专利名称：测定ldh活性的超极化的乳酸盐造影剂的制作方法
测定LDH活性的超极化的乳酸盐造影剂本发明涉及新的超极化的成像剂和涉及可用于测定乳酸脱氢酶(LDH)活性的13C-MR检测方法。前期的研究已经证明，超极化的[I-13C]丙酮酸盐代谢可使用13C磁共振光谱成像(13C MR成像)在体内成像。例如W02006/011809公开包含13C丙酮酸盐的组合物和在13CMR成像中使用其的方法。在肿瘤中，检测丙酮酸盐和乳酸盐之间的超极化13C标记物的乳酸脱氢酶(LDH)-催化的流量，已经与肿瘤评级和对治疗的应答相关，参见如Albers，M. J.,等，超极化的13C乳酸盐、丙酮酸盐和丙氨酸前列腺癌检测和分级的非侵入性生物标志(Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers forprostate cancer detection and grading), Cancer Res 68, 8607-8615 (2008)。体内磁化传递检测和体外肿瘤细胞悬浮液的研究已经清楚明白地证明，丙酮酸盐和乳酸盐之间 的同位素交换，与净化学流量相对比，对观察到的丙酮酸盐和乳酸盐之间的超极化13C标记物的流量产生显著贡献。此与以下的长期存在的观测相一致，即LDH催化细胞中接近平衡的反应，和酶的机制是规则的三元(ordered ternary)复杂机制,其中辅酶NAD+和NADH分别在之前结合丙酮酸盐和乳酸盐。因此，LDH催化容易可逆的、伴随着NADH和NAD+的互换的丙酮酸盐和乳酸盐的互换，如流程I中所示，
0OH
1LDH I
COOHOOOH
丙W酸4乳酸盖
流程I:
丙酮酸盐是检测LDH-催化流量的卓越的超极化的底物，原因是其无毒性，此使极化易于达到高水平，该极化具有相对长的寿命且转运入细胞的过程快速。然而，丙酮酸盐具有许多重要的限制。虽然它是是内源性分子，但没有证据显示在相对高浓度用于超极化的13C体内成像实验时是有毒的，尽管如此，使用乳酸盐去检测LDH-催化的流量将仍然是更优选的，因为乳酸盐以比丙酮酸盐高得多的浓度自然存在，并且也更迅速地被转运进细胞。使用标记的丙酮酸盐检测LDH活性的再一个缺点是，酶受到用于超极化的13C成像实验的高浓度的丙酮酸盐的抑制。然而，应用乳酸盐的企图相当不成功，因为在丙酮酸盐中检测到非常少的标记物。此可能是由于组织中稳态丙酮酸盐浓度非常低，因此仅有一小池用于要交换的乳酸盐中的超极化的13C标记物。Simpson，R. J.，Brindlej K. Μ·，Brown, F. F.，Campbell, I. D. & FoxalljD. L.质子核磁共振(pmr)同位素_交换方法研究在完整细胞中脱氢酶的动力学特性(A pmrisotope-exchange method for studying the kinetic-properties of dehydrogenasesin intact-cells). Biochemical Journal 202， 573-579 (1982)矛口 Simpson， R. J.,Brindlej K. M.，Brown, F. F.，Campbell, I. D. & Foxallj D. L 乳酸盐-脱氢酶在纯化状态和在完整红细胞中的研究。仍/仙/7^7 202，581-587 (1982)均描述了丙酮酸盐和乳酸盐之间的同位素标记物的LDH-催化的交换。1H MRS用于这些实验中以检测人红细胞悬浮液中的甲基氘化的丙酮酸盐([3-2 ]丙酮酸盐)与质子化的乳酸盐的交换。在添加甲基氘化的丙酮酸盐和质子化的乳酸盐至红细胞悬浮液中后，有来自丙酮酸盐的甲基质子信号增加和来自乳酸盐的甲基质子信号的相应的减少，因为氘标记物在两种分子之间交换。随后不是通过检测丙酮酸盐和乳酸盐之间标记物交换，而是通过检测以它们的甲基标记(1H或2H)为特征的、两个不同的同位素标记的乳酸盐核素的C2位置之间氘标记物的交换，实施在具有[3-2 ]丙酮酸盐和质子化乳酸盐的1H MRS实验中LDH的丙酮酸盐抑制(Brindle，K. Μ.等，由人红细胞中乳酸脱氢酶表达的活性的1H NMR研究.Eur. J.Biochem. 158，299-305 (1986)。该实验使用自旋回波脉冲序列，τ = 1/2J，其中J是乳酸盐甲基和C2质子之间的1H-1H耦合常数(7.4 Hz)而τ是90和180°脉冲之间的延迟(68 ms)。在这些情况下，在得到的光谱中完全反转乳酸盐甲基共振。乳酸盐C2质子对氘(D)的交换去除质子耦联和甲基共振的相位调制，其现在假定为正相。从而，可在同核1H自旋回波实验中经由自旋-耦联的甲基质子的相位调制检测乳酸盐C2碳的质子化状态。例 如，如果将等摩尔的过氘化的和质子化的乳酸盐的混合物，加至含乳酸脱氢酶和NAD+的溶液中，则1H光谱将最初显示自质子化的乳酸盐的反转的甲基共振。