专利名称：大黄素在制备icc起搏电流激活剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大黄素的新的药用用途。
背景技术：
近些年来研究证实胃肠Cajal间质细胞(Interstitial cell of Cajal, ICC)是胃肠道运动的起搏细胞，可产生自发电节律，沿胃肠道传递形成慢波。ICC在胃肠运动的产生和调节起着重要的作用，同胃肠运动功能障碍密切相关。对ICC的深入认识是近几年来胃肠动力学研究的重要进展。慢波节律，又称基本电节律或起搏电位，不论肠肌收缩与否，都很有规律的发生。 近年来的形态学和电生理研究表明ICC不仅是胃肠道电活动的起搏者(pacemaker cell) 也是基本电节律的主要传播者，类似于心肌组织的起搏细胞，并可调制内在神经丛的神经信息传递。起源于ICC的慢波通过ICC网络及与之相连的平滑肌细胞传播，引起和调解胃肠道平滑肌的自发节律性收缩活动。通过体外ICC培养发现，ICC能产生自发性短暂的内向电流，使之保持电节律性活动。用膜片钳技术也记录到了有节律性、规则的慢波样去极波形，慢波样波宽度与波形均与肌条上记录的慢波相似。从培养的小肠ICC记录到了自发性电震荡，形成慢肌条上记录到的慢波。细胞培养电生理研究发现，ICC属兴奋型细胞，有自发性节律性电活动，而其静息膜电位为-80 -70mV，明显低于平滑肌细胞-10mv，比平滑肌细胞更容易被兴奋。ICC产生的起搏电流决定慢波的大小和频率。通过ICC慢波来控制胃肠道平滑肌位相性收缩的频率特性，也决定着推进性活动的传播方向和速度。所以ICC起搏电流是决定胃肠运动功能的重要因素。很多胃肠运动障碍疾病与ICC起搏电流异常密切相关。大黄素是通里攻下中药大黄的主要药效成分，化学结构式为1，3，8_三羟基-6-甲基蒽醌(l，3，8-tryhy-drOXy-6-methyl)，分子式为C15H1(105。现代医学研究证实，大黄素具有抑酶、抑菌、改善微循环、抗血栓和解除Oddi括约肌痉挛等作用。随着国内外学者对大黄素研究的深入又发现了大黄素一些新的靶点和药理作用，主要集中在大黄素可促进胃肠运动等方面。但确切的机理还不清楚。胃肠运动障碍性疾病是常见病、多发病，严重影响人类的生活质量。目前尚无满意的治疗方法。寻找有效治疗胃肠运动障碍疾病是当前消化病学领域重要课题。
发明内容
消化道ICC细胞是分布在胃肠道的神经末梢和平滑肌之间的一类特殊的间质细胞。它是胃肠道平滑肌慢波活动的起搏细胞。ICC细胞产生自发的、有节律的内向电流是胃肠平滑肌产生慢波的关键；它是肠神经系统控制胃肠平滑肌细胞运动的中介，推进电活动的传播，控制胃肠道的收缩活动。本申请的发明人在长期的中西医结合临床实践发现，通里攻下法代表中药大黄能有效地治疗急性腹膜炎所致MODS胃肠运动功能障碍。发明人进一步分离了大鼠小肠的ICC细胞，采用膜片钳技术观察了大黄药效成分大黄素对培养的小肠Cajal间质细胞膜电位的影响。结果显示大黄素使ICC起搏电流的振幅比对照增加了 50. 9% (P <0.05)，频率增加了 57. 3% (P < 0. 05)。说明大黄素对小肠Cajal间质细胞的起搏电流具有明显的激活作用。因此，本发明的目的即在于提供大黄素在制备ICC起搏电流激活剂中的应用。并进一步提供一种治疗胃肠运动功能障碍的靶向性更强的方法。
