22细胞以2.4><106个/只接种到18—22克ICR小鼠腋窝皮下，并随机分为三组即阳离子化葡聚糖治疗组，甲氨蝶呤治疗组，阴性对照组。植瘤当日即给予化合物9或12治疗组600ug/kg阳离子化葡聚糖腹腔注射治疗，甲氨蝶呤治疗组40mg/kg甲氨蝶呤腹腔注射治疗，阴性对照组600ug/kg普通葡聚糖生理盐水注射。每天称量老鼠体重，测量肿瘤直径，并于植瘤两周后处死小鼠，钝性分离出肿瘤组织，称重拍照，固定用作病理切片及免疫组化。如图7和图8所示，经化合物9或12治疗，肿瘤生长明显受到抑制，并且效果要稍好于传统药物甲氨蝶呤。可见，聚阳离子化合物能够明显抑制肝肿瘤的生长。7.应用聚阳离子化合物治疗肺癌小鼠模型将小鼠Lewis肺癌细胞LLC细胞以2.4"06个/只接种到18—22克ICR小鼠腋窝皮下，并随机分为三组即化合物18或22治疗组，甲氨蝶呤治疗组，阴性对照组。植瘤后当日即给予治疗组100mg/kg化合物18或22腹腔注射治疗，甲氨蝶呤治疗组40mg/kg甲氨蝶呤腹腔注射治疗，阴性对照组为100mg/ml生理盐水注射。每天称量老鼠体重，测量肿瘤直径，并于植瘤两周后处死小鼠，钝性分离出肿瘤组织，称重拍照，固定用作病理切片及免疫组化。如图9和图10所示，经化合物18或22治疗，肿瘤生长明显受到抑制。虽然抑制效果不如甲氨蝶呤，但也达到46%左右的抑制率。8.应用聚阳离子化合物治疗纤维肉瘤小鼠模型将小鼠肉瘤Sarcoma180细胞以2.4><106个/只接种到18—22克ICR小鼠腋窝皮下，并随机分为三组即化合物24或25治疗组，甲氨蝶呤治疗组，阴性对照组。植瘤后当日即给予治疗组250ug/kg化合物24或25腹腔注射治疗，甲氨蝶呤治疗组40mg/kg甲氨蝶呤腹腔注射治疗，阴性对照组为250ug/ml生理盐zK注射。每天称量老鼠体重，测量肿瘤直径，并于植瘤两周后处死小鼠，钝性分离出肿瘤组织，称重拍照，固定用作病理切片及免疫组化。如图11和图12所示，经化合物24或25治疗，肿瘤生长明显受到抑制，而且效果明显优于甲氨蝶呤。9.应用聚阳离子化合物治疗纤维肉瘤肺转移小鼠模型将小鼠肉瘤Sarcoma180细胞以2.4><106个/只经尾静脉接种到18—22克ICR小鼠，并随机分为三组即化合物26或29治疗组，甲氨蝶呤治疗组，阴性对照组。植瘤后当R即给予治疗组250ug/kg化合物26或29腹腔注射治疗，甲氨蝶呤治疗组40mg/kg甲氨蝶呤腹腔注射治疗，阴性对照组为250ug/ml生理盐水注射。每天称量老鼠体重，测量肿瘤直径，并于植瘤两周后处死小鼠，钝性分离出肿瘤组织，称重拍照，固定用作病理切片及免疫组化。如图13所示，阴性对照组满肺组织布满大小不等的肿瘤小结，基本丧失了肺的原有组织结构，而化合物26治疗组为典型的转移性肺癌，主要集中分布在肺组织周围，甲氨蝶呤治疗组肿瘤小结除出现在肺周围外，在中央位置腋偶见肿瘤小结。可见，化合物26治疗能够明显控制肿瘤的转移。如图14所示，化合物29能够明显提高纤维肉瘤转移小鼠的生存率。总之，化合物26或29能够有效抑制肿瘤的生长与转移，并能提高肿瘤小鼠的生存率。权利要求1.聚阳离子化合物在制备抑制血管生成，治疗血管生成相关疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述聚阳离子化合物，其特征是聚阳离子化合物为氨基化修饰多糖，氨基化修饰多肽，氨基化修饰蛋白或其它形式的多聚氨基化合物，聚合物为直链聚合物，支^l聚合物或环状聚合物，聚合物的单体分子为相同分子或不同分子。3.根据权利要求2所述聚阳离子化合物，其特征是聚阳离子化合物的氨基为伯氨基，仲氨基或叔氨基，氨基化形式为单氨基化或多氨基化，连接方式和数量不受限制。4.根据权利要求2所述聚阳离子化合物，其特征是聚阳离子化合物的氨基在水溶液中质子化而带正电荷。5.根据权利要求2所述聚阳离子化合物，其特征是聚阳离子化合物的分子量为360道尔顿到280万道尔顿。6.根据权利要求1所述聚阳离子化合物作为药物成分治疗血管生成相关疾病，其特征是阳离子聚合物作为药物成分刺激机体免疫细胞表达分泌白介素12。7.根据权利要求6所述聚阳离子化合物作为药物成分治疗血管生成相关疾病，其特征是药物刺激机体免疫系统细胞产生白介素12，细胞类型不受限制。8.根据权利要求6所述聚阳离子化合物作为药物成分治疗血管生成相关疾病，其特征是给药方式不受限制。全文摘要本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及聚阳离子化合物应用于治疗血管生成相关性疾病。所述聚阳离子化合物在体外和体内都能有效提高白细胞介素-12及其下游细胞因子干扰素-γ的表达水平，调节机体免疫，从而从多个环节抑制新生血管生成，阻断血管生成相关疾病的进展，可用于治疗血管生成相关疾病。所述聚阳离子化合物在肿瘤和类风湿性关节炎动物模型中均取得很好的疗效，具有广阔的应用前景。文档编号A61K38/38GK101559072SQ200910032839公开日2009年10月21日申请日期2009年6月4日优先权日2009年6月4日发明者夏苏华,张峻峰,磊董申请人:南京大学