专利名称：一种瘦素的凝胶缓释系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的凝胶缓释系统。具体而言，本发明公开了瘦素的壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统的制备方法及其应用。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)是一种甲壳素的脱乙酰衍生物，是自然界大量存在的碱性多糖，生物毒性小，具有良好的组织相容性、生物可降解性和黏附性，在医学、生物学领域得到了深入的研究和广泛的应用[Shi X W, Du Y M, Sun L P, et al. Macromolecular Bioscience，2005，5 :881889]。壳聚糖也是一种理想的医用植入材料[Khor E, Lim L Y. Biomaterials, 2003，24 :23392349]。但在一般情况下，壳聚糖只溶于酸性水溶液中，在中性或碱性溶液中可形成类似凝胶的沉淀，且该过程与温度关系不大。但近年来研究发现， 通过加入碱性盐、含羟基聚合物或对壳聚糖进行衍生化和接枝反应，可得到具有温度敏感性的壳聚糖基物理凝胶。溶液在生理PH(7.0)及室温下保持溶液状态，而在温度升至体温 (37 0C )时迅速凝胶化。单甲氧基聚乙二醇(Methoxy Polyethylene Glycol，mPEG)具有良好的水溶性、润湿性、润滑性、生理惰性，对人体无刺激、温和，在化妆品和制药工业中应用广泛，分子量为 2KD。在壳聚糖的酸溶液中加入适量的单甲氧基聚乙二醇不会立刻中和壳聚糖的质子而使壳聚糖沉淀下来，可使壳聚糖溶液的PH值升至生理范围即pH7. O左右。在低温条件下，壳聚糖与水的作用阻止了壳聚糖链的聚集；温度升高时，单甲氧基聚乙二醇与水的结构化作用(该作用能减弱壳聚糖与水的作用)加强，使壳聚糖链脱水，水分子的区域被聚乙二醇的羟基集团取代，壳聚糖链聚集。壳聚糖和PEG的生物活性和生物相容性已经非常明确，在给药系统方面有重要的应用，已有很多工作将壳聚糖和PEG结合作为药物的载体。Bhattarai等[Bhattarai N， Ramay H R, Gunn J, et al. Journal of Controlled Release, 2005,103 :609 624]以这两种材料结合制备的原位凝胶材料，以BSA作为模型药物对这一凝胶的体外释放功能进行考察，药物释放达40天以上，并且释放过程中BSA的结构未见改变。1994 ^,RockefellerZhang ^A [Zhang, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and it' s human homologue. Nature, 1994, 372 :425 426]利用分子生物学方法成功克隆了小鼠和人的肥胖基因。该基因主要在白色脂肪细胞中表达， 产物是一种由167个氨基酸残基组成、分子量16000道尔顿的蛋白质激素。因该物质能使动物变瘦，故被命名为“瘦素(L印tin)”。“L印tin”源于希腊字“L印tos”意为“瘦”。肥胖型(ob/ob)小鼠由于其ob基因在第105位发生由C —T的突变，使该位点的精氨酸密码子 CGA转变为终止密码子TGA。这种突变，使ob基因表达产物活性丧失，即没有了瘦素分泌， 所以表现为肥胖。血液循环中的瘦素为146个氨基酸的多肽类激素，其活性部位含146个氨基酸残基，相对分子质量为16KD，亲水性强，以单体形式存在于血浆中。与其他激素的分泌相似，瘦素的分泌也呈脉冲式。瘦素mRNA表达呈日周期变化，夜间表达量最高，半衰期为 9. 4士3. Omin其分泌具有一定的节律性。瘦素是一种多靶器官、功能广泛的蛋白激素，其主要生理功能包括抑制摄食、增加能量消耗；调节生长发育；促上皮细胞、血管生长；影响骨
