专利名称：表达兔出血热病毒的vp60主要衣壳蛋白的副痘病毒的制作方法
表达兔出血热病毒的VP60主要衣壳蛋白的副痘病毒描述本发明涉及一种能够在兔中治疗和/或预防兔出血热病毒感染的治疗剂，即，一种重组副痘病毒，其特征在于由外来核酸表达来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。
背景技术：
兔出血热病毒(RHDV)是野兔和家兔(如欧洲野兔种(Oryctolagus cuniculus))中的一种高度接触性疾病，它首次在1984年于中华人民共和国报道。RHDV随后在1987年至1989年期间传播遍及欧洲。感染的成年兔通常在感染后48至72小时内死于坏死性肝炎和出血性综合征。群体中的发病率和死亡率可以高达90-100%。本疾病是商品兔生产中严重经济损失以及野兔中高死亡率的原因。遍及世界的商 品兔生产是一项重要产业,尤其在其中小规模兔养殖业良好建立的亚洲和中欧。RHDV的高度接触性和致命性质已经产生遍及许多国家的重大经济影响。在多个国家如新西兰和澳大利亚，额外的保护方面如兔子数量的控制已经导致理解和控制本疾病的明显国际性努力。许多实验室中的工作导致将RHD病毒基于衣壳形态、核酸类型和其他物理特征表征为一种杯状病毒。病毒粒子由无包膜的二十面体的直径35-40nm的衣壳组成，所述衣壳主要由60kDa主要多肽种类组成。该病毒由大约7. 4kb的正义单链RNA基因组编码并且组织为编码主要60kDa(VP60)衣壳蛋白、12kDa推定蛋白和3种非结构蛋白(包括RNA聚合酶和蛋白酶)的两个可读框。病毒衣壳因大约180拷贝的单个VP60蛋白的多聚化产生。已经做出许多努力以产生在兔群体中治疗和预防RHDV感染的疫苗，大部分所述疫苗依赖于VP60衣壳蛋白的施用。VP60衣壳蛋白已经在多种表达系统中产生，如酵母(Boga 等人，Journal of General Virology (1997)，78，2315-2318)、杆状病毒 / 细胞培养系统(Laurent 等人,Journal of Virology, 1994 年 10 月，6794-6798，Marin 等人，Virus Research 39 (1995) 119-128)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (0. Farnos等人，Antiviral Research 81(2009)25-36)。重组产生的VP60蛋白已经随后作为有效的疫苗应用。然而重组蛋白的生产伴随诸多难题，如形成结构上不规则的蛋白质聚集物、费时和复杂的蛋白质纯化系统，和难以产生足够质量和数量用于商业生产。还已经在马铃薯植物中产生重组VP60并且随后将其作为叶提取物中的疫苗应用(Castanon 等人，Journal of Virology, 1999 年 5 月，第 4452_4455 页)。虽然有效在接种的兔中产生针对VP60的抗体，但是从植物产生提取物与细胞培养物中产生病毒相比是比较慢的。必须培育、收获和加工转基因植物，因此使产量限于不适于商业应用的规模。类似地，豌豆衍生的重组VP60可以导致不良产率并因此限制商业应用(MikschofskyH等人，Plant Biotechnol J. 2009年8月；7(6) : 537-549)。相似的复杂情况在通过植物中的表达产生VP60抗原的相关尝试中是明显的。在胡萝卜中的表达导致相对于有效免疫而言不充分的表达水平(Mikschofsky, H.等人，2009，Journal of Agricultural Science147, 43-49, Mikschofsky, H.等人，2009，In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 45,740-749)。使用霍乱毒素B作为功能性佐剂的烟草植物表达也表明，除与植物表达系统中的生产相关的其他复杂性之外，VP60的表达水平是次最佳的(Mikschofsky, H.等人，2009，Plant Sci.doi : 10.1016/j.plantsci. 2009. 03. 010(Cholera toxin B as a functionaladjuvant intobacco plants (烟草植物中作为功能性佐剂的霍乱毒素B))。使用病毒作为RHDV疫苗为重组VP60蛋白的施用提供了一个有前景的替代。基于疫苗的痘苗病毒已经应用于RHDV(Bertagnoli等人，Vaccine,第14卷，第6期，第506-510页，1996)，虽然由痘苗病毒诱导的长期免疫可以导致再接种不成功或针对痘苗病毒编码的外来抗原的保护作用减弱。在目前，归咎于不能在细胞培养系统中培养RHDV (因此阻碍病毒疫苗生产)，现有疫苗涉及感染和处死动物，以便提取可以随后分离出RHDV的肝脏。这导致借助感染和处死而获得的灭活或死病毒疫苗，这是一项就动物保护和财务局限性而言行为具有明显缺点的行为。从感染动物获得的RHDV(在现有技术的疫苗中)随后在应用于接种之前灭活。与本发明的优选活的副痘-VP60病毒相比，这导致活性显著降低。在其制造期间还需要额外的 病毒灭活产物并且在应用之前经常需要额外的佐剂，以便增加接种后产生的免疫应答。