专利名称：缀合的凝血因子VIIa的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种缀合形式的人凝血因子Vila。
背景技术：
凝血因子VII (本文中称作FVII)是一种分子量为53000道尔顿(Da)、被糖基化的维生素K依赖性的单链酶原，凝血因子VII含有12个天然的二硫键(O’Hara et al.，Proc.Nat’ IAcad. Sci.美国，84:5158-5162 (1987)))。蛋白质主要是在肝脏中产生。FVII参与外源性凝血级联反应(图I)。所述蛋白质由四个离散的结构域组成一个N-末端Y-羧基谷氨酸(Gla)结构域，两个类表皮生长因子(EGF)结构域和一个C-末端丝氨酸蛋白酶结构 域。当缺乏存在于血管内皮下膜中的FVII的辅因子组织因子(TF)时，血液循环中的酶原仅表现出很低的蛋白酶活性。血管损伤后，FVII以高亲和力与TF结合，并通过精氨酸152和异亮氨酸153之间肽键的特异性裂解，变成有活性的双链酶FVIIa。FVIIa轻链由N-末端Gla结构域和类EGF结构域构成，重链由丝氨酸蛋白酶结构域构成。重链和轻链通过半胱氨酸135和半胱氨酸262之间的单一二硫键连接在一起。一旦被活化，FVIIa会快速地催化FX转化为FXa并催化FIX转化为FIXa。然后，FXa与FVa形成一种复合物，以使凝血酶原裂解，这会产生少量的凝血酶(Aitken，M. G. EMA, 16:446-455 (2004))。这种凝血酶的产生会使血小板和血小板表面上的辅因子V，VIII和XI活化。这样的活化会导致凝血酶的大量形成，所述凝血酶的大量形成能够引起纤维蛋白聚合反应和止血栓塞的形成。诺和诺德公司已经研发出了人重组FVIIa并已将其商品化，其商品名为NovoSeven (活化形式的 ^tacog alfa，ATC 编码 B02BD08)。NovoSeven 被批准用于治疗血友病A或B患者的出血发作(bleeding episodes),所述患者分别能够产生FVIII或 IX 的抑制性抗体(Jurlander et al. , Seminars inThrombosis and Hemostasis, 27:373-383(2001) ; Roberts et al.，Blood, 15:3858-3864 (2004))。自 1996 年开始使用时起，已经证明这样的治疗是安全和有效的。然而，由于蛋白质在体内半衰期相对较短(2. 3小时；以批准的NovoSeven 为基础的概要，FDA的序列号为96-0597)，为了达到止血的目的，在一次出血发作过程中随着时间的推移，需要多次输入高剂量的产品(90iig kg—1)。所述产品较短的半衰期和达到理想的治疗效果所需要的高剂量阻碍了 NovoSeven 与抑制剂共同使用在预防性治疗血友病患者中的用途。因此，很明显需要开发一种半衰期更长的FVIIa分子，以便在药物动力学(PK)和药效动力学(PD)方面都有所改进。以前，人们就已经成功的将生物药品与生物相容性聚合物相缀合以用于提高产品的物理化学特性。通过缀合被改进的治疗性蛋白的特性包括PK、ro和免疫原性。化学基团与蛋白质的连接能够显著地增加蛋白质的循环半衰期(Jevsevar et al. , Biotechnol.J.，5:113-128(2010))。对于分子量低于肾小球过滤限制的分子种类来说，大分子量基团的缀合阻碍了产品的肾清除。而且，在药剂制品上附加化学基团能够通过空间位阻来阻碍受体介导的分子清除。已在许多市售的生物药品制品中使用的生物相容性聚合物的实例是聚乙二醇(本文中称作PEG)。将PEG分子共价附着到另一个分子的过程称作聚乙二醇化。迄今为止，有九种聚乙二醇化的制品已经获得FDA的上市许可，其中有四种是非常畅销的药品Peglntron (Schering-Plough)、Pegasys (Hoffman-La Roche)、Neulasta (Amgen)和Micera (Hoffman-LaRoche)。已经有许多不同的化学方法用于将蛋白治疗剂与活化的PEG分子相缀合。随机的聚乙二醇化已经成功地被用于通过蛋白质上的氨基将PEG基团与蛋白共价连接。这种连接位点通常是但不仅仅限于赖氨酸残基侧链上的e-氨基。这种随机的反应可能产生非常复杂的缀合物的混合物，其中的PEG部分附着位点和数目都不尽相同。即使在随机缀合反应后进行纯化，也还会存在位置异构体，而这些异构体均具有不同的物理化学性质和药物学性质。