专利名称：可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗。
背景技术：
到目前为止，人们对细胞内寄生的病原体(病毒、细菌、寄生虫等)所引起的慢性传染病仍缺乏比较有效的治疗办法，疫苗预防效果也不理想。从理论上讲，这类慢性传染病需要宿主产生坚强的一类(Thl)抗感染免疫反应才能清除病原体，但如何诱导机体产生坚强的Thl抗感染免疫反应仍然是个难题。根据申请人长期的探索研究发现，这类慢性传染病的临床发病阶段大多数都表现为很强的二类( 抗感染免疫反应，即以Th2抗感染免疫反应为主；而亚临床感染则大多数都表现为很强的Thl抗感染免疫反应，即以Thl抗感染免疫反应为主。进一步的研究证明，一类和二类免疫反应的产生并不是同步发生的，相辅相成的形式，而是相互抑制的，此起彼伏的形式。IL-4是诱导产生Th2免疫反应的主要细胞因子，如果能降低宿主体内IL-4的含量，即可有效的抑制Th2免疫反应，从而促进Thl免疫反应的发生。实验证明，给宿主注射抗IL-4抗体即可达到此目的。但由于抗体的半衰期较短(IgG的半衰期约21- 天)，需要反复多次注射，不但提高了成本，而且易引起过敏反应。 急需一种成本低廉、且不会引起过敏反应的技术手段。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一类制备简单、成本低廉、且安全可靠的可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗。本发明是通过以下技术方案实现的可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗，是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段(多肽或寡肽，在做疫苗前需进一步与其它抗原大分子相偶联)做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或偶联蛋白疫苗；或以白介素-4的完整基因或基因片段做抗原基因或主要抗原基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗；或以任何载体克隆IL-4的完整基因或基因片段、以任何表达系统扩增基因所制的基因疫苗，或表达IL-4的完整蛋白或蛋白片段(多肽或寡肽)做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或融合蛋白疫苗；如果所选择的表达载体属于活载体，也可做成活载体基因工程疫苗。所述疫苗中可添加有医学上常规的疫苗佐剂。本发明的疫苗不但可用于治疗人或动物的慢性传染病和寄生虫病，还可进一步推广应用到癌症、某些类型的过敏反应等与免疫相关的疾病治疗中去。根据所制备的疫苗形式不同，本发明的疫苗的实施方式可有多种如铝胶佐剂、油佐剂、脂质体佐剂等疫苗，可采用皮下注射、皮内注射和肌肉注射等多种不同方式；如果是活载体疫苗，除了以上注射方式外，还可采用口服、吸入、滴鼻、滴眼等不同方式。本发明是针对现有技术中存在的缺陷“给宿主注射抗IL-4抗体，需要反复多次注射，不但提高了成本，而且易引起过敏反应”，而提出的技术方案，即采用IL-4疫苗的形式对宿主进行主动免疫治疗，一般，首次免疫即可达到约2 3个月的有效时间，二次免疫即可达到约半年的有效治疗时间，经过1 3次的免疫治疗，即可达到康复的目的。与直接应用抗IL-4抗体治疗相比，有应用次数少，用量低等特点，这样，不但大大降低了治疗成本，而且，大大降低了产生过敏反应的可能性。
图1 给实验BALB/c小鼠分别于诱导过敏反应前3周和1周皮下(s. c.)接种实施例ι所制备的(见下面实施例1) IL-4基因重组油佐剂疫苗，另设pET-32载体油佐剂疫苗和生理盐水免疫对照组。于第0周和第3周分别用低剂量(5μ g)鸡卵清白蛋白(OVA)铝胶疫苗腹腔接种，以致敏小鼠，于第5周用高剂量(80 μ g，溶解在50 μ 1 PBS中)OVA由鼻孔滴入，以诱导产生过敏反应。结果显示IL-4基因重组油佐剂疫苗免疫组与pET-32载体油佐剂疫苗组和生理盐水免疫对照组相比，IL-4基因重组油佐剂疫苗可显著降低OVA-IgE特异性抗体的产生。图2 给实验BALB/c小鼠分别于利什曼寄生虫接种前3周和1周腹腔(i. p.)接种实施例1所制备的(见下面实施例1) IL-4基因重组铝胶疫苗，另设pET-32载体铝胶疫苗和生理盐水免疫对照组。适量利什曼寄生虫皮下(s. c.)注射接种于小鼠后肢足垫。接种后每周用卡尺测量一次足垫处的病变大小，持续8 10周。结果表明，IL-4基因重组疫苗能够显著降低利什曼寄生虫的感染。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 小鼠IL-4基因重组疫苗的构建与疫苗制备根据小鼠IL-4的全基因编码序列，设计一对合适的引物，通过RT-PCR方法扩增 IL-4cDNA序列。然后，经过DNA序列测定，证明所扩增的cDNA序列准确无误后，再将其克隆至pET-32融合表达载体的适当部位，并进一步将重组质粒以及pET-32融合表达载体空白对照质粒转入适当表达用大肠杆菌菌株中，经过规模发酵，提取纯化IL-4融合蛋白以及载体对照所表达的硫氧还原蛋白。