副痘病毒(PPV)是痘病毒科(Poxviridae)的一个属，具有模式种PPV绵羊病毒(羊口疮病毒，0RFV)，它为用作疫苗载体提供几个潜在优点载体(Rziha等人，Journal ofBiotechnology 73 (1999) 235-242)。有利于ORFV疫苗载体的证据包括有限的宿主范围(绵羊和山羊)、其嗜性限于皮肤、无全身性感染、短期载体特异性保护性免疫和在感染部位出人意料强烈地刺激快速固有细胞免疫机制(Buttner，Μ.和H. J. Rziha. 2002. J. Vet. Med. BInfect. Dis. Vet. PublicHealth 49:7-16.)。已经成功地施用ORFV重组体作为针对多种病毒感染的疫苗，如针对猪中(Dory等人，Vaccine 24 (2006) 6256-6263，和 van Rooi j 等人，Vaccine 28(2010) 1808-1813)或小鼠中(Fischer 等人，Journal of Virology, 2003 年 9 月，第 9312-9323 页)的伪狂犬病毒以及针对大鼠中的博尔纳病毒(Henkel等人，J. ofVirology 2005，第314-325页)。然而ORFV未曾在兔中应用或用作针对RHDV的疫苗。尽管近来在针对RHDV的疫苗方面取得进展，但是仍迫切需要强用于控制野生兔群和商品兔群中RHDV感染的新方法。
发明内容
根据现有技术，作为本发明基础的技术问题是提供能够在兔中治疗和/或预防兔出血热病毒感染的有效治疗剂。这个问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。本发明因此涉及一种重组副痘病毒，其包含来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。羊口疮病毒提供有限的宿主范围(绵羊和山羊)和嗜性，并且因此是相对安全的病毒载体。在一个实施方案中，本发明副痘病毒的特征在于来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白由外来核酸序列表达。从重组副痘病毒表达的RHDV的VP60蛋白发挥作用以在治疗的动物中诱导抗原特异性免疫，这提供了免遭RHDV感染的有效保护。在一个实施方案中，本发明副痘病毒的特征在于副痘病毒是羊口疮病毒(ORFV)、优选地是ORFV株D1701，更优选地是D1701-V-VP60n。在一个实施方案中，本发明副痘病毒的特征在于外来核酸序列是整合至副痘病毒基因组中的DNA序列。在一个实施方案中，本发明副痘病毒的特征在于VP60主要衣壳蛋白由包含根据SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2的序列的DNA序列编码。在一个实施方案中，本发明副痘病毒的特征在于VP60主要衣壳蛋白包含根据SEQID No. 3的氨基酸序列。本发明的又一个方面涉及作为药物使用的如本文所述的副痘病毒。本发明的又一个方面涉及作为疫苗用于治疗性和/或预防性治疗受试者中的RHDV感染的如本文所述的副痘病毒。
本发明的又一个方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的副痘病毒、根据SEQID No. I或SEQ ID No. 2编码VP60蛋白的核酸分子和/或包含根据SEQ ID No. 3的序列的VP60蛋白、以及可药用载体。本发明的又一个方面涉及如本文所述的副痘病毒作为疫苗在治疗性和/或预防性治疗受试者中RHDV感染中的用途。本发明的又一个方面涉及包含如本文所述的副痘病毒的疫苗，因而副痘病毒优选地是活的。优选活的减毒病毒。在一个实施方案中，如本文所述的疫苗可以特征在于存在用于增强疫苗功能的额外药剂，如佐剂或免疫刺激剂。在又一个实施方案中，如本文所述的疫苗可以特征在于该疫苗是联合疫苗，包含用于额外疾病的疫苗-药剂。本发明的又一个方面涉及治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的方法，其特征在于将治疗有效量的本发明副痘病毒、本发明的药物组合物或如本文所述的疫苗施用至受试者。本发明的又一个方面涉及编码兔出血热病毒(RHDV)蛋白VP60的核酸分子，其包含根据SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2的序列。在一个实施方案中，编码VP60的核酸分子意图用于生产如本文所述的重组副痘病毒。本发明的又一个方面涉及兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白，其包含根据SEQ ID No. 3的序列ο本发明的又一个方面涉及编码VP60的核酸分子和/或VP60主要衣壳蛋白在制造用于治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的药物、优选疫苗中的用途。本发明的受试者是指兔。将“兔”理解为兔形目(Lagomorpha)兔科(I^poridae)中的哺乳动物。野生兔和家养兔是本发明的预期受试者。