目前已经研发了多种位点特异性的聚乙二醇化技术，并且现在已经试图将这些技术用于生产成分更确定的生物药品。进行位点特异性聚乙二醇化所采取的方法包括靶标于N-末端、半胱氨酸、聚糖、二硫化物和聚组氨酸的聚乙二醇化。重组FVIIa的聚乙二醇化的现有技术在不同的专利和专利申请中均有记载 WO 98/32466文献提到FVII可以被聚乙二醇化，但是没有给出更多关于这方面的信息。US 2008/0200651提到在野生型FVII多肽上通过人为引入的半胱氨酸残基而缀合PEG分子，能够表现出延长的体内半衰期或者具有增强的活性。US 2008/0221032记载了 FVIIa-聚唾液酸缀合物，所得的分子具有显著延长的体内半衰期。US 2009/0176967教导可以使用酶在FVII多肽的C-末端引入特定的官能团，FVII多肽可以在该处与生物相容性聚合物如PEG偶联。US2009/0227504记载了 FVIIa (或类FVIIa分子)的制备，其中一个或多个天冬酰胺连接的和/或丝氨酸连接的低聚糖链被至少一个表现出改进的血清半衰期的聚合基团共价修饰。US 2010/0028939记载了如何采用半乳糖氧化酶修饰天然的糖蛋白，从而在聚糖末端产生具有反应活性的醛官能团。然后，所述具有反应活性的醛基可以用来将聚合部分与蛋白缀合，以产生具有改善的药理学的产品。US 2010/0056428提到通过聚合部分例如PEG的肟在糖蛋白的糖基位置进行衍生化，可以实现FVIIa药学动力学特性的改进。US 2010/0093934教导聚合基团与凝血因子的靶向缀合可以通过首先将凝血因子与单克隆抗体或抗体结合，在与活化的聚合物反应前，所述单克隆抗体或抗体对蛋白有亲和力。US 2010/0099616记载了如何制备缀合有少量(1-9个)水溶性聚合物的血液因子(包括FVIIa)。然而，作者并没有用实例说明通过这种方法制得的聚乙二醇化的FVIIa的药理学特性。另一种蛋白质聚乙二醇化的方法已由PolyTherics公司开发，并被称为TheraPEG ,其中，通过蛋白质中的一对半胱氨酸残基的还原型二硫键,PEG聚合物与目的蛋白相连接(W0 2005/007197)。这一技术已被用于制备无因子FIXa污染的经聚乙二醇化的因子 IX 变体(W0 2009/130602)。然而，对于使用同样的技术制备聚乙二醇化的FVIIa而言，则被认为是重要的或者非常规的。虽然在止血方面，血凝系统中的各种蛋白可能有共同的目标，但是它们发挥作用的机理不同，因此，断言TheraPEG 技术能够为改进所有凝血蛋白的半衰期和免疫原性提供显而易见的方法是不合理的。区别总结如下从活性角度来看，FVIIa与FIX存在某些关键的区别，这就意味着这种蛋白质和生物相容性聚合物的缀合并不是一个简单的步骤。。例如,FIX和FIXa参与内源性凝血级联反应,而FVIIa主要参与外源性级联反应。FIX在被活化后仅需要与它的辅因子FVIII结合而参与凝血级联反应。相反地，在组织因子(Tf)存在时，FVIIa仅仅是启动凝血，因此，对于在凝血中被活化的FVIIa而言，它必须有能力结合Tf，还需要有可用的活性位点来进行肽的裂解。使用TheraPEG 进行的FVIIa的理论上的聚乙二醇化被认为可能会影响蛋白质结合Tf的能力以及从空间上阻碍活性位点。在生物活性方面的其他不同点是FIXa具有内源性免疫原性，但FVIIa没有。·
FVIIa也可以通过直接与活化的血小板相互作用来启动凝血。这一特殊的过程并未被完全了解，但是可能涉及更多的受体位点结合。为了达到这一效果，FVIIa在原理上可能需要三个与它的靶标配体相互作用的位点，而这三个位点都有可能被聚乙二醇化破坏。因此，因子VIIa的聚乙二醇化具有一些独特且不同的困难，这与FIX有明显的不同。但是不管怎样，仍然需要一种改进的FVIIa分子，所述FVIIa分子含有以位点特异性方式与多肽缀合的生物相容性聚合物，以延长FVIIa的体内半衰期，同时，与未修饰的FVIIa或现有技术中已知的其他经修饰的FVIIa治疗剂相比，仍保留了功能性活性。已经发现，重组FVIIa的药理性质可以通过将FVIIa与一个或者多个生物相容性聚合物缀合而得到增强。增强的药理性质包括与未缀合的FVIIa相比，体内循环半衰期的延长。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合的生物相容性聚合物。