专利名称：基于aff-4表达筛选抗白发剂的方法
基于AFF-4表达筛选抗白发剂的方法技术领域
本发明提供了使用AFF-4作为指示物的筛选抗白发剂的组合物和方法，以及通过 i亥Afeffife的白胃齐U (anti-graying agents)。
背景技术：
决定毛发颜色的黑色素，是在存在于毛球上部的黑素细胞(合成黑色素的细胞) 内的黑素体中从酪氨酸生物合成之后供应给毛发的。尽管认为白发与因素(例如衰老或压力)造成的下列方面有关黑素细胞或黑素体的减少、由上述这些细胞或器官的异常而引起酪氨酸酶的量或活性的降低、或黑素体转运的损伤，还不清楚其中全部的机制。
先前已经报道了很多物质具有抗白发作用例如防止白发生成(graying)或抑制白发生成，并且例如，尽管在秦椒(Zanthoxylum piperitum)提取物中报道了这类抗白发作用(参见日本未审查专利公开号H11-5720)，有丰富具有相等或更高的抗白发作用的活性成分的需要。
已知在色素细胞中在以Foxnl形式的转录因子活化后色素形成加速(参见 flfeiner，等人，(2007) Cell, 130 :932_942，专用上皮受体细胞确定色素形成模式(Dedicated Epithelial Recipient Cells Determine Pigmentation Patterns))。Foxnl 是存在于上皮细胞中控制bFGF表达的转录因子。发明内容
本发明的目标是阐明在滤泡色素细胞中色素形成的机制，并提供一种或多种现有技术未发现的有效的抗白发剂以及含有其的抗白发组合物。
本发明的发明人发现存在于滤泡上皮细胞中的AFF-4分子与R)xnl结合并促进其转录活性，并且在人类中AFF-4在表皮中不存在而仅在毛囊的上皮细胞中表达。而且，在人白发中发现AFF-4、FoXnl和bFGF都明确地降低。基于这些结果，首次显示了通过AFF-4介导，物质能够只作用于存在于毛囊中的色素细胞。
为了发现其实施方案，使用人毛囊的上皮细胞搜索能够诱导AFF-4表达的物质。 结果发现，灵芝(Ganoderma lucidum (Fr.) Karst)提取物、人参(Panax schinseng Nees) 提取物、稻(Oryza sativa)糠提取物、毛叶香茶菜(Rabdosia japonicus)提取物和秦椒 (Zanthoxylum piperitum)提取物加速AFF-4表达。而且，在人滤泡上皮细胞中已经证实了灵芝提取物和秦椒提取物的bFGF表达加速作用。相应地，在人滤泡上皮细胞中已经证实了支持从AFF-4到R)xnl然后到bFGF的信号传递的假说。当在人表皮细胞中尝试验证灵芝提取物和秦椒提取物的bFGF表达加速作用时，在相同的细胞中对于任何受测试的物质未观察到bFGF表达加速作用，从而说明在人滤泡上皮细胞中的AFF-4表达加速和bFGF表达加速是这些细胞特有的现象。
基于以上所述，借助于相邻的滤泡上皮细胞，使用前述物质特定地激活滤泡色素细胞是可能的。
因此，在其第一个方面，本发明提供了筛选抗白发剂的方法。通过对细胞施用候选物质并且评估AFF-4在细胞中的表达，使用此筛选方法以选择和/或鉴定加速AFF-4在细胞中表达的物质。在某些实施方案中，细胞是滤泡上皮细胞。在其一些实施方案中，通过测量自细胞提取的编码AFF-4的mRNA的量评估在细胞中AFF-4表达的加速，通过例如PCR和实时PCR。在其第二个方面，本发明提供用前述筛选方法筛选的物质，并且更特别地，提供含有至少一种类型的对加速AFF-4在细胞中(例如，在滤泡上皮细胞中)的表达有效的量的草本植物提取物的抗白发剂，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物。在其第三个方面，本发明提供使用以前述筛选方法选择的物质加速AFF-4在细胞中(例如，在滤泡上皮细胞中)表达的方法，并且更特别地，使用至少一种类型选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物和秦椒提取物的草本植物提取物。在其第四个方面，本发明提供防止或抑制白发的方法，所述方法包括通过将以前述筛选方法选择的物质，并且更特别地，至少一种类型的草本植物提取物，以对加速AFF-4 在细胞中(例如，在滤泡上皮细胞中)的表达有效的量，涂覆在头皮上加速AFF-4的表达， 所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物、毛叶香茶菜提取物和秦椒提取物。