本发明附图1幅，即大黄素对大鼠小肠ICC起搏电流的影响，其中η = 8。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例(1)大鼠小肠Cajal间质细胞的分离和培养制备小肠ICC具体步骤如下取2 3周SPF级的Wistar乳鼠，雌雄不限，禁食12小时后，脱颈处死。在无菌条件下分离小肠组织，去除肠系膜，沿肠系膜纵行剖开，去除肠腔内容物，用含抗菌素的冷PBS涡旋振荡冲洗3 次，每次2分钟。在解剖显微镜下锐性刮除粘膜分离平滑肌层，冷PBS再次涡旋振荡冲洗3 次，每次2分钟。将肌条剪碎至1 2mm3后放入50ml锥形烧瓶加入20ml消化液((II型胶原酶lmg/ml、10% FBS DMEM-F12)，恒温摇晃孵箱37°C消化30min，吸管反复吹打^iin后吸取上清4°C保存，更换消化液吸管反复吹打3min，再次消化30min，消化结束后上清与组织吹打混合经200目细胞筛网过滤，收集滤液。1000r/min离心lOmin，弃上清。10mlDMEM_F12 重悬细胞加等体积Ficol 1400梯度密度液1500r/10min，取液面交界细胞层，加含20% FBS DMEM-F12 3ml重悬细胞，置培养瓶入37°C 5% CO2孵箱贴壁24h后换液，去除未贴壁细胞， 加;3mlSMGM培养液(含20% FBS、5ng/mlSCF)继续培养。每2 3天换液一次，观察细胞生长情况。(2)膜片钳全细胞记录实验采用常规膜片钳全细胞记录方法。微电极采用微电极拉制器(PP-830，Narishige group日本)双步拉制而成。尖端1 2um，填充电极液后电阻为 3 6ΜΩ。电极液成分如下(mmol/L) 1 IOCsCl，20TEA，0. 1EGTA, 5HEPES, 3Na2ATP, 3. BMgCl2 · 6H20,以Tris调节PH值为7. 30。取数滴细胞悬浮液接种到固定于倒置显微镜的载物台上的灌流槽，10 15分钟后细胞可沉降至底壁表面。等细胞附壁后，使用八通道灌流系统，用2ml/min的速度持续灌流生理盐水冲去细胞碎片和杂质。在镜下选取表面光滑，立体感强，呈巨大核，边界清楚，胞质无颗粒，核周胞浆少，有2 5个长分支突起，呈纺垂形或卫星形的细胞进行膜片钳全细胞记录。记录起搏电流的细胞外液成分如下(mmol/ L) :135NaCl,4. 5KC1,1OHEPES, IOCaCl2, 2. OMgCl2 · 6H20, IOGlucose,用 Tris 调节 PH 值为 7. 40。形成千兆封接后，用放大器内置方波刺激放大器产生一个5mV/40ms的脉冲作用于电极尖端。所得的数字信号经低通滤波(频率为5KHZ)后转换成电信号，由膜片钳负反馈放大器放大经电极和充满电极液的玻璃微电极导入细胞。产生的电信号经模/数转换器转换成数字信号由计算机软件PulseS. 6来进行数据分析后储存于硬盘中。(3)实验步骤控制电位(Holding potential, HP)_60mv，步长5mv，钳制时间(Clamp time，CT) 40ms，刺激频率5KHZ，引出起搏电流。同一细胞完成上述实验后，以大黄素(32ng/ml，溶于20%的胎牛血清中)灌流^iin后各重复实验一次。以控制电位(HP)为横坐标，I为纵坐标分别绘制电流-电压(I-V)曲线。大黄素(32ng/ml)对大鼠小肠ICC起搏电流的影响实验结果如附图1和表1所示， 在-60MV的全细胞记录模式下，大黄素(32ng/ml)对ICC的起搏电流有明显的激活作用，电流振幅比对照组(-275 士 53PA)增加50.9%, -410 士 79PA，频率比对照组(9 士 0. 63次/ 分钟)增加 57. 3%，为 14士0. 36 次 / 分钟(P < 0. 05，η = 8)表 权利要求
1.大黄素在制备ICC起搏电流激活剂中的应用。
全文摘要
本发明公开大黄素的新用途，即大黄素在制备ICC起搏电流激活剂中的应用。经研究证明，大黄素使ICC起搏电流的振幅比对照增加了50.9％(P＜0.05)，频率增加了57.3％(P＜0.05)。大黄素对小肠Cajal间质细胞的起搏电流具有明显的激活作用。可用于制备ICC起搏电流激活剂。
文档编号A61P1/00GK102406632SQ20111039521
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者周丽, 齐清会 申请人:大连医科大学附属第一医院