生物相容性聚合物可选自由聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰胆碱(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯醇(polyoxyethylated polyol)、聚烯 IKpolyolefinic alcohol)、聚轻烧基丙烯酸甲酯(polyhydroxyalkylmethacrylate)、多糖、聚a _轻基酸、聚乙烯醇、聚磷腈(polyphosphosphasphazene)、聚N-丙烯酰吗啉、聚烯烃氧化物聚合物(polyalkyene oxidepolymers)、聚马来酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明质酸甲壳素(hyaluronic acid chitin)、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚轻基羧酸钠(polyhydroxy alkanoates)、聚氨基酸以及它们的组合组成的组中。所述生物相容性聚合物可以具有线性或分支状结构。在另一个实施方式中，所述生物相容性聚合物为蛋白质，选自但不限于由FVII、白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白(包括单克隆抗体)、抗体片段如单结构域抗体、\、VH、Fab、F(ab，)2、Fab’、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fe 以及它们的组合组成的组中。如果需要，每个FVIIa分子可以通过一个或多个半胱氨酸残基与一种或多种生物相容性聚合物缀合。游离的半胱氨酸残基是还原胱氨酸二硫键的产物。本发明的生物相容性聚合物可以通过一个或多个还原的半胱氨酸二硫键与FVIIa缀合。所述缀合可以是通过将FVIIa中形成二硫键的两个半胱氨酸残基的硫残基桥接的连接基团的方式。因而，二硫键可以是天然二硫键或者是重组引入的二硫键。当所述生物相容性聚合物为PEG分子时，它可以具有任何适当的分子量，例如5-100kDa, 10-500kDa。适当地为5_30kDa或者10_30kDa。某些适当的分子量包括10、20或者 30kDa。存在几种能够和FVIIa形成缀合物的不同类型的聚乙二醇聚合物。有包括单聚乙二醇链的线性PEG聚合物，也有分枝的或多臂的PEG聚合物。分枝的聚乙二醇包括2个以上通过统一的基团连接在一起的单独的线性PEG链。例如，两个PEG聚合物可以通过赖氨酸 残基连接在一起。一个线性PEG链与a-氨基连接，而另一个PEG链与￡-氨基连接。剩下的赖氨酸核心的羧基可用于与蛋白质共价连接。各种分子量的线性和分枝的聚乙二醇聚合物都是市售可得的。在本发明的一个方面，FVIIa-PEG缀合物包括一个或多个与FVIIa连接的线性聚乙二醇聚合物，其中每个PEG具有大约2kDa至大约IOOkDa的分子量。在本发明的另一个方面，FVIIa-PEG缀合物包括一个或多个与FVIIa连接的线性聚乙二醇聚合物，其中每个线性PEG具有大约5kDa至大约40kDa之间的分子量。在某些实施方式中，每个线性PEG具有大约IOkDa至大约30kDa之间的分子量。在某些实施方式中，每个线性PEG具有大约20kDa的分子量。在某些实施方式中，每个线性PEG具有大约小于IOkDa的分子量。在特定的实施方式中，其中FVIIa-PEG缀合物包括一个以上的与FVIIa连接的线性PEG聚合物，例如两个、三个、或多达八个的与FVIIa连接的线性PEG聚合物。在一些实施方式中，FVIIa-PEG缀合物包括多种线性PEG聚合物，其中每一线性PEG具有大约10-30kDa的分子量。本发明的FVIIa-PEG缀合物可疑包括一个或多个与FVIIa连接的分枝PEG聚合物，其中每个分枝PEG具有大约2kDa至大约IOOkDa的分子量。在本发明的另一个方面，FVIIa-PEG缀合物包括一个或多个与FVIIa连接的分枝聚乙二醇聚合物，其中每个分枝PEG具有大约5kDa至大约40kDa的分子量。在某些实施方式中，每个分枝PEG具有大约5kDa至大约30kDa的分子量。在某些实施方式中，每个分枝PEG具有大约20kDa的分子量。在某些实施方式中，每个分枝PEG具有大约小于IOkDa的分子量。在特定的实施方式中，其中FVIIa-PEG缀合物包括一个以上的与FVIIa连接的分枝PEG聚合物，例如两个、三个、或多达八个的与FVIIa连接的分枝PEG聚合物。