将纯化IL-4融合蛋白或载体对照所表达的硫氧还原蛋白与油佐剂或铝胶佐剂等按适当比例混合后根据纯化IL-4融合蛋白的含量不同，对油佐剂疫苗，可将油/蛋白水溶液的体积比控制在(1 1) (3 1)；对铝胶佐剂疫苗，可将铝胶/蛋白水溶液的体积比控制在(1 1) (1 5)；要求每头份疫苗中IL-4融合蛋白或载体对照硫氧还原蛋白的量约为15-20 μ g ；每头份疫苗的体积约为0. Iml ；或根据兽医药典操作规程制备，进一步勻浆乳化(按所用勻浆机的操作规程进行)制成实验用疫苗。所述油佐剂为由94% (V/V)矿物油(10号白油)、6% (V/V)的Span-80、2% (g/V) 硬脂酸铝加热溶解后形成的淡黄色油状液体；油佐剂为疫苗蛋白溶液与油佐剂经乳化而形成的粘稠的乳白色油包水型疫苗。一般采用注射接种，为现有技术中常用的产品，是目前在动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。
所述铝胶佐剂也为动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。实施例2 小鼠IL-4基因重组疫苗的安全性试验与过敏反应试验按实施例1的方法，将纯化IL-4融合蛋白或载体对照所表达的硫氧还原蛋白用生理盐水适当稀释后与油佐剂或铝胶佐剂按1 1的体积比混合制备成IL-4融合蛋白疫苗或载体对照硫氧还原蛋白疫苗。制备好的IL-4融合蛋白疫苗分低(0. 1ml，约1头份)、中 (0. 25ml，约2.5头份)、高(0. 5ml，约5头份)三个不同剂量组分别免疫BALB/c小鼠，另设 pET-32载体疫苗和生理盐水对照组，每组5只小鼠，皮下多点注射。间隔3周，分别进行第二次和第三次免疫注射。疫苗注射后分别观察小鼠有无不良反应、过敏、死亡等现象。结果表明小鼠接种疫苗后发育良好，精神状态和食欲均正常，接种部位有一过性肿胀、发热等不良反应，尤其在高剂量组表现更为明显。对于油佐剂苗，高剂量组小鼠，由于疫苗吸收较慢，有轻度肉芽肿反应。实施例3 小鼠IL-4基因重组疫苗增强抗肿瘤活性的试验按实施例1的方法，将纯化的IL-4融合蛋白或载体对照所表达的硫氧还原蛋白用生理盐水适当稀释后与铝胶佐剂按11的比例混合制备实验或对照疫苗。要求每头份疫苗中IL-4融合蛋白或载体对照硫氧还原蛋白的量约为15 20μ g ；每头份疫苗的体积约为0. Iml0给实验小鼠分别于肿瘤细胞攻击前3周和1周腹腔(i. p.)接种实施例1所制备的IL-4基因重组铝胶疫苗，另设pET-32载体铝胶疫苗和生理盐水免疫对照组。肿瘤接种后每隔3天检查一次肿瘤生长情况，实验60天结束。结果表明，IL-4基因重组疫苗能够显著降低肿瘤的发生率(见表1)。表1 小鼠IL-4基因重组疫苗增强抗肿瘤活性的试验结果(每组10只，数据为存
活率％ )
权利要求
1.可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗，其特征在于其是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或偶联蛋白疫苗。
2.可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗，其特征在于其是以白介素-4的完整基因或基因片段做抗原基因或主要抗原基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗。
3.可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗，其特征在于其是以任何载体克隆IL-4的完整基因或基因片段、以任何表达系统扩增基因所制的基因疫苗，或表达IL-4的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或融合蛋白疫苗。
4.根据权利要求1或2或3所述的可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4 治疗性疫苗，其特征在于所述疫苗中添加有医学上常规的疫苗佐剂。
全文摘要
本发明公开了一种可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗，其是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或偶联蛋白疫苗；或以白介素-4的完整基因或基因片段做抗原基因或主要抗原基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗。本发明采用IL-4疫苗的形式对宿主进行主动免疫治疗，一般，首次免疫即可达到约2～3个月的有效时间，二次免疫即可达到约半年的有效治疗时间，经过1～3次的免疫治疗，即可达到康复的目的。与直接应用抗IL-4抗体治疗相比，有应用次数少，用量低等特点，这样，不但大大降低了治疗成本，而且，大大降低了产生过敏反应的可能性。
文档编号A61P37/00GK102266551SQ201110174918
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者刘永庆 申请人:刘永庆