在分类为兔的这个科中存在8个不同属，包括欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)和棉尾兔(棉尾兔属(Sylvilagus)),除许多其他兔物种之外，还包括野兔。发明详述在一个方面，本发明涉及一种重组副痘病毒，其含有编码RHDV VP60主要衣壳蛋白的DNA序列。根据本发明，这种重组副痘病毒表达VP60基因的基因产物。将VP60的特定可读框插入副痘病毒载体中，并且使用所得到的重组病毒来免疫动物。VP60基因产物的表达在治疗动物中导致特异性指向VP60的免疫应答。因此，本发明的重组病毒可以用于免疫学组合物或疫苗中以提供诱导免疫应答的手段，所述的免疫应答可以是，但不需要是保护性的。所述免疫应答可以在其效果方面是治疗性或预防性的。VP60与副痘病毒的组合使含有VP60的病毒能够在细胞培养中产生，这是直至现在未成功地实现的事情。本发明因此能够在无需(如目前在现有技术中所实施那样)处死感染动物的情况下生产VP60-疫苗。本文所述的副痘病毒在Veix)细胞(猴肾细胞系)中有效增殖。VP60基因是在整合于副痘病毒基因组中的早期副痘病毒启动子控制下表达。VP60基因产物因此在细胞感染后由副痘病毒表达，从而VP60基因在宿主细胞中既转录又翻译。然而，这种表达不导致感染性病毒的产生。重组整合的基因产物在感染后的有效表达代表痘病毒的一般原理并且取决于活的疫苗。然而，考虑VP60蛋白在应用之前表达并且导致VP60抗原产生，本发明的重组病毒 可以作为活病毒或死病毒应用。宿主细胞中应答于VP60抗原的抗体产生在对应于施加活病毒或死病毒时。在一个优选实施方案中，将本发明的重组病毒作为活疫苗施加至受试者，此时VP60表达在感染后继续进行。本发明的一个明显和出乎意料的优点在于，用本发明病毒疫苗感染(治疗或接种)的受试者不产生病毒粒子，所述病毒粒子则不能从治疗的受试者释放。出于许多原因，这代表一个明显优点。首先，感染(接种)限于起初所治疗的那些受试者，而不造成失控的病毒增殖。这种病毒因此可以也不传播至其他宿主，这是一个潜在顾虑，即便副痘病毒的宿主范围有限。其次，因为这种病毒在本质上是重组的(基因修饰的)，所以一般公众和农业管理机关突出强调基因修饰产物不能够传播或被释放环境中。本发明的重组病毒疫苗不从感染的受试者中释放的事实因此代表本发明的一个令人惊讶和有利的方面，这不能根据现有技术预测到。本发明涉及作为用于重组VP60基因的载体的全部副痘病毒。在一个优选实施方案中，本发明副痘病毒的特征在于副痘病毒是羊口疮病毒(ORFV)、优选地是ORFV株D1701，更优选地是D1701-V-VP60n株。ORFV株D1701的衍生物也落入本发明的范围。D1701株代表最初从绵羊分离的高度减毒病毒。在连续细胞培养传代后，所得到无毒力D1701株成功地在开发活疫苗中使用(Mayr，A.等人，1981，Tbl. Vet. Med.B. 28，535-552)。D1701株已经进一步表征并且检验其作为疫苗载体的性能(Cottone，R.等人，1998，Virus Research 56, 53-67, Rziha, H. -J.等人，2000，Journal of Biotechnology83，137-145，ΕΡ0, 886，679B1)。在 Mayr 等人(1981)，Cottone 等人(1998)，Rziha 等人(2000)中和在EP O 886 679 BI中描述的毒株意图作为优选的副痘病毒载体用于如本文所述的VP60基因。这些毒株是高度减毒的、无致病性并且不能在兔中复制。本发明的重组副痘病毒的又一个优点是在治疗受试者期间出现的免疫刺激作用。副痘病毒增强这种免疫刺激作用，从而病毒载体本身充当VP-60应用的佐剂。副痘病毒与VP60基因的这种独特和创造性组合导致协同效应，因而副痘病毒的免疫刺激性能以协同方式与VP60抗原组合，这还诱导免疫应答(即抗原特异性免疫应答)，从而提供针对VP60抗原的强烈免疫应答。这种组合的因素最终导致有效疫苗的产生。直至现在，尝试施用多种形式的VP60的如现有技术中所述的方法从未引起足够免疫应答以便提供针对病毒的有效保护。然而，副痘病毒和VP60的独特组合为RHDV疫苗的迫切需求提供有效的解决方案。如已经在现有技术中显示，单独应用副痘病毒或VP60抗原没有特殊的作用。所述组合引起令人惊讶的有效性，因而独立的病毒和VP60 —起产生的效果大于它们作用的总和，从而产生针对RHDV提供持久保护的免疫应答。用于本发明的重组病毒或其表达产物、本发明组合物如免疫组合物、抗原组合物或疫苗组合物或治疗性组合物的施用方法可以通过肠胃外途径施用，如皮内、肌内或皮下施加方法。这种施用使全身性免疫应答或体液免疫应答或细胞介导免疫应答成为可能。本发明的疫苗也可以掺入动物饲料中，从而能够进行大群体的简单和有效免疫。优选的施加方法涉及皮下施加或肌内施加，优选地是通过注射。更一般地，本发明的VP60副痘病毒重组性、抗原性、免疫性或疫苗副痘病毒-VP60(D1701-V-VP60n)组合物或治疗性组合物可以根据药学或兽医领域技术人员熟知的标准技术制备。可以考虑此类因素如年龄、性别、重量、物种和具体受试者的状况以及施用途径，按照医学或兽医领域技术人员熟知的剂量并通过其熟知的技术施用治疗有效量的此类组 合物。