在一些实施方式中，FVIIa-PEG缀合物包括多达八个的分枝PEG聚合物，其中每个分枝PEG具有大约10-30kDa的分子量。可以通过本领域已知的色谱方法纯化FVIIa-PEG缀合物，所述色谱方法包括但不限于离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、沉淀和膜分离法(membrane-basedseparations)。适当地，FVIIa缀合物的生物相容性聚合物部分可以与两个半胱氨酸残基结合，从而在FVIIa中形成二硫键。这样，含有PEG的连接物桥接了所述二硫键。WO 2005/007197、WO 2009/047500 和 WO 2010/010324 描述了这种缀合过程。在本发明的一个实施方式中，可以根据图2中所示的方案将生物相容性聚合物与FVIIa缀合。在图2中，显示了生物相容性聚合物和连接基团之间的基团R1，所述连接基团跨越(spanning) 了 FVIIa分子上二硫键的硫原子。Rl代表是取代基，所述取代基可以是直接的键(direct bond)、亚烷基(优选C1,亚烧基)或可任选取代的芳基或杂 芳基(heteroaryl groups);其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中适当的杂芳基包括吡唆、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；其中与聚合物的连接可为通过水解不稳定的键 的方式的连接或通过稳定的键的连接。在可任选取代的芳基或者杂芳基上存在的具体取代基包括例如选自-CN、-NO2,-C02R、-C0H、-CH20H、-COR、-OR、-0C0R、-OCO2R, -SR、-S0R、-SO2R, -NHC0R、-NRC0R、_NHC02R、-NR’ C02R、-NO、-NH0H、-NR’ OH、-C=N-NHCOR, -C=N-NRj COR、-N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R,卤素例如氟或氯、-C = CR、-C=CR2和13C=CHR中的一种或多种相同或不同的取代基，其中每个R或R’独立地代表氢原子或者烷基(优选C1J或者芳基(优选苯基)。特别优选地存在吸电子取代基。在一个实施方式中，Rl中可任选取代的芳基或杂芳基包括被酰胺基(NHCO)取代的芳基或杂芳基，所述酰胺基将Rl单元与生物相容性聚合物连接。因此，在FVIIa半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团可以含有3-碳桥。在一个实施方式中,在FVIIa半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团是(CH2) 2CHC(0)-。在本发明的一个实施方式中，生物相容性聚合物如上所述的进行缀合，其中包括与生物相容性聚合物相缀合的FVIIa的组合物具有以下结构
权利要求
1.一种生物相容性聚合物，该生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合。
2.根据权利要求I所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物通过一个或多个还原的半胱氨酸二硫键与FVIIa缀合。
3.根据权利要求2所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物通过连接基团与FVIIa缀合，所述连接基团桥接在所述FVIIa中形成二硫键的两个半胱氨酸残基的硫残基。
4.根据权利要求3所述的生物相容性聚合物，其中，所述连接基团通过基团R1和所述生物相容性聚合物缀合，R1是直接的键、C1,亚烷基、或者可任选取代的芳基或杂芳基。