在其第五个方面，本发明提供至少一种类型的以对加速AFF-4在细胞中表达有效的量的草本植物提取物在制备防止或抑制白发的药物组合物或化妆品组合物中的用途，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物、毛叶香茶菜提取物和秦椒提取物。在其第六个方面，本发明提供用于加速AFF-4在细胞中(例如，在滤泡上皮细胞中)表达的组合物，包含用前述筛选方法选择的物质，并且更特别地，包含至少一种类型的选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物、毛叶香茶菜提取物和秦椒提取物的草本植物提取物。组合物可以是药物组合物或化妆品组合物。在其第七个方面，本发明提供防止或抑制白发的组合物，所述组合物以对加速 AFF-4在细胞中(例如，在滤泡上皮细胞中)的表达有效的量包含用前述筛选方法选择的物质，并且更特别地，至少一种类型的草本植物提取物，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物、毛叶香茶菜提取物和秦椒提取物。组合物可以是药物或化妆品组合物。根据本发明，能够通过筛选鉴定新的抗白发剂，并且能够提供这样的抗白发剂，其比现有技术的那些明显更有利。附图简述
图1显示了 AFF-4的R)xnl转录活性促进作用。图2显示了 AFF-4与R)xnl的结合。图3显示了 Foxn 1、AFF-I、AFF-2和AFF-4在人生长期毛囊中的表达。图4显示了由免疫染色和原位杂交测定的R)xnl和AFF-4在人生长期毛囊中的表达。图5显示了 R)xnl、AFF-I、AFF-2和AFF-4在人生长期毛囊中的表达程度的比较。
图6显示了人黑发和人白发之间R)xnl、AFF-4和bFGF的表达水平的比较。
图7显示了经一段时间研究的通过人ORS灵芝提取物对AFF-4表达的作用。
图8显示了经一段时间研究的通过人ORS秦椒提取物对AFF-4表达上的作用。
图9显示了通过人ORS人参提取物对AFF-4表达的作用。
图10显示了通过人ORS稻糠提取物对AFF-4表达的作用。
图11显示了通过人ORS毛叶香茶菜提取物对AFF-4表达的作用。
图12显示了通过人ORS灵芝提取物对bFGF表达的作用。
图13显示了通过人ORS秦椒提取物对bFGF表达的作用。
图14显示了灵芝提取物和秦椒提取物在人表皮细胞(HaCaT)中对bFGF表达的作用。
实施发明的最佳方式
如上所述，本发明部分地基于申请人在滤泡色素细胞中基因表达的研究。相应地， 本发明以组合物表征，所述组合物包括本文描述的提取物，能够使用所述提取物以用于在毛发中维持或生产色素。本发明内的其他组合物包括能够用来检测AFF-4基因表达的核酸引物和探针、报告构建体(例如，与编码可被容易检测的蛋白质(例如荧光蛋白)或酶的序列有效相连的AFF-4调控序列)、细胞、细胞阵列、或组织外植体，包括上皮滤泡细胞或被改造以包含AFF-4报告构建体的细胞。本发明还提供了包括一个或多个这些组合物的试剂品.ο
本文描述的或通过本筛选方法发现的抗白发剂可为通过作用于内源AFF-4基因来提高转录发生的速度和/或提高获得的mRNA的量“加速”AFF-4表达的活性剂。然而，本发明不限于通过任何特定的机制影响AFF-4表达的活性剂。例如，也能够设置筛选方法以鉴定提高AFF-4蛋白质的量和/或该蛋白质的活性的抗白发剂。在本方法背景下能够使用任何本领域已知的用于分析RNA或蛋白质表达的方法，不管表达是内源性基因的表达还是报告基因构建体的表达。
能够体外或在基于细胞的筛选测定法中实施AFF-4表达分析。例如，能够排列滤泡上皮细胞，并且能够将在阵列中的群体与一个或多个候选抗白发剂接触。更特别地，用于鉴定抗白发剂的本方法能够包括下列步骤用测试物质或候选活性剂与细胞(例如，滤上皮细胞)接触；测量或另外分析AFF-4在细胞中的表达；以及测定相对于对照(例如，相对于未暴露于测试物质的细胞中的表达水平)，测试物质或候选活性剂是否提高AFF-4的表达。细胞能够在组织培养物中维持或能够为体内的细胞。备选地，或此外，能够评估测试物质或候选活性剂在毛发中维持或提高色素形成的能力。
抗白发剂可以是编码AFF-4的核酸。
AFF-4 禾口 Foxnl