重建等。瘦素具有降低动物食欲、提高能量代谢效率、增加能耗、减少脂储，减轻体重等作用。Haalas 等人[Haalas, et al. Weight-reduction effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science, 1995，269 :543 546]给 ob/ob 小鼠注射基因重组瘦素，其体重显著下降。每天给小鼠腹腔注射瘦素，4d后ob/ob小鼠的采食量较对照组下降 60%，4星期后体重下降达40%。同时，小鼠的活动量增加、代谢加强、血浆胰岛素和血糖水平降低。Khalid 等人[Khalid, et al. Leptin treatment rescues t he sterility of genetically chese ob/ob males. Endocrinology，1997，138 :1190 1193] 艮道，ob/ob 小鼠除了过度肥胖外，还有一个显著特征，即生殖器官萎缩和终生不育。注射外源性瘦素，可使大鼠的初情期提前，表明瘦素对动物的初情期启动有重要作用。瘦素可刺激大鼠骨髓干细胞增殖，与粒细胞刺激因子协同刺激造血细胞的增殖。 另外瘦素与血管内皮生长因子以及成纤维细胞生长因子等血管生成因子协同作用促进血管生成。瘦素可显著提高骨保护蛋白(OPG)mRNA的水平及其蛋白质的分泌，降低细胞核因子KB受体活化因子配基(RANKL)mRNA的水平，从而抑制破骨细胞的活化、成熟，提示瘦素可调节大鼠的骨重建，有利于骨形成，防止去卵巢引起的骨丢失。为提高瘦素在体内的半衰期，本发明根据壳聚糖和单甲氧基聚乙二醇的理化性质，优化了以往制备壳聚糖和单甲氧基聚乙二醇水凝胶系统的条件，成功制备了瘦素的高性能的缓释给药系统。
发明内容
本发明公开了一种瘦素的凝胶给药系统，含有浓度为10_5-10_4M的瘦素、重量百分比3.0% -3. 5%的壳聚糖、3.0% -3. 5%单甲氧基聚乙二醇以及0.01% -0. 胶原蛋白。本发明确定了壳聚糖和单甲氧基聚乙二醇混合比例，即为按照重量比的 3% -3. 5%的壳聚糖、3. 0% -4. 5%的单甲氧基聚乙二醇。本发明还公开了一种温度敏感的瘦素壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤1)单甲氧基聚乙二醇溶液的配制称取单甲氧基聚乙二醇，溶于双蒸水，振荡搅拌器上持续震荡，使其彻底溶解，制成浓度为30%单甲氧基聚乙二醇溶液(w/v)，滤膜过滤，低温储存备用。2)壳聚糖溶液的配制使用醋酸配制壳聚糖溶液，搅拌2天后将获得的壳聚糖溶液高温高压消毒后，冷却至室温后使用。3)瘦素-胶原溶液的配制将胶原溶于氢氧化钠中，并调节PH值至7. 0-7. 4，再加入瘦素使其溶解。4)瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶的制备将三种溶液冰浴30min后， 吸取壳聚糖醋酸溶液到容器中，滴加瘦素-胶原溶液后，快速搅拌同时逐滴加入单甲氧基聚乙二醇溶液，并持续搅拌20min。获得的瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶系统中，瘦素的浓度为10_5-10-4M、壳聚糖质量浓度为3.0% _3.5%，单甲氧基聚乙二醇浓度为 3. 0% -3. 5%,0. 01% -0. 胶原蛋白。本发明所研制的瘦素凝胶给药系统与以往文献与专利文件更具有技术的精确性。 在壳聚糖和单甲氧基聚乙二醇混合系统中，2 %以下浓度的壳聚糖在生理温度下很难凝固， 而超过4. 0 %的浓度则难以溶解；本发明同时也确定了在重量比的3. 0 % -3. 5 %的壳聚糖下，温度敏感水凝胶系统中，单甲氧基聚乙二醇的精确浓度。本发明所述的瘦素凝胶给药系统，半衰期长，有利于瘦素发挥较为长期的效用。本发明还公开了瘦素凝胶给药系统的用途，包括关节腔注射瘦素凝胶给药系统以治疗骨质丢失与骨骼愈合。