5.根据权利要求4所述的生物相容性聚合物，其中，所述R1选自苯基、苯甲酰基、萘基、吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶或嘌呤。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的生物相容性聚合物，其中，在FVIIa的半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团含有3-碳桥。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的生物相容性聚合物，其中，在FVIIa的半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团是(CH2) 2CHC (O) _。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的生物相容性聚合物，所述生物相容性聚合物与FVIIa缀合，其中，缀合物具有如下结构
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物具有大约5-100kDa的分子量。
10.一种药物组合物，该药物组合物含有前述权利要求任意一项所述的生物相容性聚合物，所述生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，所述药物组合物还含有其他药物活性剂。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的药物组合物，所述药物组合物适于肠外给药。
14.根据权利要求10-13中任意一项所述的药物组合物，所述药物组合物适于皮内注射、皮下注射、肌肉注射以及静脉输注或骨内输注。
15.根据权利要求10-14中任意一项所述的药物组合物，所述药物组合物以药水、悬浮液或乳液的形式存在。
16.根据权利要求10-15中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIIa相t匕，FVIIa缀合物具有更长的半衰期。
17.根据权利要求10-16中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIIa相t匕，FVIIa缀合物具有更高的AUC。
18.根据权利要求10-17中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIIa相t匕，FVIIa缀合物具有更高的生物利用率。
19.根据权利要求10-17中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIIa相t匕，FVIIa缀合物具有更低的免疫原性。
20.一种治疗凝血病或创伤的方法，该方法包括用权利要求10-19中任意一项所述的药物组合物对有需要的患者进行给药。
21.根据权利要求20所述的治疗方法，其中，所述凝血病是血友病A或血友病B。
22.降低患有血友病A、血友病B或创伤的哺乳动物的关节积血、出血、胃肠道出血和经血过多的风险的方法，该方法包括用权利要求12-21中任意一项所述的含有FVIIa缀合物的药物组合物对有需要的患者进行给药。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述组合物通过皮下途径给药。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述组合物通过静脉途径给药。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，每一至十四天用所述组合物进行给药一次。
26.生物相容性聚合物在治疗以FVIIa功能丧失为特征的凝血病或治疗创伤中的用途，所述生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合。
27.—种制备以下生物相容性聚合物和FVIIa的缀合物的方法，
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述缀合反应物具有以下分子式，
全文摘要
本发明提供了一种生物相容性聚合物，该生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIIa缀合，适当地通过FVIIa中还原的二硫键间的连接基与FVIIa缀合，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有这种缀合形式的FVIIa。
文档编号A61K38/36GK102971013SQ201180021895
公开日2013年3月13日 申请日期2011年4月28日 优先权日2010年4月30日
发明者W·亨利 申请人:剑桥生物制药专利有限公司, 保利提瑞斯有限公司