AFF是属于AF4/FMR2家族的核蛋白，并且尽管认为它们是核内转录的活化因子， 未完全了解其细节(Berton，等人(1996) Nutr. Cancer 26 =353-363) 在人中已知四类 AFF,被称为 hAFF-1 (GenBank NM)_005935)、hAFF_2 (GenBank NM_002025)、hAFF_3 (GenBank NM_002285)和hAFF_4 (GenBank NM_014423)，并且已经报道了它们的基因。相信AFF-3在中枢神经系统中表达。
也认为Foxnl是作用为转录因子的核蛋白。以前称之为Whn，并且发现它作为裸鼠的病原基因。已知Foxnl在毛干形成中起重要作用，并且提出Foxnl涉及毛发形成 (Brissette，等人(1996) Genes Dev. 10 :2212-2221)。在此专利中，明确地测定了 Foxnl 不仅涉及毛发形成，也涉及AFF4介导的毛发色素形成。抗白发剂筛诜方法本发明提供了用于筛选抗白发剂的方法。此方法包括评估候选物质加速AFF-4的表达和/或活性的能力，以及随后选择具有此类能力的候选物质作为抗白发剂。更特别地，此筛选方法包括对细胞施用候选物质、评估在细胞中AFF-4的表达，以及选择加速AFF-4在细胞中表达的那些物质。在某些实施方案中，细胞是滤泡上皮细胞。细胞可为人源或非人源，所述细胞的实例包括多种哺乳动物(例如大鼠、小鼠或兔)的细胞。本文描述的在筛选方法中待测试的候选物包括有机源的粗制或纯化的提取物 (例如，动物或草本植物提取物)，以及部分或全部纯化的或合成的活性剂，例如，小分子、 多肽、脂类和/或核酸，和任何上述物质的库。例如，还能够通过从皮肤细胞提取总RNA并测量编码该生理活性的物质的mRNA的量，测定前述生理活性的物质在皮肤中的表达。mRNA的提取及其量的测量为本领域所公知， 并且例如，通过定量聚合酶链式反应(PCR)方法实施RNA定量。此外，由于编码人AFF-4的基因的核苷酸序列已知，基于该核苷酸信息，本领域普通技术人员能够合适地选择适合于扩增每一基因的引物。尽管在本发明的实例中分别地使用对AFF-4的实时PCR扩增合适的引物，扩增引物并不受其限制。此外，也能够通过直接测量在细胞中生理活性的物质的量测定前述生理活性的物质的表达。能够使用多种方法实施此测量，其实例包括使用生理活性的物质的特异性的抗体的本领域所公知的方法，使用荧光物质、色素或酶的免疫染色方法，Western印迹法和例如ELISA或RIA的免疫测定法。本发明提供了抗白发剂，其含有用前述筛选方法选择的物质，并且更特别地，含有至少一种类型的草本植物提取物，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物。本发明中使用的草本植物提取物指通过压碎草本植物随后通过用在正常温度或加热下的溶剂提取，或者使用提取器例如Soxhlet提取器提取而获得的多种类型的溶剂提取物、其稀释的溶液、其浓缩物或其干粉。如之前所描述的，尽管作为本发明的抗白发剂的活性成分，能够以提取溶液的形式，直接使用根据前述提取方法获得的草本植物提取物，也能够在稀释、浓缩或冷冻干燥后以粉末或糊状形式制备之后使用提取物。此外，使用技术例如液-液分配也能够从提取物中移除失活的污染物，并且此类提取物的使用是在本发明中预期的。由于每一前述的草本植物提取物是如前所描述的，能够根据常规方法获取它们， 并且例如通过用提取溶剂浸没或热回流以及之后通过过滤和浓缩，使用前述技术或仪器能够获得它们。在那时能够使用任何任意提取溶剂，只要其常规地用来提取草本植物。此类溶剂的实例包括水、醇(例如甲醇、乙醇、丙二醇、1，3_ 丁二醇或甘油)、含水醇和有机溶剂(例如氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯或己烷)，并且这些能够单独或组合使用。在使用吸附方法(例如离子交换树脂)从浓缩的提取物中移除杂质之后，或在用多孔聚合物柱(例如Amberlite XAD-2)吸附后用甲醇或乙醇洗脱浓缩后，照原样使用通过用前述溶剂提取获得的提取物。此外，也能够使用这样的提取物，所述提取物是使用分配方法用水/乙酸乙酯提取的。以下述形式应用本发明的抗白发剂，例如水溶液、油状液、其他类型溶液、乳状液、乳膏剂、凝胶剂、混悬剂、微囊剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或固体制品。