这些组合物可以单独施用，或可以联合或随后连同组合物(例如，连同“其他”免疫性、抗原性或疫苗或治疗性组合物)一起施用，从而提供本发明的多价或“鸡尾酒式”或联合组合物和使用它们的方法。再次地，可以考虑此类因素如年龄、性别、重量、物种和具体受试者的状况以及施用途径来决定成分和施用方式(依次或共施用)以及剂量。本发明组合物的实例包括用于孔洞施用(例如，口服、经鼻、肛门的、阴道、经口(peroral)、胃内施用等)的液体制品，如混悬剂、糖衆剂或酏剂；和用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，注射施用)的制品，如无菌混悬剂或乳剂。在此类组合物中，重组副痘病毒可以与可药用的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。也可以冻干这些组合物。组合物可以含有辅助物质，如润湿或乳化剂、PH缓冲剂、佐剂、胶化或粘度增强添加物、防腐剂、矫味剂、色料等，这取决于施用途径和所需的制品。表I:本发明的序列
权利要求
1.重组副痘病毒，包含来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。
2.根据前述权利要求所述的副痘病毒，其特征在于，来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白由外来核酸序列表达。
3.根据权利要求I所述的副痘病毒，其特征在于，副痘病毒是羊口疮病毒(ORFV)，优选是 ORFV 株 D1701，更优选是 D1701-V-VP60n。
4.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒，其特征在于，外来核酸序列是整合至副痘病毒基因组中的DNA序列。
5.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒，其特征在于，VP60主要衣壳蛋白由包含根据SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2的序列的DNA序列编码。
6.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒，其特征在于，VP60主要衣壳蛋白包含根据SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒，用作药物。
8.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒，用作治疗性和/或预防性治疗受试者中RHDV感染的疫苗。
9.一种药物组合物，包含根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒、根据SEQ IDNo. I或SEQ ID No. 2编码VP60蛋白的核酸分子和/或包含根据SEQ ID No. 3的序列的VP60蛋白、以及可药用载体。
10.权利要求I至8中至少一项所述的副痘病毒，作为治疗性和/或预防性治疗受试者中RHDV感染的疫苗的用途。
11.一种疫苗，包含权利要求I至8中至少一项所述的副痘病毒，所述副痘病毒优选地是活的。
12.根据前述权利要求所述的疫苗，其特征在于，存在用于增强疫苗功能的添加剂，如佐剂或免疫刺激剂。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是联合疫苗，包含用于额外疾病的疫苗制剂。
14.治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的方法，其特征在于，将治疗有效量的权利要求I至8中至少一项所述的副痘病毒、权利要求9所述的药物组合物或权利要求11至13所述的疫苗施用至受试者。
15.核酸分子，其编码兔出血热病毒(RHDV)蛋白VP60，包含根据SEQIDNo. I或SEQ IDNo. 2的序列。
16.根据前述权利要求所述的核酸分子，用于产生权利要求I至8中任一项所述的重组副痘病毒。
17.兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白，其包含根据SEQID No. 3的序列。
18.权利要求15或16所述的核酸分子和/或权利要求17所述的VP60主要衣壳蛋白在制造用于治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的药物、优选疫苗中的用途。
全文摘要
本发明描述了一种能够在兔中治疗和/或预防兔出血热病毒感染的治疗剂，即，一种重组副痘病毒，其特征在于由外来核酸表达来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。
文档编号A61K39/12GK102892428SQ201180021601
公开日2013年1月23日 申请日期2011年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者阿希姆·日哈 申请人:里姆瑟药物股份公司