图1瘦素的SDS-PAGE电泳图。其中泳道1为瘦素蛋白。图2不同浓度的壳聚糖和单甲氧基聚乙二醇组合的凝胶时间。1 :3. 5%壳聚糖和 4.0% ；2:3%壳聚糖和4.0% ；3 :3. 5%壳聚糖和3.0% ；4 :3. 0%壳聚糖和3.0%。图3瘦素在壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇水凝胶系统与在磷酸盐缓冲液在体外释放比较。实施例一瘦素凝胶缓释给药系统的制备实验材料壳聚糖(!Iomega，美国)、单甲氧基聚乙二醇(Sigma，美国)、瘦素(实验室自制)、 冰醋酸(北京化学试剂公司)、乙腈(北京化学试剂公司)、氢氧化钠(北京化学试剂公司)、 丙稀酰胺&甲叉双丙稀酰胺(Sigma，美国)、磷酸氢二钠(北京化学试剂公司)、磷酸二氢钠 (北京化学试剂公司)。实验方法1)瘦素的蛋白表达与纯化①取人的脂肪组织提取总RNA，反转录成cDNA，用设计的瘦素上下游引物 Sequnence NO. U Sequnence NO. 2扩增目的基因，得到了瘦素的全长基因，其序列为 Sequnence NO. 3。②将全合成的瘦素基因连接到表达载体上，并转化到表达菌里。③加入终浓度为0. ImM的IPTG诱导瘦素基因的表达。④将菌液裂解，经镍离子亲和柱纯化瘦素蛋白。2)瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统的制备①壳聚糖脱乙酰度的测定用元素分析仪测定，采用CHN S模式，分别测定材料用 CHN的元素含量，计算壳聚糖的脱乙酰度，结果显示其脱乙酰度为90%。②单甲氧基聚乙二醇溶液的配制称取单甲氧基聚乙二醇，溶于双蒸水，振荡搅拌器上持续震荡，使其彻底溶解，制成浓度为30%单甲氧基聚乙二醇溶液(w/v)，滤膜过滤， 低温储存备用。③壳聚糖溶液的配制使用醋酸配制壳聚糖溶液，搅拌2天后将获得的壳聚糖溶液高温高压消毒后，冷却至室温后使用。
④瘦素-胶原溶液的配制将胶原溶于氢氧化钠中，并调节pH值至7. 0-7. 4，再加入瘦素使其溶解。⑤瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶的制备将三种溶液冰浴30min后， 吸取壳聚糖醋酸溶液到容器中，滴加瘦素-胶原溶液后，快速搅拌同时逐滴加入单甲氧基聚乙二醇溶液，并持续搅拌20min。获得的瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶系统中，瘦素的浓度为10_5-10_4M、壳聚糖质量浓度为3.0% _3.5%，单甲氧基聚乙二醇浓度为 3. 0% -3. 5%,0. 01% -0. 胶原蛋白。⑥凝胶粘度测定将样品转移到盛样器中，4°C以及37°C水浴中恒温，分别采用10 与IOOrpm转速测量胶凝前后瘦素-壳聚糖_单甲氧基聚乙二醇水凝胶的粘度。3)瘦素给药凝胶系统体外释药实验将含瘦素(I(T5M)壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇给药缓释溶液在37°C恒温孵育箱胶凝后立即取出Iml分别置于透析袋(截留分子量5KD)中，放入小玻璃瓶内，在瓶中加入 ρΗ7· 4 的 PBS,于 37°C恒温振荡器中振摇(转速 IOOrpm)。在 5min, 15min，45min，120min, 300min,600min, 1440min分别将溶出液全部取出，补加37°C的PBS，高效液相色谱法测定制剂在各时间点的累积释放量。同样方式，将瘦素(IO-5M)在PBS溶液下进行高效液相色谱法测定在各时间点的累积释放量。在所有实验均在室内温度20士3°C条件下完成。流动相经过0. 45 μ m微孔滤膜真空负压过滤、超声排气。将析出的液体经0. 22 μ m滤膜过滤后依次进行HPLC检测，观察瘦素体外释药。SPSS统计软件进行分析，实验数据用χ士s表示，每组样本量η > 3。组间差异比较采用One-Way ANOVO分析LSD法，P < 0. 05认为差异具有显著性。结果与讨论1)瘦素蛋白的表达与纯化得到了纯度达90%的瘦素蛋白，满足了实验的要求，其纯化的电泳图见图1。2)得到了温度敏感性好，凝胶时间较短的壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统，其凝胶时间见图2。3)瘦素给药凝胶系统体外释药实验将含瘦素的壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇给药缓释溶液在37°C恒温孵育箱胶凝后透析得到的蛋白，用高效液相色谱法测定在各时间点的累积释放量，与相同浓度瘦素在PBS系统中透析释放的比较见图3。