在使用现有技术已知方法制备了以这些形式的本发明的抗白发剂之后，能够将抗白发剂以下述形式涂覆 (coating)、黏着、喷雾、注射或插入到机体中，例如洗剂制品、乳状液制品、乳膏剂制品、软膏剂制品、硬膏剂制品、泥罨剂制品、气雾剂制品、水-油双层制品、水-油-粉三层制品或注射制品。对抗白发剂中的前述的提取物没有特别的限制，并且基于抗白发剂的总重量，在干重方面，其量为，例如，以重量计0. 000001至5%，例如，以重量计0. 00001至3%或以重量计 0. 00001 至 1%。在这些药物形式中，预期外部应用的皮肤制品(例如洗剂制品、乳状洗剂制品、乳膏剂制品、软膏剂制品、硬膏剂制品、泥罨剂制品和气雾剂制品)用于本发明目的的药物形式。此外，此处所指的外部应用的皮肤制品包括处方药物、非处方药物和化妆品。本发明的抗白发剂合适地掺入对应于预期的药物形式的已知的载体和芳香剂等， 以及，例如，油、表面活性剂、防腐剂、金属离子螯合剂、水溶性聚合物、增稠剂、色素和其他粉末组分、紫外线保护剂、增湿剂、抗氧化剂、PH调节剂、清洁剂、干燥剂或乳剂。此外，在不削减其预期的效果的范围内也能够在本发明的抗白发剂中掺入其他药用活性的成分。此外，本发明提供了使用以前述筛选方法筛选的物质，并且更特别地，至少一种类型选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物的草本植物提取物加速 AFF-4在细胞(例如，滤泡上皮细胞)中表达的方法。在某些实施方案中，本发明提供了加速AFF-4表达的防止白发生成的方法，所述方法通过将对加速AFF-4在细胞(例如，滤泡上皮细胞)中表达有效的量的至少一种类型的草本植物提取物涂覆在头皮上，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物。靶皮肤细胞可以是位于毛囊位点的细胞，例如头皮的滤泡上皮细胞。下文通过其具体的实例提供了本发明的更详细解释。此外，本发明不局限于这些实例。
实施例实施例1方法制备总共三种类型的载体，S卩，AFF-4表达载体，其中具有置于5’上游区域的 C-Myc标签的AFF-4cDNA与来自CMV启动子的下游连接；Foxnl表达载体，其中具有置于5’ 上游区域的Flag标签的R)XnlcDNA与来自CMV启动子的下游连接；和萤光素酶载体，所述载体在SV40最小启动子区域的5’上游区域具有R)xnl结合区域和在该启动子的3’下游区域具有萤光素酶基因。在出生1至2天之后培养根据常规方法收获的小鼠表皮细胞。制备小鼠表皮细胞， 其中R)Xnl表达载体和萤光素酶载体插入于细胞中(细胞1)。此外，制备小鼠表皮细胞，其中前述的AFF-4表达载体和萤光素酶载体插入于细胞中(细胞2)。此外，也制备小鼠细胞，其中全部三种类型的载体(Foxnl表达载体、AFF-4表达载体和萤光素酶载体)插入于小鼠表皮细胞中(细胞幻。在对照实验中使用细胞1以使得能够评估i^oxnl对R)xnl的转录活性的作用，所述作用能够使用萤光素酶的表达水平作为指示物来评估。细胞2使得能够评估AFF-4对R)xnl转录活性的两种作用。此外，细胞3使得能够评估R)xnl和AFF-4都存在时对R)Xnl转录活性的作用。另外，用发光计测量荧光素酶的表达水平。
结果
在图1中显示了结果。在只有R)xnl的情况下(细胞1)，荧光素酶的表达水平给定为值“1”(在图1中用带点的线说明)。当在R)Xnl存在时还表达AFF-4时(细胞3)，荧光素酶的表达水平增加了约5倍。然而，在只表达AFF-4的情况中(细胞幻，荧光素酶的表达水平降低至约五分之一。因此，确认AFF-4具有促进R)xnl的转录活性的功能。
实施例2
方法
培养从1-2天龄的小鼠收获的小鼠表皮细胞，随后制备插入有R)Xnl表达载体的小鼠表皮细胞(Ad-Foxnl细胞)和用仅有Flag标签但不含有R)xnl的腺病毒载体感染的小鼠表皮细胞(Ad细胞)，所述R)xnl表达载体中R)XnlcDNA与来自实施例1中制备的CMV 启动子的下游连接，在所述cDNA中Flag标签置于5’上游区域。分别培养两种细胞以根据常规方法获取细胞勻浆。使用抗Flag抗体对细胞勻浆进行免疫沉淀处理，并且在SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中对获得的免疫沉淀处理的液体进行蛋白质电泳。在电泳之后，把蛋白质转移到PVDF膜上，随后为用抗-AFF-4抗体的Wfestern印迹法。
结果