在质子化的和氘化的乳酸盐核素之间的C2位置的氘标记物的LDH-催化的交换之后，在同位素平衡上将存在以下的乳酸盐核素的混合物[3- 2」HJ乳酸盐、[3-2 2」HJ乳酸盐、[3-1 2」Hj乳酸盐和[3」H3，2-1 ]乳酸盐。仅观察到甲基质子化的核素，且这些中的一半在C2位置将具有质子，从而将反转甲基共振，且一半将在C2位置具有氘，从而甲基共振将具有正相。这些甲基质子共振将增加给出无信号(有微小的氘位移，从而信号并未完全消除)。可用[3-1 2-2Hj乳酸盐和[3-2 2」HJ乳酸盐开始实施相同的实验。在这种情况下，观察到的乳酸盐甲基共振最初具有正相，由于C2氘核，且此在C2位置的标记物交换之后衰减至零。现在已经惊奇地发现，可实施采用超极化的[I-13C]乳酸盐的实验，其中监测组织中超极化的[1-13C，2-2Hj乳酸盐和内源性未标记的乳酸盐之间的2H标记物的交换。在本发明中，发明人提议使用超极化的[1_13C，2-2Hj乳酸盐或其他双重-标记的同位素异位体，以检测LDH活性，此处，在异核13CV1H自旋回波实验中，经由在Cl或在其他乳酸盐碳上的自旋-耦联的超极化的13C标记物的相位调制，检测乳酸盐C2碳的质子化状态。存在由升高的LDH所指示的紊乱，诸如多种类型的癌症。因此，存在对新的改良的、测定LDH活性，尤其是体内LDH活性的方法的需求。发明人在本文描述了一种造影剂和通过检测[1_13C，2- ]乳酸盐和内源性未标记的乳酸盐之间的氘标记物的LDH-催化的交换，而避免使用丙酮酸盐的使LDH活性成像的方法。已经发现，可将超极化的[13C，2H]乳酸盐用作经采用13C-MR检测在体内和体外测定LDH活性的试剂。流程2显示在C2位置具有氘标记物的乳酸盐是如何代谢为质子化的(未标出)乳酸盐的。所述Cl位置可为13C富集的，然后此位置被超极化。也可将13C标记物置于C2或C3位置，此处也将显示与C2质子的自旋-自旋耦联。乳酸盐甲基(C3)质子也可被氘交换，这样仅存在于Cl、C2或C3位置的C2质子和13C之间自旋-自旋耦联，
权利要求
1.通过13C-MR检测，采用包含超极化的[13C，2H]乳酸盐的成像介质测定LDH活性的方法，其中测定[13C，2H]乳酸盐和内源性未标记的乳酸盐之间的氘标记物的LDH-催化的交换。
2.依据权利要求I的方法，其中所述方法是体内测定人类或非-人类动物中的LDH活性的方法。
3.依据权利要求I的方法，其中所述方法是体外测定源于人类或非-人类的动物的细胞培养物、身体样本、离体组织或分离的器官中的LDH活性的方法。
4.依据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述信号用于产生LDH活性的绘图。
5.依据权利要求1-4中任一项的方法，其中[13C，2H]乳酸盐和内源性未标记的乳酸盐之间的氘标记物的LDH-催化的交换采用异核13CV1H自旋回波成像来监测。
6.依据权利要求1-4中任一项的方法，其中[13C，2H]乳酸盐和内源性未标记的乳酸盐之间的氘标记物的LDH-催化的交换采用异核双回波成像来监测。
7.依据权利要求1-6中任一项的方法，该方法在体内或体外实施，且其中所获得的信息 用于评估改变LDH活性的潜在药物的功效，该信息包括乳酸盐转运进细胞或内源性乳酸盐浓度，或 用于在正接受对患者的疾病治疗的患病的患者中评估对治疗的应答和/或确定治疗功效，或 用于鉴别处于发展成疾病风险的患者和/或为避免疾病发展而采取预防措施的候选者，或 用于疾病的早期检测，或 用于监测疾病的进展，或 用于确定疾病的严重程度，或 用于鉴别和评估与疾病相关的并发症。
8.包含[13C,2H]乳酸盐同位素异位体的MR成像介质。
9.依据权利要求8的MR成像介质，其中的[13C,2H]乳酸盐同位素异位体选自[I-13C,2」H]乳酸盐、[2-13C, 2」H]乳酸盐、[3-1 , 2- ]乳酸盐、[I-13C, 2，3_2H]乳酸盐、[2-1 ,2，3」H]乳酸盐和[3-1 , 2，3」H]乳酸盐。
10.依据权利要求8的MR成像介质，其中[13C,2H]乳酸盐同位素异位体的Cl、C2和C3位置中多于一个是13C标记的且其中C2位置或C2和C3位置是氣标记的。
11.依据权利要求8-10的任一项的MR成像介质，其中的同位素异位体是超极化的。
12.依据权利要求8-11的任一项的MR成像介质，其还包含三苯甲游基和任选的顺磁性金属离子。
13.依据权利要求12的MR成像介质，其中存在所述顺磁性金属离子并且是含Gd3+的顺磁性螯合物。
14.通过动态核极化获得的依据权利要求11-13的任一项的MR成像介质。
全文摘要
本发明涉及新的超极化的MR成像介质和涉及使用这样的介质用于测定乳酸脱氢酶(LDH)活性的13C-MR检测方法。造影剂含超极化的[13C,2H]乳酸盐。
文档编号A61K49/10GK102858377SQ201180022128
公开日2013年1月2日 申请日期2011年5月2日 优先权日2010年5月3日
发明者K.M.布林德尔, M.I.克图宁, B.W.C.肯尼迪 申请人:通用电气健康护理有限公司