实施例二瘦素凝胶缓释给药系统应用(关节腔注射治疗骨丢失)实验材料24只10周龄SPF级饲养的雌性SD大鼠，超净工作台，注射器，手术刀，止血钳等手术器材，75%酒精，3%的戊巴比妥钠，上述含瘦素的缓释凝胶，瘦素蛋白，壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶。实验方法将M只10周龄的SPF级饲养的雌性SD大鼠，随即分成4组分别命名为A、B、C、 D，每组6只。所有大鼠均以3%的戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉，除D组行单纯开腹之外，其余3组均行双侧卵巢切除术，术后置大鼠于室温下分笼饲养，自由摄水。切除卵巢饲养修复3周后，实验组A 在大鼠关节腔内注射瘦素的壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶，其中瘦素的剂量为3. 5mg/kg，每周注射一次，一共3次。实验组B:只注射同等剂量溶于生理盐水的瘦素，其它条件同实验组A。实验组C 在大鼠关节腔注射同A组同剂量的壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶，不含瘦素蛋白。实验组D不做处理，作为对照。初步实验结果显示，实验组A大鼠的骨密度明显好于B、C两组。本发明明显降低蛋白质药物的分解速度，通过药物凝胶缓释系统改善蛋白质药物的半衰期，提高蛋白质药物的效力。本发明壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶缓释系统，具有温度敏感的良好特性。
权利要求
1.一种瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统，其特征在于，所述的给药系统含有浓度为10_5-10_%的瘦素、重量百分比3.0% -3. 5%的壳聚糖、3.0% -3. 5%单甲氧基聚乙二醇以及0.01% -0. 胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统，其制备方法包括以下过程1)单甲氧基聚乙二醇溶液的配制称取单甲氧基聚乙二醇，溶于双蒸水，振荡搅拌器上持续震荡，使其彻底溶解，制成浓度为30%单甲氧基聚乙二醇溶液(w/v)，滤膜过滤，低温储存备用。2)壳聚糖溶液的配制使用醋酸配制壳聚糖溶液，搅拌2天后将获得的壳聚糖溶液高温高压消毒后，冷却至室温后使用。3)瘦素-胶原溶液的配制将胶原溶于氢氧化钠中，并调节PH值至7.0-7. 4，再加入瘦素使其溶解。4)瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶的制备将三种溶液冰浴30min后，吸取壳聚糖醋酸溶液到容器中，滴加瘦素-胶原溶液后，快速搅拌同时逐滴加入单甲氧基聚乙二醇溶液，并持续搅拌20min。获得的瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶系统中，瘦素的浓度为10_5-10_%、壳聚糖质量浓度为3. 0% -3. 5 %，单甲氧基聚乙二醇浓度为3. 0% -3. 5%、 0.01% -0. 胶原蛋白。
3.根据权利要求1所述的瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统，其特征在于，所述的瘦素凝胶缓释给药系统可以作为局部注射药物，治疗骨丢失。
全文摘要
本发明公开了瘦素-壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇凝胶给药系统制备方法及其应用。所述的凝胶系统包含重量比3.5％壳聚糖、3.0％单甲氧基聚乙二醇及胶原蛋白。本发明所述的瘦素凝胶给药系统，温度敏感性好、制备条件温和，降低了瘦素的降解速率，可以应用于关节腔注射。
文档编号A61K9/00GK102198081SQ20111013035
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者吴志宏, 范彧, 邱贵兴 申请人:吴志宏