在图2中显示了结果。对通过免疫沉淀获得的在细胞勻浆中具有Flag蛋白质的 Foxnl进行SDS-PAGE，随后用抗-AFF-4抗体进行^festern印迹法。结果，仅从Ad-Foxnl细胞获得了信号。这意味着当与i^oxnl结合时AFF-4免疫沉淀。这些结果说明在细胞中AFF-4 % Foxnl 结合。
实施例3
方法
通过提取人毛发获得如图3(A)所示的生长期的毛囊。通过提取获得的生长期毛囊由包含滤泡上皮的部分组成，所述滤泡上皮几乎不含有任何毛乳头细胞。把30个提取的毛囊放入Trizol 核酸制备溶液(Irwitrogen)中并用混勻器混勻，同时用冰冷却来根据常规方法制备总RNA。用superscript 反转录酶(Invitrogen)使用制备的总RNA作为模板实施反转录反应来制备cDNA，随后根据常规方法实施PCR。使用Taq聚合酶(Takara) 和以下表1中显示的引物实施PCR。在表1中显示了用于PCR的引物的核苷酸序列。PCR实施总共30个循环，单一循环由94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分钟组成。使用甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为阳性对照。
表权利要求
1.筛选抗白发剂的方法，所述方法包括通过对细胞应用候选物质选择加速AFF-4在细胞中表达的物质。
2.根据权利要求1的方法，其中细胞为滤泡上皮细胞。
3.根据权利要求1或2的方法，其中从细胞提取的编码AFF-4的mRNA的量由PCR测量。
4.含有对加速AFF-4表达有效的量的至少一种类型的草本植物提取物的抗白发剂，所述草本植物提取物选自灵芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst.)提取物、人参 (Panax schinseng Nees)提取物、稻(Oryza sativa)糠提取物和毛叶香茶菜(Rabdosia japonicus)提取物。
5.使用至少一种类型的选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物的草本植物提取物加速AFF-4表达的方法。
6.防止或抑制白发的方法，所述方法包括通过把对于加速AFF-4的表达有效的量的至少一种草本植物提取物涂敷在头皮上加速AFF-4的表达，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物。
7.选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物的草本植物提取物在制备防止或抑制白发的组合物中的用途。
8.筛选抗白发剂的方法，所述方法包括用测试物质接触细胞；测量AFF-4在细胞中的表达；和如果与缺乏该测试物质时AFF-4的表达相比，所述测试物质提高了 AFF-4在细胞中的表达，选择其作为候选抗白发剂。
9.根据权利要求8的方法，其中细胞为滤泡上皮细胞。
10.根据权利要求1或2的方法，其中测量AFF-4在细胞中的表达包括通过PCR测量 AFF-4mRNA 表达。
11.加速AFF-4表达的组合物，所述组合物包含至少一种类型的选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物的草本植物提取物。
12.防止或抑制白发的组合物，所述组合物包含对于加速AFF-4的表达有效的量的至少一种类型的选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物的草本植物提取物。
全文摘要
本发明的目的是提供抗白发剂。本发明提供筛选抗白发剂的方法，由此通过体外对细胞应用候选物质选择加速AFF-4在细胞中表达的物质；和含有对于加速AFF-4的表达有效的量的至少一种类型的用这种方法选择的草本植物提取物的抗白发剂，所述草本植物提取物选自灵芝提取物、人参提取物、稻糠提取物和毛叶香茶菜提取物。
文档编号A61K36/074GK102498221SQ201080037668
公开日2012年6月13日 申请日期2010年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者J·L·布里塞特, L·维纳, 岩渊德郎, 李健, 武田俊祐 申请人:株式会社资生堂, 综合医院公司